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新药药理学：特殊毒性试验
❖ 临床前安全性评价的组成部分
刺激性试验
❖ 刺激性：非口服给药制剂给药后对给药部位产 生的可逆性炎症反应
❖ 刺激性试验：观察动物的血管、肌肉、皮肤、 粘膜等部位接触受试物后是否引起红肿、充血、 渗出、变性或坏死等局部反应
❖ 在急毒、长毒试验中已经评价过相关的刺激性， 其受试物与临床拟用的制剂相同或具有可比性， 可不必单独进行刺激性试验
特殊毒性试验
特殊毒性试验
❖ 狭义的特殊毒性试验：指遗传毒性试验、生 殖毒性试验、致癌试验，即一般常说的“三 致”试验
❖ 广义的特殊毒性试验：除“三致”试验以外， 还包括依赖性试验、过敏性试验、局部刺激 性试验、溶血性试验、免疫毒性试验、光敏 试验、眼毒试验、耳毒试验等等
药物依赖性试验
❖ 药物依赖性是指药物长期与 机体相互作用，使机体在生 理机能、生化过程和/或形态 学发生特异性、代偿性和适 应性改变的特性，停止用药 可导致机体的不适和/或心理 上的渴求
❖ 诱导试验：大部分镇静催眠药无竞争性受体对抗剂， 可采用诱导试验。通过应用各种诱发惊厥的方法， 只采用阈下刺激强度，对正常动物不引起惊厥反应， 对镇静催眠药产生依赖性的动物，在断药期间出现 反跳性兴奋，原来的阈下刺激就可能诱发惊厥
药物依赖性试验
❖ 镇痛药：自然戒断/替代试验以及催促试验 ❖ 镇静催眠药：自然戒断/替代试验以及诱导试
眼刺激性试验
眼用药物及可能接触眼睛的受试物均应考虑进行 眼刺激性试验 首选家兔，可采用同体左右侧自身对比法 试验前24h需检查动物双眼 每只眼睛滴入0.05~0.1ml或涂敷0.1g受试物 给药后1、2、4、24、48及72h进行眼部检查 持久性损伤需延长观察期限，一般不超过21d 采用裂隙灯进行眼部检查，记录眼部反应分值， 判断刺激程度
刺激性试验
❖ 刺激性：非口服给药制剂给药后对给药部位产 生的可逆性炎症反应
❖ 刺激性试验：观察动物的血管、肌肉、皮肤、 粘膜等部位接触受试物后是否引起红肿、充血、 渗出、变性或坏死等局部反应
❖ 在急毒、长毒试验中已经评价过相关的刺激性， 其受试物与临床拟用的制剂相同或具有可比性， 可不必单独进行刺激性试验
特殊毒性试验
特殊毒性试验
❖ 狭义的特殊毒性试验：指遗传毒性试验、生 殖毒性试验、致癌试验，即一般常说的“三 致”试验
❖ 广义的特殊毒性试验：除“三致”试验以外， 还包括依赖性试验、过敏性试验、局部刺激 性试验、溶血性试验、免疫毒性试验、光敏 试验、眼毒试验、耳毒试验等等
药物依赖性试验
❖ 药物依赖性是指药物长期与 机体相互作用，使机体在生 理机能、生化过程和/或形态 学发生特异性、代偿性和适 应性改变的特性，停止用药 可导致机体的不适和/或心理 上的渴求
❖ 诱导试验：大部分镇静催眠药无竞争性受体对抗剂， 可采用诱导试验。通过应用各种诱发惊厥的方法， 只采用阈下刺激强度，对正常动物不引起惊厥反应， 对镇静催眠药产生依赖性的动物，在断药期间出现 反跳性兴奋，原来的阈下刺激就可能诱发惊厥
药物依赖性试验
❖ 镇痛药：自然戒断/替代试验以及催促试验 ❖ 镇静催眠药：自然戒断/替代试验以及诱导试
眼刺激性试验
眼用药物及可能接触眼睛的受试物均应考虑进行 眼刺激性试验 首选家兔，可采用同体左右侧自身对比法 试验前24h需检查动物双眼 每只眼睛滴入0.05~0.1ml或涂敷0.1g受试物 给药后1、2、4、24、48及72h进行眼部检查 持久性损伤需延长观察期限，一般不超过21d 采用裂隙灯进行眼部检查，记录眼部反应分值， 判断刺激程度
中药A注射剂特殊毒性实验 药理实验
中药A注射剂特殊毒性实验【实验目的】通过对中药A注射剂的刺激性、过敏性、溶血性实验，研究该注射剂的安全性。
【实验原理】略。
【实验材料】动物：SD大鼠20只，雌雄各半，200—250g；豚鼠60只，雌雄各半，200—250g；家兔1只，1.5～2.0 kg。
试剂：中药A注射剂，75%乙醇，蛋清，蒸馏水，0.9%氯化钠溶液，苦味酸试剂。
仪器：全光谱灯，离心机，恒温箱，含玻璃珠的三角烧瓶，剃须刀，砂纸，玻璃纸，胶布，绷带，试管，玻璃棒，载玻片。
【实验方法】（一）刺激性试验方法皮肤刺激性试验1 实验动物选SD大鼠，20只，雌、雄各半。
设赋形剂（75%乙醇）对照，采用同体左右侧自身对比法。
试验前24小时对背部给药区用剃须刀进行脱毛处理。
去毛范围左、右各3 cm×3 cm。
给药前检查去毛皮肤是否因去毛而受损伤，有损伤的皮肤不进行试验。
进行破损皮肤的刺激性研究时，在用药部位用砂纸磨或划“井”字并以渗血为度。
2 给药方法取受试物0.5 ml直接涂布于一侧已去毛的皮肤上，然后用二层纱布（2.5 cm×2.5 cm）和一层玻璃纸覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定；另一侧涂布赋形剂75%乙醇作对照。
贴敷时间4小时。
贴敷结束后，除去受试物并用温水清洁给药部位。
3 结果观察在自然光线或全光谱灯光下观察皮肤反应。
按表1给出的评分标准对皮肤红斑和水肿进行评分。
①单次给药皮肤刺激性试验，在去除药物后30-60分钟，24、48和72小时肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。
如存在持久性损伤，有必要延长观察期限以评价上述变化的恢复情况和时间。
但延长期一般不超过14天。
对出现中度及以上皮肤刺激性的动物应在观察期结束时对给药局部进行组织病理学检查。
4 结果评价计算每一观察时间点各组受试物及赋形剂皮肤反应积分的平均分值，按表2进行刺激强度评价。
表1.皮肤刺激反应评分标准判断指标：表2.皮肤刺激强度评价标准（二）过敏性试验方法全身主动过敏试验（ASA）对致敏成立的动物体内，静脉注射抗原，观察抗原与IgE抗体结合后导致肥大细胞、嗜碱性细胞脱颗粒、释放活性介质而致的全身性过敏反应。
特殊毒性试验PPT课件
遗传毒性试验：
指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的受 试物的体外和体内试验，这些试验能检出DNA损伤及其损伤 的固定 。
遗传毒性试验的用途：
主要用于致癌性预测。
遗传毒性试验的目的：
预测受试物是否有遗传毒性，降低临床试验受试者和药品 上市后使用人群的用药风险。
8
药物的遗传毒性研究
基因型鉴定
17
肝微粒体酶S9代谢活化系统： （1） S9诱导：
多氯联苯 500mg/kg 大鼠ip.
（2）S9的制备: 低温无菌条件制备肝匀浆
上清即为S9。
4 ℃，9000g，离心10min
（3）S9混合液： 平衡盐系统，其中含S9 5～30％（v/v）
18
试验方法 （标准平皿掺入法）：
氨基喋呤 50μg 大鼠 100μg
氨甲喋呤 42μg 大鼠 200μg
乙烯雌酚 20-80μg 恒河猴 200μg
苯妥英钠 2mg
小鼠 50mg
人与动物比值
5-2.5 2 4.8 10-2.5
25
4
药物特殊毒性研究
内容：
遗传毒性 致癌作用 生殖和发育毒性 药物依赖性
.
5
药物的遗传毒性
顶层琼脂＋测试菌株、 受试物、S9混合液
底层琼脂培养基平皿
（点试法）：
固化
37 ℃，培养48h
结果评价：
Rt/Rc≥2，并有量效关系，判为阳性； 滤纸片周围长出一圈密集的回变菌落。
菌落计数
19
20
2.哺乳动物培养细胞染色体畸变试验
21
22
23
细胞:
CHL、CHO、人外周血淋巴细胞等。
建议首选中国仓鼠肺细胞(CHL), 需定期检查核型和有无支原 体等污染。-80℃或液氮冻存
指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的受 试物的体外和体内试验，这些试验能检出DNA损伤及其损伤 的固定 。
遗传毒性试验的用途：
主要用于致癌性预测。
遗传毒性试验的目的：
预测受试物是否有遗传毒性，降低临床试验受试者和药品 上市后使用人群的用药风险。
8
药物的遗传毒性研究
基因型鉴定
17
肝微粒体酶S9代谢活化系统： （1） S9诱导：
多氯联苯 500mg/kg 大鼠ip.
（2）S9的制备: 低温无菌条件制备肝匀浆
上清即为S9。
4 ℃，9000g，离心10min
（3）S9混合液： 平衡盐系统，其中含S9 5～30％（v/v）
18
试验方法 （标准平皿掺入法）：
氨基喋呤 50μg 大鼠 100μg
氨甲喋呤 42μg 大鼠 200μg
乙烯雌酚 20-80μg 恒河猴 200μg
苯妥英钠 2mg
小鼠 50mg
人与动物比值
5-2.5 2 4.8 10-2.5
25
4
药物特殊毒性研究
内容：
遗传毒性 致癌作用 生殖和发育毒性 药物依赖性
.
5
药物的遗传毒性
顶层琼脂＋测试菌株、 受试物、S9混合液
底层琼脂培养基平皿
（点试法）：
固化
37 ℃，培养48h
结果评价：
Rt/Rc≥2，并有量效关系，判为阳性； 滤纸片周围长出一圈密集的回变菌落。
菌落计数
19
20
2.哺乳动物培养细胞染色体畸变试验
21
22
23
细胞:
CHL、CHO、人外周血淋巴细胞等。
建议首选中国仓鼠肺细胞(CHL), 需定期检查核型和有无支原 体等污染。-80℃或液氮冻存
特殊毒性试验
前致癌物 (precarcinogen) 不直接致癌，必须在体内经代谢转化， 其代谢产物才具致癌作用的化合物
近致癌物 (proximate carcinogen) 前致癌物经代谢活化过程形成一种或一 系列中间代谢产物，必须经进一步代谢活化， 才能形成终致癌物 终致癌物 (ultimate carcinogen) 直接致癌物和间接致癌物经代谢活化所 形成的具有致癌作用的代谢物的统称
阴性结果：意义较差
二、哺乳动物长期致癌试验
(一) 动物选择 易感性是选择动物最重要依据 物种：特定靶器官 品系： 年龄：刚断乳 性别：雌雄各半 数量：各50只
（二）剂量设计 一般设3个染毒剂量组和1个对照组， 必要时另设一个溶剂对照组。3个染毒 剂量组包括无作用剂量组、阈剂量组、
（三）癌基因、原癌基因及抑癌基因
1．癌基因 (oncogene) 在自然或实验条件下具有诱发恶性转化 的潜在基因，是化学致癌物作用的主要靶分 子，在细胞癌变过程中起着关键作用
是一类被激活的基因，所指导合成的蛋 白质能够促成细胞恶性表型的形成
原癌基因 (proto-oncogene) 机体内正常细胞所具有的能致癌的遗 传信息。正常情况下它呈静止状态，对细 胞无害且具有重要生物学功能（调控细胞 生长分化，促进细胞分裂、增殖等） 原癌基因在进化过程中高度保守
肿瘤流行病学研究
限定为一个而不是全部器官和组织
常用的哺乳动物短期致癌试验
小鼠肺肿瘤诱发试验
小鼠皮肤肿瘤诱发试验 雌性大鼠乳腺癌诱发试验 大鼠肝转变灶试验
在给予受试物后，多次持续给予促长剂
阳性结果：与长期动物致癌试验相当。 由于试验期较短，又未检查其他器官和系 统，特别是皮肤肿瘤和乳腺癌的诱发试验 似乎仅适用于较小范围的化学物质
特殊毒性new
有关问题
受试物配制
样品难溶于水或其它溶剂，不能注射给药时，可改为 灌胃。口服给药尽量研磨均匀，必要时制成混悬液。 对细菌或细胞试验时，则可以将样品充分研磨均匀， 用水或其它合适的溶剂充分浸取灭菌后使用。
剂量设计
剂量设计与急性毒性的LD50值有关。但少数低毒西药 和MT许D多；基也因有工少程数产药品品，制往备往困测难不和出价L格D昂50值贵，，只此能时测允许 用多少倍ACD或MTD来表示。细胞染色体畸变试验， 毒性很低不能测出50%细胞生长抑制浓度时，其最高浓 度以不超过10mM为宜
如某些阳性或可疑阳性时，可选择哺乳动物培养 细胞基因突变试验或果蝇伴性隐性致死试验
哺乳动物培养细胞染色体畸变试验
细胞: 建议首选中国仓鼠肺细胞(CHL), 需定期 检查核型和有无支原体等污染。-80℃或液氮 冻存
剂量：高剂量以50％细胞生长抑制浓度为基准， 最高不要超过10mM分子量。溶解受限时可采 用饱和浓度。中低剂量用倍量稀释法。至少３ 个剂量
有关问题
结果的判定
阳性：有统计学意义、量－效关系、可重复 阴性：结合是否达到MTD，有无阳性对照 阳性物对照组不可省
其它问题
实验设计：剂量，对照组、观察指标、统计方 法、给药周期、给药途径、结果判定应合理
资料整理应规范
3.如遇阳性或可疑阳性时，可选择UDS试验或 SOS显色试验
生殖毒性(致畸)试验
一般生殖毒性试验 致畸敏感期毒性试验 围产期毒性试验
生殖毒性试验----致畸敏感期毒性试验
动物：首选Wistar 或SD大鼠，也可用小鼠或家兔 Ｉ类最好增加家兔或猪、猴、狗之一
动物数：每组孕大、小鼠≥１５只，孕兔≥ ８只 剂量：高、中、低三个剂量，限度剂量为1g/kg。
特殊毒性
“头三个月长脑子！”
三、化学毒物对生殖的损害
（一）对雄性生育力的损害
影响性欲和性行为 如性激素、身体健康等
损害生精过程 精子形态、精子数量、活
精子率、精子活动力
精子
（二）对雌性生育能力的损害
影响性欲和性行为
对性激素和性周期的作用 对卵细胞的损害
卵子
受孕后身体生理变化
四、生殖毒性评价方法
如，在不同阶段服用反应停引起的不同畸形： 怀孕后第 35 到 37 天 → 胎儿耳朵畸形和听力缺失 第 39 到 41 天 → 胎儿上肢缺失 第 43 到 44 天 → 胎儿双手呈海豹样3指畸形 第46 到 48天 → 胎儿拇指畸形
致畸敏感期：一般在器官形成期，胚胎最为敏 感，即正在发育的胚胎如在器官形成期与致畸 物接触，则最易出现畸形。
染色体组
(ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD）
(ABCD) (ABCD) (A’B’C’D’) (A’B’C’D’)
(ABCD) (ABC) (ABCD) (ABCD)(A) (ABCD) (ABCD)(AA) (ABCD) (ABCD)(AB) (ABC) (ABC)
第一节 生殖发育毒性及其试验
与评价方法
一、概述
❖ 生殖发育是指从配子形成直到胎儿分娩出的整个过程，其中包
括生殖细胞(或称配子，即精子和卵细胞)发生、卵细胞受精、着床、 胚胎形成、胚胎发育、器官发生、胎仔发育、分娩和哺乳过程。生 殖发育也可称为繁殖过程。
❖ 生殖毒性：是指外源化学物对雌性和雄性生殖
功能或能力以及对后代产生的不良效应。
乌克兰反对派领导人尤先科
三、化学毒物对生殖的损害
（一）对雄性生育力的损害
影响性欲和性行为 如性激素、身体健康等
损害生精过程 精子形态、精子数量、活
精子率、精子活动力
精子
（二）对雌性生育能力的损害
影响性欲和性行为
对性激素和性周期的作用 对卵细胞的损害
卵子
受孕后身体生理变化
四、生殖毒性评价方法
如，在不同阶段服用反应停引起的不同畸形： 怀孕后第 35 到 37 天 → 胎儿耳朵畸形和听力缺失 第 39 到 41 天 → 胎儿上肢缺失 第 43 到 44 天 → 胎儿双手呈海豹样3指畸形 第46 到 48天 → 胎儿拇指畸形
致畸敏感期：一般在器官形成期，胚胎最为敏 感，即正在发育的胚胎如在器官形成期与致畸 物接触，则最易出现畸形。
染色体组
(ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD）
(ABCD) (ABCD) (A’B’C’D’) (A’B’C’D’)
(ABCD) (ABC) (ABCD) (ABCD)(A) (ABCD) (ABCD)(AA) (ABCD) (ABCD)(AB) (ABC) (ABC)
第一节 生殖发育毒性及其试验
与评价方法
一、概述
❖ 生殖发育是指从配子形成直到胎儿分娩出的整个过程，其中包
括生殖细胞(或称配子，即精子和卵细胞)发生、卵细胞受精、着床、 胚胎形成、胚胎发育、器官发生、胎仔发育、分娩和哺乳过程。生 殖发育也可称为繁殖过程。
❖ 生殖毒性：是指外源化学物对雌性和雄性生殖
功能或能力以及对后代产生的不良效应。
乌克兰反对派领导人尤先科
毒性试验
遗传毒性研究在药物研发中处于比较的重要位置，尤其是在药物筛选阶段，在很大程度上遗传毒性试验结果将影响到药物开发的进程。
一般而言，根据其检测的遗传学终点可分为4种类型：检测基因突变；检测染色体畸变；检测染色体组畸变；检测DNA原始损伤。
长期毒性试验
长期细胞毒性试验一般是在急性毒性试验结果的基础上，观察评价动物反复给予受试物后，机体产生毒性反应的特征及其毒性损害的严重程度，以及主要毒性靶器官及其损害的可逆性。
急性毒性试验
急性毒性试验是指在24小时内动物接受药物1-2次（间歇时间为6-8小时），观察给药后动物7-14天内所产生的急性中毒反应。
急性毒性试验可确定被研究药物的毒性程度，即剂量和不良反应之间的关系，亦可以比较被研究对象与其他已知急性毒性物的相对毒性程度，通过对不同给药途径出现毒性作用的比较研究， 就可以确定药物不同接触途径的相对危害。
受试物长期毒性试验的目的是提供受试物的无毒性反应剂量和临床主要检测指标，为制定人用安全剂量提供参考资料。
因此长期毒性试验的设计 最好能包括神经病理学、生理学、生物化学及相关的形态学指标的监测，还应注意受试物再组织中可能的蓄积，以及通过其他机制产生的延缓毒性作用等。
北校区北门2205师母,13515209736
致畸敏感期毒性试验大鼠致畸敏感期毒性试验：按受试品剂量分组，对雌性大鼠受孕后的第6-15天连续给药。观察受试品对胎仔外观、体重、身长、尾长、内脏和骨骼等的影响，并与生理盐水对照组比较。
围产期毒性试验大鼠围产期毒性试验：按受试品剂量分组皮下注射给药，给药时间为孕鼠妊娠15天开始至分娩后28天，观察受试品大、中、小三个剂量组，对大鼠胚胎后期生长发育、母鼠分娩、以及新生F1代大鼠的生理发育指标、神经反射发育指标和生殖功能，并与生理盐水对照组比较。
特殊毒性试验.
染毒时间的控制
由于致畸作用有明显的敏感期，所以给于受 试物的时间极为重要，应在器官发生期的开始 阶段。过早给予将影响受精卵着床，过迟则对 发育成热的胚胎不能显示致畸作用、大鼠为受 孕后第8天，小鼠为第5天，家免第9天，猴第 10天
致畸效应检查
母体检查 胎仔检查 迟发作用的检测
哺乳动物短期致癌试验
又称有限动物试验，是指在有限的40周内，观 察某个靶器官或组织 小鼠肺肿瘤诱发试验 大鼠肝转变灶诱发试验 小鼠皮肤肿瘤诱发试验
小鼠肺肿瘤诱发试验
多采用对肺肿瘤敏感的品系小鼠，于一次或多 次给予受试物后．或根据需要再多次给予促癌 剂(常用丁基羟甲苯)，可在16-30周左右结束试 验。若受试物具有诱发肿瘤作用，无论是大体 解剖或者镜下都可见受试物诱发的肿瘤或癌。
胚胎组织发育过程的不协调 胚胎正常结构的 形成、依赖于多种细胞和组织在增殖、分化和 生长上的高度协调。某些化学物对胚胎发育过 程中的某些细胞或组织增殖分化过程的干扰， 可造成各种细胞和组织之间在时间和空间关系 上的紊乱，导致特定的组织、器官、系统的发 育异常。
致畸试验方法
物种选择 剂量与分组 动物交配处理 致畸效应检查
致畸作用及试验方法
胚胎在发育过程中，由予各种原因造成器官 形态结构的异常，称为畸形具有畸形的胚胎或 胎仔，称为畸胎。凡能引起胚胎发生畸形的化 学物称为致畸物或致畸原。化学物通过母体作 用于胚胎而引起胎儿畸形的现象称为致畸作用。 广义的致畸作用还包括引起胚胎发育迟缓、功 能不全和胚胎死亡。
致畸物
遗传毒性致癌物
遗传毒性致癌物 能与DNA发生共价健结合，造成对 DNA损伤的致癌物 直接致癌物：能直接与亲核分于(包括DNA)共价键结 合形成加台物，这类物质绝大多数是合成的有机物， 如烯比环氧物、亚胺类、芥子气、活性卤代烃类等； 前致癌物：需要代谢活化后才能与洲A反应造成DN八 损伤致癌，如苯并芘(3)、邻苯甲胺 无机致癌物：有些能损伤DNA或是通过改变DNA聚合 酶的保真性而致癌，如镍、钛等