核酸诊断试剂的质控和评价
核酸检测试剂生产及质量控制
核酸检测试剂生产及质量控制核酸检测试剂是基于核酸扩增检测技术的体外诊断试剂，包括等温扩增、PCR，qPCR等。
之前写了一些诊断试剂的评价的内容（诊断试剂评价系列2-核酸检测方法（更正））。
现在有些实验室自己合成引物探针，生产qPCR诊断试剂，也有些试剂生产企业在问如何保证试剂生产过程的质量控制。
检测试剂的生产质控与诊断试剂的评价既有相同点，因为都是基于相同的评价指标；又有不同点，生产过程会关注原料、半成品、成品，诊断试剂评价只针对成品。
本章的很多内容基于《核酸检测试剂生产及质量控制技术指导原则》，但是这个原则缺乏可操作性，因此又进行了扩展和延伸，供大家参考。
一、原材料1、dNTP脱氧三磷酸核苷，核酸的组成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP 和dTTP。
应为HPLC纯、PCR级，无DNase和RNase污染。
-20℃保存。
2、引物由一定数量的核苷酸构成的特定序列，通常采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。
冻干粉，1800D以上。
序列正确。
纯度应达到电泳级（PAGE）或HPLC 级，不含杂带。
应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE 电泳结果或HPLC分析图谱。
应作HPLC分析和紫外光吸收分析。
以紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm的比值在1.6~2.0之间，可视为合格引物。
-20℃保存。
3、探针是指特定的带有示踪物（标记物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能与互补核酸序列退火杂交，用于特定核酸序列的探测。
通常采用DNA 合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化，在5-端标记荧光素报告基团或其他发光标记物，在3-端标记荧光素淬灭基团，并经HPLC或其他适宜方法纯化。
冻干粉，90D以上。
纯度应达到HPLC纯，不含杂带。
应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如HPLC分析图谱；应对探针的核酸序列及标记的荧光素或化学发光物进行核实，并作HPLC分析。
核酸检测质量评估指标
核酸检测质量评估指标
简介
核酸检测是一种常用的生物实验技术，用于检测样本中的特定
基因序列。
在确保检测结果准确可靠的前提下，评估核酸检测的质
量是非常重要的。
本文档将介绍一些常见的核酸检测质量评估指标。
1. 灵敏度
灵敏度是指核酸检测方法能够正确检测到的阳性样本的比例。
高灵敏度意味着检测技术能够准确地检测到低浓度的目标基因序列，而低灵敏度则可能导致错误的阴性结果。
2. 特异性
特异性是指核酸检测方法能够排除假阳性的能力。
高特异性意
味着检测方法不会错误地将阴性样本判定为阳性，从而减少了误诊
的可能性。
3. 准确性
准确性是指核酸检测结果与真实情况的一致性。
一个准确的核酸检测方法应当能够正确地判定样本中是否存在目标基因序列，避免误报或漏报。
4. 重现性
重现性是指在不同实验室、不同实验条件下，同一核酸检测方法得到的结果的一致性。
一个具有良好重现性的核酸检测方法能够在不同环境中稳定地产生相似的结果。
5. 可靠性
可靠性是指核酸检测方法的稳定性和持续性。
一个可靠的核酸检测方法应当在长期使用过程中保持其准确性和重现性。
6. 样本处理效率
样本处理效率是指核酸检测方法对不同样本类型的适应能力。
一个高效的核酸检测方法能够快速地处理各种类型的样本，提高工作效率。
结论
以上是一些常见的核酸检测质量评估指标，每个指标都在一定
程度上影响着核酸检测方法的准确性和可靠性。
在进行核酸检测时，需要根据具体情况选择合适的方法，并对其质量进行评估，以确保
检测结果的有效性和可信度。
新型冠状病毒核酸检测试剂盒产品的分析与评价
李达，杨忠，王军，等.新型冠状病毒核酸检测试剂盒产品的分析与评价「J］.76•医疗卫生装备,2020,41(12)：76-80,85.•学术论坛・新型冠状病毒核酸检测试剂盒产品的分析与评价李达打杨忠12,王军12,王会如2(1.北京市医疗器械检验所，北京101111；•医疗器械检验与安全性评价北京市重点实验室，北京101111)［摘要］详细介绍了10种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测试剂盒的特点和相关技术指标，从样本制备、检测靶点和阈值判断3个方面总结了不同生产厂家的SARS-CoV-2核酸检测试剂盒产品的设计差异和不足。
得出了检测限水平差异是此类产品重要的风险评估指标，提出了使用核酸评价物质衡量试剂盒产品检测限的必要性，以期为SARS-CoV-2核酸检测试剂盒产品的评价提供参考。
［关键词］SARS-CoV-2；荧光定量PCR法;核酸检测；检测靶点；产品评价［中国图书资料分类号］R318；R197.39［文献标志码］A［文章编号］1003-8868(2020)12-0076-06DOI：10.19745/j.1003-8868.2020280Analysis and evaluation of SARS-CoV-2nucleic acid testing reagent kitLI Da1,YANG Zhong12,WANG Jun12,WANG Hui-ru12*(1.Beijing Institute of Medical Testing,Beijing101111,China;2.Beijing Key Laboratory of Medical Device Testing andSafety Evaluation,Beijing101111,China)Abstract The characteristics and related technical specifications of10novel coronavirus(SARS-CoV-2)nucleic acid detection kits were introduced in detail,and the design differences and shortcomings of SARS-CoV-2nucleic acid detection kits from different manufacturers are summarized in terms of sample preparation,detection targets and threshold judgment.It was concluded that the difference in detection limit level was an important risk assessment index of these kits,and the necessity of using nucleic acid evaluation substances to measure the detection limit of the kits was proposed as a reference for the evaluation ofSARS-CoV-2nucleic acid test kits.［Chinese Medical Equipment Journal袁2020,41(12)：76-80袁85］Key words SARS-CoV-2;fluorescence quantitative PCR;nucleic acid detection;detection target;product evaluation0引言2020年1月，研究人员经过病毒分离并测序不明原因肺炎患者的样本发现了一种区别于中东呼吸综合征/middle east respiratory syndrome,MERS)和严重急性呼吸综合征/severe acute respiratory syndrome, SARS)的新型冠状病毒「1］。
核酸检测质控工作总结汇报
核酸检测质控工作总结汇报
近年来，随着新型冠状病毒疫情的持续蔓延，核酸检测成为了疫情防控的重要
手段之一。
作为核酸检测工作的关键环节，质控工作的重要性不言而喻。
为了确保检测结果的准确性和可靠性，我们对核酸检测质控工作进行了总结汇报。
首先，我们建立了严格的质控标准和流程。
在样本采集、提取、扩增和检测的
每个环节，我们都制定了详细的操作规范，并严格执行。
同时，我们还建立了质控样本库，定期对各环节的质控样本进行检测，以确保检测结果的准确性。
其次，我们加强了人员培训和考核。
针对不同岗位的工作人员，我们制定了相
应的培训计划，并定期进行培训和考核。
只有通过考核并取得相应资质的人员才能参与核酸检测工作，以确保操作的规范和准确性。
此外，我们还加强了设备和试剂的质量管理。
定期对实验室设备进行维护和保养，确保设备的正常运行；对试剂的采购、存储和使用进行严格管理，避免试剂失效或污染对检测结果产生影响。
最后，我们建立了完善的质控体系。
定期对实验室的运行情况进行检查和评估，发现问题及时进行整改；建立了质控档案，对每一批样本的检测结果进行记录和归档，以备查验。
通过以上的质控工作，我们确保了核酸检测结果的准确性和可靠性，为疫情防
控工作提供了有力的支持。
同时，我们也不断总结经验，不断优化质控工作流程，提高工作效率和质量，为今后的核酸检测工作提供更加坚实的保障。
乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂性能评价要点
乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂性能评价要点乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染是一个严重的公共卫生问题。
全球每年约有1【)()万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌(肝癌)，肝癌患者巾，75以上由HBV所致。
我国属HBV感染地方性流行区。
根据2006年全国乙型肝炎流行病学调查，我国现有的慢性HBV感染者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例，每年因HBV导致的肝硬化和肝癌死亡约3o余万例，新发乙型肝炎病例约50～1O0万例。
乙肝防治是当前及今后相当长时间内要面临的重要任务。
HBV是血源传播性疾病，主要经血(如不安全注射等)、母婴及性接触传播。
乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科(hepadnavdae)，基因组长约3．2kb，为部分双链环状DNA。
急性乙型肝炎病毒感染HBVDNA 存在先阳性后消失的发展过程，慢性乙型肝炎病毒感染的自然史一般可分为4个期，即免疫耐受期、免疫清除期、非活动或低(非)复制期和再活动期，其中免疫耐受期HBVDNA滴度较高(3v于20000IU·mU)，免疫清除期表现为血清HBVDNA滴度大于2000IU·mL，但一般低于免疫耐受期。
非活动或低(非)复制期可表现为HBVDNA持续低于最低检测限。
部分再活动期患者表现为HBVDNA活动性复制。
但并不是所有HBV感染者都经历以上四期]。
HBV已发现有9个基因型(A～I)，每个基因型又可分为不同亚型，且存在基因型之间的重组现象。
我国已发现A、B、C、D基因型，中东部地区以B、c基因型占优势，其中北方地区(长江以北)主要为C2亚型；南方大部分地区流行株为B2、C2、C1亚型，并有少部分D基因型；西部地区尤其是新疆地区以D基因型为主，西部藏族居民中以C／D重组基因型为主lA型和B1亚型罕见乙型肝炎的实验室检查包括生物化学检测(如血清ALT和AST、血清胆红素、胆碱酯酶等)、HBV血清学检测(乙肝五项)以及HBVDNA、基因型和突变检测。
怪不得实验总是做不好，原来是忽略了核酸质控！
怪不得实验总是做不好，原来是忽略了核酸质控！小翊一个正在读研的师弟最近因为实验进度的滞后被老板催的厉害，所以在聊天的时候很苦恼：为什么我的qPCR实验怎么老是做不好？昨天的文库产量还是那么低…….其实大多时候实验结果不佳的原因往往不在于实验试剂，也不在于实验操作，而在于一个简单却又易被忽视的问题：核酸样本质控。
核酸质控是什么？核酸质控，顾名思义就是对核酸样本进行质量控制。
主要是评估核酸的完整性、浓度及纯度。
核酸质控对实验有什么影响？核酸样本涉及的下游实验很多，质控不合格会影响实验结果的准确性，甚至得到错误的研究结论。
1）DNA样本质控不合格影响文库产量以及文库丰度对于DNA测序来说，样本质控不合格最直观的呈现就是文库产量低。
而低数量（浓度）、低质量样本均会影响最终文库的丰度（图1）。
文库丰度越高，代表文库承载的样本原始信息越多，最终目标区域会获得更有效的测序数据覆盖[1]。
图1 DNA质量对于文库丰度的影响A. 足够数量的高质量DNA分子能够产生高丰度的文库，很好的呈现起始样本信息；B. 低数量、高质量的DNA分子产生低丰度的文库，不能够完全代表起始样本；C. 质量较差的DNA样本则会产生低丰度的文库，因为已经损伤的DNA无法被构建文库；D. 某些情况下，低质量的样本可以通过增加起始投入量来适度弥补文库丰度[1]。
小贴士文库构建所需样本量与试剂盒的性能有关，微量高效建库试剂盒如翊圣Ultima建库试剂盒起始量低至500 pg亦可高效建库。
即使低质量样本如FFPE，微量样本如cfDNA均可获得优异的文库。
2）RNA样本质控不合格影响qPCR定量的准确性研究表明RNA样本的RIN值与qPCR实验的Ct值相关，RIN值越高（代表质量越好），则CT值越低[2]（图2）。
图 2. RNA的RIN值与Ct值的关系。
RIN：RNA Integrity Number，原理同DIN值小贴士qPCR实验建议用于逆转录的RNA样本RIN值>7。
完整版核酸检测试剂生产及质量控制技术指导原则
附件3:体外诊断试剂生产及质量限制技术指导原那么--核酸检测试剂生产及质量限制技术指导原那么核酸扩增检测技术泛指以扩增DNA或RNA为手段,从而筛查特定基因的检测技术,如聚合酶链反响〔PCR、连接酶链反响〔LCR、转录依赖的扩增反响〔TMA〕等.核酸检测试剂是基于核酸扩增检测技术的体外诊断试剂,目前已经用于病原体检测、特定疾病的早期诊断和体内物质的型别鉴定等不同领域.为标准核酸检测试剂的生产及质量限制,特制定本技术指导原那么.国家药品监督治理部门将依据科学技术开展的需要,适时组织修订.一、根本要求〔一〕核酸类检测试剂生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准,并应符合有关法规的要求.〔二〕核酸类检测试剂的生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境〔实验室应当严格分区,人员和物品应当单向流动,以最大限度地预防实验过程中样品之间的污染和预防扩增产物的污染〕,获得?医疗器械生产许可证?；同时,应根据?体外诊断试剂生产实施细那么〔试行〕?的要求建立相应的质量治理体系, 形成文件和记录,加以实施并保持有效运行；还应通过?体外诊断试剂生产企业质量治理体系考核评定标准〔试行〕?的考核.企业应对试剂的使用范围作出明确规定,并经国家药品治理部门批准.〔三〕核酸类检测试剂在研制时,应当遵循科学、标准的原那么, 引物设计应当符合核酸检测设计的要求,扩增体系应设定合理的内标和外标,试剂须设置抗污染的特定举措,扩增产物须进行确证研究.〔四〕核酸类检测试剂生产过程中所用的各种材料及工艺,应充分考虑可能涉及的平安性方面的事宜.〔五〕生产和质量限制的总体目标：保证试剂使用平安、质量稳定、工艺可控、检测有效.二、原材料应提供主要原材料如引物、探针、企业参考品或标准品等的选择与来源、制备过程、质量分析和质量标准等的相关研究资料.如果主要原材料来自市场〔从其他单位购置〕,应提供的资料包括：对物料供应商审核的相关资料、购置合同、供货方提供的质量标准、出厂检验报告,以及该原材料到货后的质量检验资料.如果主要原材料〔包括工艺〕或其供应商有变更,应依据国家相关法规的要求进行变更申请.核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无DNase和RNase污染.1.dNTPs脱氧三磷酸核甘,核酸的组成成分,包括：dATR dUTR dGTR dCT可口dTTR 应为HPLCM、PC颜,无DNase和RNasW亏染.-20 C 保存.2.引物由一定数量的核甘酸构成的特定序列,通常采用DNA合成仪人工合成,合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化冻干粉,合成量不低于试剂盒总测试样品所需量.序列正确.纯度应到达电泳级〔PAGE或HPLCS,不含杂带.应提供合成机构出具的合成产物的质检证实,如PAG曲泳结果或HPLC分析图谱.应作HPLC分析和紫外光吸收分析.以紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm的比值在1.6 2.0之间,可视为合格引物.-20 C 保存.3.探针是指特定的带有示踪物〔标记物〕的核酸片段〔寡聚核甘酸片段〕,能与互补核酸序列退火杂交,用于特定核酸序列的探测.通常采用DNA合成仪人工合成,合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化,在5'-端标记荧光素报告基团或其他发光标记物,在3'-端标记荧光素淬灭基团,并经HPLCK其他适宜方法纯化.冻干粉,90D以上.纯度应到达HPLC纯,不含杂带.应提供合成机构出具的合成产物的质检证实,如HPLC分析图谱；应对探针的核酸序列及标记的荧光素或化学发光物进行核实,并作HPLC分析.应以可见一紫外分光光度计进行200 800nm扫描,在260nm处应有吸收峰.另外,根据标记的荧光素的不同,还应该在荧光素的激发波长处有吸收峰,如FAM荧光素在494nm、TET荧光素在521nm、TAMRA 荧光素在560nm 处有特异的吸收峰,杂交探针在493nm、625nm、685nm处有特异的吸收峰,检验合格后入库.避光、-20C保存.4.Taq DN课合酶具有DNA聚合酶活性,无核酸内切酶活性；具热稳定性,94C保温1小时后仍保持50%活性.-20 C保存.5.UNG 〔尿喀咤糖基化酶〕具有尿喀咤糖基化酶活性,无核酸外切酶及核酸内切酶活性,IU UNG在37c处理3分钟后,103拷贝以下含U模版应完全降解,不能产生扩增产物.-20 C保存.6.RT-PCfB 〔反转录扩增酶〕具逆转录酶活性和DNA聚合酶活性,无核酸内切酶活性；具热稳定性,94 C 1小时后仍保持50%舌性,-20C保存.三、生产工艺核酸类检测试剂的根本生产工艺通常包括：配制工作液、半成品检验、分装和包装.配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求, 原材料应混合均匀,配制过程应对pH、电导率等关键参数进行有效限制.工艺研究的资料应能对反响体系涉及到的根本内容如样本类型、样本用量、试剂用量、反响条件、校准方法、质控方法、临界值确实定、稳定性和有效期,提供确切的依据.四、质量限制〔一〕半成品质量限制1.按批号抽取规定数量的半成品.2.以参考品/对照品进行半成品质量限制.如果产品具有国家标准品或参考品,应以其进行检验.如果产品不具有国家标准品或参考品,应根据规定制备相应的企业参考品进行半成品检验,企业参考品的质量标准不能低于国家药品监督治理部门已经批准的同类试剂的质量标准.3.半成品检验内容包括：参考品符合率、灵敏度、特异性、精密度.结果应符合质量标准的要求.4.半成品检验合格后,按试剂盒组成及时进行分装和包装.〔二〕成品质量限制1.每一批核酸类检测试剂报批批量至少为5000人份.2.产品完成包装后,应根据生产量进行抽样和生产记录审核.3.以参考品/对照品或参考品进行成品质量检验.结果应符合要求.4.成品检验的内容应包括：参考品符合率、灵敏度、特异性、精密度、线性和稳定性.5.稳定性试验每批试剂批放行前,必须完成稳定性试验,并到达相应的质量标准.稳定性试验可在在特定温度或特定条件下完成.。
罗氏核酸检测系统的质量控制
罗氏核酸检测系统的质量控制罗氏核酸检测系统是一种常用的检测新冠病毒的方法，有效地帮助医务人员快速准确地诊断感染者。
为了保证检测结果的准确性和一致性，质量控制是非常重要的一环。
质量控制是指在标准化的实验室操作和使用过程中，通过加入已知含量的核酸样本，检测和评估检测过程的准确性、敏感性和特异性。
它可以衡量实验的稳定性、准确性和可重复性，并帮助排查潜在的误差来源。
下面我们将具体介绍罗氏核酸检测系统的质量控制的几个方面。
1. 内控质量控制：内控是指在核酸检测中加入的一种人工合成的DNA序列，用于评估实验操作过程中有无外源性污染或试剂退化等因素。
在罗氏核酸检测系统中，内控一般是指人类全长基因组DNA片段。
通过监测内控的扩增情况，可以确定样本处理过程中污染的可能，及时采取措施消除错误结果。
2. 外部质量控制：外部质量控制是指将已知含量的核酸样本，由独立的实验室进行检测，并与罗氏核酸检测系统的结果进行比对和评估。
通过参与外部质量控制，可以评估罗氏核酸检测系统在不同实验室之间的一致性和可比性，并指导实验室进行质量改进和技能培训。
3. 质量控制样品的制备：质量控制样品制备过程中需要严格控制实验条件和操作流程，确保每个批次的质量控制样品的一致性。
这包括样品的制备浓度、配液过程中的精确度、反应体系的一致性等。
制备过程中还应考虑可能的样品降解、污染等因素，并根据实际需要进行相关的修正和验证。
4. 质控结果的统计分析：对质量控制样本的检测结果进行统计学分析，包括计算平均值、标准差和变异系数等指标，通过这些指标可以评估检测结果的准确性和稳定性，并及时采取纠正措施。
还可以根据不同的样本类型和检测序列，建立相应的质量控制参考值，以指导实验过程和结果解读。
质量控制在任何检测系统中都是非常重要的一步，在罗氏核酸检测系统中也不例外。
它可以确保实验的稳定性和可靠性，减少误差，提高检测结果的准确性和一致性。
只有通过不断改进和加强质量控制，才能更好地发挥罗氏核酸检测系统的作用，为新冠病毒的防控提供可靠的支持。
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1.在某一样品中加上已知量的检测物重复检测， 计算检测值与预期值的偏差
2.检测已知量的参考品，计算检测量与标化量 的偏差
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核酸诊断试剂的质控和评价
定量范围
➢定义：能够给出准确量值的范围
➢建立的方法：主要对系列稀释样品的反复检测
制定的
➢定量曲线：线性或非线性
➢要求：对定量范围的上限和下限样品进行检测
核酸诊断试剂的质控和评价
•Frequency
值的计算以及意义
•cut-off •delta = d / SD
•• d -
•X
d+
•X
•OD/CO data must be
transformed to log10 values before the analysis
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•0
•log10
时，其精确性仍能符合要求
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核酸诊断试剂的质控和评价
重复性（Reproducibility）
➢不同实验次数之间（Run-run） ➢不同实验室之间（Site-site） ➢不同实验人员之间（Operator-operator） ➢不同时间之间（Day-day） ➢特殊情况下的重复性
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核酸诊断试剂的质控和评价
临床研究的意义以及目的
➢临床前样品虽有代表性，但数量毕竟有
限并不能完全代表临床情况
➢通过临床试验对临床前制定的各项指标
进行修正
➢可以发现或预测在实际应用中遇到的问
题，在说明书中提醒用户注意
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核酸诊断试剂的质控和评价
临床研究的基本要求
➢伦理考虑
➢ 阴性预期值 (NPV)：若样品没有反应，则不含检测
物的可能性
➢ 阳性预期值 (PPV)：若样品有反应，则含检测物体
的可能性
➢ 重复性（Reproducibility） ➢ 准确性（Accuracy) ➢ 精确性 (Precision）
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核酸诊断试剂的质控和评价
灵敏度
➢定义：试剂的检测限度
•100
核酸诊断试剂的质控和评价
企业
金豪 万泰 GBI 耀华 科华 丽珠 华美 新创 普生 绿科 中山 理利 Murex 梅里埃
特异性与值关系的分析
假阳性
特异性（%）
值
3
99.70
-3.985
2
99.80
-3.688
5
99.49
-3.423
1
99.90
-3.364
0
100
-3.687
3
99.70
-2.741
➢方法：检测一定数量的阴性样品，计算均值和标准差
均值和标准差，临界值等于均值加上2个标准差
➢意义：在临界值以上的样品有95%为真阳性
➢
➢临界值的评估：检测一系列正常人群、非正常人群
和特殊人群对临界值进行核对
➢表示方法：以量值表示（如ng，单位，CFU/ml，
PFU/ml，拷贝数等）；以稀释度表示
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2
99.80
-4.337
7
99.29
-3.636
15
98.48
-2.261
1
99.90
-3.060
8
99.19
-2.778
22
97.77
-1.774
11
98.88
-3.551
4
99.59
-4.311
•样品库有985份样品。特异性与其“δ”值相关性系数为0.691,具有显著的
PPT文档演模统板 计学意义(P=0.004）
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核酸诊断试剂的质控和评价
临床样品的选择
➢人群: 根据试剂的适应症选择不同的人群 ➢样品: 应为自然人群，尚未用同类试剂进行筛
查过
➢选择不同地区: 代表被测物的不同流行率，代
表被测物的不同基因型或血清型
➢疾病的时期: ➢样品的数量:
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核酸诊断试剂的质控和评价
检测方法
➢盲法平行检测
析其一致性，通常以变异系数或相对标 准误来表示
➢样品的要求：最好应含有高、中、低三
类
➢每一类样品至少检测4次，实际上检测10
次或10次以上
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核酸诊断试剂的质控和评价
准确性（accuracy)
➢主要评价试剂的系统误差，反映样品的
检测值和真实值的一致性
➢表示方法：
偏差（%）=（检测值-真实值）X100/真实值
台面、设备以及通风设施上等造成污染
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核酸诊断试剂的质控和评价
污染的处理
➢酶的灭活（UNG） 主要用于灭活产物 ➢光化学处理 用可溶性psoralen的衍生物处理，
在用长紫外照射 即可灭活产物、也可减少样品的 污染
➢化学处理方法 用于表面的处理
✓ 10%次氯酸钠 ✓ 紫外照射
➢物理的: 专用移液器、一次性试管架、紫外灯、 PCR工作罩、滤芯吸嘴。
核酸诊断试剂的质控和评价
影响灵敏度的因素
➢特殊疾病
有一些特殊的病人，其代谢异常可能影响标志物 的检测
➢干扰物质或抑制物质
可以来自与病人（药物）；也可来自于样品的处 理过程（反复冻融，溶血等）；或样品本身存在抑制 物等
➢样品基因型和血清型的影响
有些被测物存在多种基因型或血清型，若原材料 没有广谱性，则可影响灵敏度
2020/11/19
核酸诊断试剂的质控和评价
与辅助因子特异结合的物质均抑制反应
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核酸诊断试剂的质控和评价
核酸扩增常见的抑制物
➢血红素及其代谢物影响DNA聚合酶的反应，不
同来源的DNA聚合酶受影响程度不同
➢痰中的酸性多聚糖或糖蛋白均影响DNA聚合酶
的反应
➢脑脊液和尿中可能含有抑制物，但具体物质不
明确
➢粪便中的胆汁盐是PCR反应的强抑制剂 ➢肝素可与DNA聚合酶结合，对不同的酶抑制程
✓ 一般样品 ✓ 特殊样品
➢对研究对象保密 ➢临床前研究结果
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核酸诊断试剂的质控和评价
对临床研究单位以及人员的要求
➢从事相应的工作 ➢具有相应的技术人员 ➢有相应的仪器设备
如果试剂对仪器无特殊要求，则应选择不同 品牌或不同型号
➢有不同专业人员参加 ➢至少两家省级单位
➢对实施实验单位的能力进行评价
核酸诊断试剂的质Biblioteka 和评价数值的计算+ 检测结果
--
样品的实际状态
+
--
A
B
A+B
C
D
C+D
A+C B+D
•灵敏度= A/（A+C);特异性=D/（B+D）
•阳性预期值:1)简单的计算方法即：PPV=A/（A+B） 可以给出一个大约的数值;
•
2)精确的计算方法即：PPV= 流行率×敏感性/｛流行率×敏感性+（1-
流
•
行率）×（1-特异性)｝
•阴性预期值:1)．简单的计算方法即：NPV=D/（C+D） 可以给出一个大约的数值
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2)．精确的计算方法即：NPV=(1- 流行率）×特异性/｛（1-流行率）
核酸诊断试剂的质控和评价
精确性(Precision)
➢作用：评价试剂的随机误差 ➢通过重复检测某一或某些特定样品并分
核酸诊断试剂的质控和 评价
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2020/11/19
核酸诊断试剂的质控和评价
体外诊断试剂的种类
➢化学或生化检测试剂 ➢免疫学检测试剂
✓ 抗原检测 ✓ 抗体检测
➢核酸检测试剂
✓ 核酸杂交技术 ✓ 核酸扩增技术
➢其他试剂
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核酸诊断试剂的质控和评价
核酸扩增技术
➢目的片段的扩增
✓ 聚合酶链反应（PCR） ✓ 以转录为基础的扩增技术（TAS） ✓ 链取代的扩增技术（SDA）
指综合能力包括检测能力、仪器设备和人员 等,主要检测盲样，符合要求这方能参与
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核酸诊断试剂的质控和评价
对照方法或试剂的要求
➢新诊断试剂
✓ 疾病症状以及临床诊断 ✓ 相关试剂 ✓ 研究对象的追踪随访 ✓ 疾病的判断标准
➢已有同类产品的试剂
可选择同类试剂; 若评价试剂所用的原料为 基因工程产品，应用非基因工程 原料制备的 试剂进行评价；对结果不一致样品的处理
➢探针的扩增
✓ 连接扩增反应（LAR） ✓ 以FEN-1 DNA聚合酶为基础的扩增 ✓ 循环探针
➢信号扩增
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核酸诊断试剂的质控和评价
免疫检测的原理
➢直接法 ➢间接法
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核酸诊断试剂的质控和评价
免疫反应中按标记物分类
➢同位素标记的放射免疫法 ➢酶标记的酶联免疫法 ➢生物素标记 ➢化学发光物质标记的化学发光法 ➢荧光素标记 ➢时间分辨法 ➢其他标记物
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核酸诊断试剂的质控和评价
造成非特异性的因素
➢原料：主要纯度不够，原料本身存在非特异反应
物质
➢反应模式：如孵育时间缩短非特异反应可提高
3-4倍，非常短时可高达10倍
➢样品中的干扰物质：
✓ 病人本身：如自身免疫性疾病（高免疫球蛋白血症 等），黄疸类、溶血类和高脂类病人
✓ 病人使用特殊药物
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核酸诊断试剂的质控和评价
样品典型的正态分布
•Cut-off
•Frequency of observations