线虫扫描电镜样品制备技术的比较
扫描电镜标本制备技术[资料]
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扫描电镜标本制备技术扫描电镜Scanningelectronmicroscope，SEM)与透射电镜在观察中获得的超微结构信息各有所长，并互相补充。
透射电镜样品制备技术主要用于观察生物样品内部的二维平面的微细结构，而扫描电镜所收集的主要是电子束照射在样品上所产生的二次电子。
由于扫描电镜景深长，故其图像层次丰富，立体感强，可显示生物样品表面及其断面的三维立体结构。
一、SEM生物样品制备的基本要求及操作程序生物样品与金属、矿物等材料不同，具有质地柔软、容易变形、导电性能差、二次电子发射率低、含水量多(有的含水达80%以上)等特点，因此对热、干燥、电子轰击等十分敏感，所以扫描电镜生物样品的制备有以下基本要求：1.注意表面的清洁，防止污染。
2.样品要干燥，不能变形，尽量保持样品表面的微细结构。
3.导电性能要好，应进行导电处理。
4.二次电子的发射率要高。
5.注意确认和保护样品的观察面。
尽管不同的生物样品可以采用不同的制备方法，但一般情况下除了比较坚硬的组织(骨骼、牙齿、指甲、毛发、贝壳、昆虫及某些植物样品)和需采用某些特殊制备技术者(管道铸型扫描、低电压观察法等)外，均需要经过取材、清洗、固定、脱水、干燥及金属镀膜等基本操作程序。
(一)取材1.取材前应作好药品及器材的准备，每次取材的品种及数量不宜过多，以免延误时间、影响制样效果。
2.动作要迅速，材料应尽快进入固定液。
3.取材部位要准确。
观察组织细胞表面结构为主的样品，直径最大不宜超过5mm，高度可在3～5mm之间。
观察组织细胞内部结构为主的样品，直径应小于2mm，高度可在3mm左右。
为了提高固定、脱水、干燥及镀膜效果，在满足所需要观察内容的条件下，样品块以尽量小一些为宜。
4.机械损伤要小，解剖器械要锋利，取材动作要轻巧，避免牵拉和钳夹，并做好对观察面的标记。
5.操作应在低温(0～4℃)下进行。
(二)样品情况在样品制备过程中，应注意清除覆盖于样品表面的粘液、分泌物、组织液、血液、细胞碎片、药物反应沉淀物等所造成的污染，否则不仅会掩盖样品表面的微细结构，甚至会得出错误的判断。
扫描电子显微镜样品制备技术综述
扫描电子显微镜样品制备技术韩玉泽扫描电子显微镜样品制备技术扫描电镜所收集的主要是电子束照射在样品上所产生的二次电子,一般扫描电镜图象均为二次电子图象.由于扫描电镜具有高分辨率,景深长等特点,故其图象层次丰富,立体感强,可显示细胞和组织的三维结构形貌,故广泛应用于生物样品表面及其断面的微细结构观察.近年来,扫描电镜所取得的迅速发展表明,仪器本身性能如分辨力和多功能等的不断提高固然重要,但样品制备技术的改良和日趋完善,对扫描电镜的应用与发展确实起到了积极促进作用,因此样品制备的质量,是直接决定扫描电镜能否发挥最佳性能并排除理想图片的关键所在.所以,自1966 年第一台商品扫描电镜诞生以来,扫描电镜样品制备技术问题,一直是电镜工作者们苦心钻研,不断创新的一个重要领域扫描电镜生物样品制备的基本要求生物样品与金属﹑矿物材料不同,它具有质地柔软,容易变形﹑导电性能差﹑二次电子发射率底以及含水量多(有的含水可达80％以上)等特点.因此,在对于高真空状态下的生物针对生物样品的特殊性,在进行扫描电镜样品制备时,一般要掌握以下原则:(一)每一操作过程,都应注意防止对样品的污染和损伤,使被观察的样品尽可能地保持原有的外貌及微细结构.(二)去除样品内水份,以利于维持扫描电镜的真空度和防止对镜(三)降低样品表面的电阻率,增加样品的导电性能,以提高二次电子发射率,建立适当的反差和减少样品的充放电效应.(四)无论观察组织细胞的表面或内部微细构造,都应注意确认和保护样品的观察面.二、SEM生物样品制备的基本操作程序在SEM生物样品制备过程中，除比较坚硬的组织（如骨骼、牙齿、指甲、毛发，贝壳、昆虫及某些植物样品）需要采用某些特殊制备技术者（如管道铸型扫描、低电压观察法等）以外，一般生物组织均需要经过取材、清洗、固定、脱水、干燥及金属镀膜等基本程序处理以后，才能进行SEM观察。
SEM生物样品制备的基本程序（一）取材SEM样品的取材，与透射电镜的超薄切片法一样，是整个样品制备过程中的关键步骤之一。
昆虫材料扫描电镜观察技术
龙源期刊网 昆虫材料扫描电镜观察技术作者：宋月芹，董钧锋，孙会忠来源：《湖北农业科学》2013年第05期摘要：介绍了昆虫材料扫描电子显微镜观察的主要技术环节及注意事项。
扫描电镜观察主要包括材料的预处理、清洗、二重固定、脱水、置换、干燥、粘台、喷金镀膜和观察等步骤。
并通过与实例图片的对比，总结和讨论了获得较好观察效果的关键步骤。
该技术具有推广价值和借鉴意义。
关键词：昆虫材料；扫描电子显微镜；显微观察中图分类号：Q964 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）05-1064-02Scanning Electron Microscope Technology of Insect MaterialSONG Yue-qin，DONG Jun-feng，SUN Hui-zhong（College of Forestry，Henan Sci-Tech University，Luoyang 471003，Henan，China）Abstract： The main technical aspects and notes of the observation on insect material with scanning electron microscope（SEM） were introduced. The main process of observation by SEM includes pretreatment of the material， double fixation， clean， dehydration， replacement，drying， glue station， spraying metal coating and observation. Through the contrast of experimental pictures， the key technology for obtaining good observation effect was summarized and discussed. The observation technology has wide popularization value and reference significance.Key words： insect material； scanning electron microscope（SEM）； microscopic observation。
扫描电镜样品制备
扫描电镜样品制备扫描电子显微镜生物样品制备技术无论是透射电镜或是扫描电镜，样品均处于电镜镜筒的真空之中。
而大多数的生物样品都是柔软而且含大量水分的。
因此，也和透射电镜的样品一样，在进行扫描电镜观察前，必须对生物样品作相应的处理。
扫描电镜的功能很多，不同的功能对样品的要求不同。
例如二次电子像与背散射电子像和吸收电子像对样品的要求基本相同，而与X射线微区分析对样品的要求相差较远。
我们首先介绍二次电子像的生物样品制备技术。
此外，由于样品的性质不同，其处理方法和程序也有不同。
主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种子等。
此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、导电处理等简单过程即可进行观察。
如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。
另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。
对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视。
但是，不管是那一类样品的制备，都应达到以下要求：∙尽可能保持样品活体时的形貌和结构，以便如实地反映样品本来面目。
∙在样品的干燥过程尽可能减少样品变形。
∙样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应。
样品的前期处理扫描电镜样品的前期处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程。
而每一过程的处理方法基本上都是沿用透射电镜样品的处理方法的，所以，这里不一一再作详述。
但是，由于两种电镜观察的要求不同，因此，在处理中也有不同之处：1. 透射电镜主要研究样品的内部结构要求内部结构保存好，因而样品宜尽可能小使固定液能迅时渗入固定。
扫描电镜观察表面形貌，而且为了操作方便选取较大样品。
一般在8～10mm2左右，高度可达5mm。
【电子显微镜,分类和电镜样品制备技术】电镜样品制备
【电子显微镜,分类和电镜样品制备技术】电镜样品制备电子显微镜分类和电镜样品制备技术电子显微镜技术简称电镜技术，它包括电子显微镜(electronmicroscope)和样品制备技术(techniquesofsamplepreparation)两大方面。
电子显微镜的基本原理与光学显微镜相同，但光源和透镜有所不同，电镜利用电子束作光源，电磁场做透镜，因而最佳分辨率可达1-2，放大倍率达150万倍。
样品制备技术是制作电镜标本的综合技术，比光学显微镜制片过程更精细和复杂。
它包括普通样品制备技术(如超薄切片技术)和特殊样品制备技术(如电镜酶细胞化学技术)。
第一台电镜诞生于1931年，至今已有70余年的历史，经过不断的改进和提高已从最初的一种电镜发展为多种电镜，分辨率可达到1。
近年来，随着电镜计算机的一体化，使新型电镜的操作更为简便，图像获取更快捷，而且电镜图像在观察过程中可以得到即时储存和统计分析等，大大提高了电镜的使用效率。
电子显微镜技术是研究细胞超微结构最重要的手段。
广泛应用于医学生物学等各个学科，在现代医学科学研究和临床疾病的诊断中发挥着重要的作用。
(一)电子显微镜的种类电子显微镜是以电子束作光源、电磁场作透镜、具有高分辨率和放大倍率的显微镜。
电镜通过收集、整理和分析电子与样品相互作用产生的各种信息而获得物体的形貌和结构等。
电镜的类型也是利用电子信号的不同和成像的不同而进行分类。
主要分为透射电子显微电镜、扫描电子显微电镜、分析电子显微镜和高压电子显微镜。
1、透射电子显微电镜透射电子显微电镜(transmmisionelectronmicroscope)，是发展最早、应用最广泛的电镜，一般所说的电镜指的便是透射电镜。
透射电镜主要用于观察组织细胞的内部结构。
透射电镜由三大系统组成，包括镜体系统、真空系统和电子线路系统。
镜体系统是电镜的主体，结构相当复杂，又分为照明系统、成像系统和观察记录系统。
照明系统由电子枪和聚光镜组成，电子枪发射电子作为电镜的照明光源。
植物线虫常用保存和标本制作方法
植物线虫常用保存和标本制作方法摘要：为了进行线虫的分类鉴定，便于观察线虫细微的形态结构，通常要将标本进行长期保存或制成长期玻片。
本文将介绍几种常见的保存和标本制作方法。
关键词：植物线虫；保存；标本制作1 植物线虫的保存方法1.1 线虫的杀死线虫分离后可以直接检查，如果样本需要保存，就要将线虫杀死并固定，防止变形变质。
1.1.1 一般都采用加热的方法杀死线虫。
杀死少量线虫，可以把线虫挑或吸到载破片上的水滴中，通过火焰下方加热即可杀死。
大量的线虫，可以在皿内通过火焰，边加热边观察，到线虫突然伸直停止活动，或呈弓形或螺旋形时，停止加热，观察到虫体仍不活动方可认为杀死线虫。
1.1.2 也可以用热水浴杀死，在线虫悬浮液放入水浴锅中，加温至56-58℃，3min后放入冰箱或室温自然降温，待悬浮液冷却后立即加固定液固定。
1.2 线虫的固定需要保存或需用电镜观察的线虫，应在杀死后立即进行固定。
固定的目的是为了防止虫体的变形和变质。
1.2.1 固定液种类很多，2%-4%的甲醛液是一种常用的固定液，优点是配制简单、使用方便，线虫在这种固定液中可以长期保存，缺点是时间长了有可能使虫体内部形成颗粒1.2.2 三乙醇胺福尔马林液（taf）是另一种适用的线虫固定液，配制方法如下：福尔马林（40%甲醛）7ml，三乙醇胺2ml，蒸馏水91ml。
这种固定液是认为较好、用得较普遍的固定液，优点是固定速度快，虫体固定后虫态逼真，可较长期保存。
但时间过长，会导致一些线虫内部结构透明和表皮角质膜变质，2 植物线虫长期标本的制作2.1 脱水制作永久玻片和半永久玻片的线虫需要固定后脱水，而且用于脱水的线虫必须固定24小时以上。
一般用甘油法，也有用乳酚油处理的。
2.1.1 甘油酒精脱水法，配置方法如下：甲溶液：95%酒精20ml，甘油1ml，蒸馏水79ml；乙溶液：95%酒精95ml，甘油5ml；取固定24h以上的线虫故进盛有甲溶液的小皿内。
扫描电子显微镜的样品制备一些技术
2.样品室内压力达不到要求： （1）注入液态二氧化碳量过少：可能会使样品位于二氧 化碳的气液面交界处，样品受到液体二氧化碳表面张力的 作用，尽管比水的表面张力小的多，但仍会影响样品的精 细结构。 （2）样品室密闭不良：这可能是因为垫圈老化，有裂纹， 或垫圈下有异物等。 3.注入液体二氧化碳困难：主要因为样品室的温度高，没有 事先降温。夏季室温高于30度时更易造成注入困难。降温 的办法有两种：一是用少许液体二氧化碳充盈2-3次，再 放掉气体的二氧化碳；二是用控温钮调制低于室温10度。
脱水处理：对保证金属镀膜装置和电镜的镜筒真空度和防止 样品在高真空状态下的龟裂和变形等有重要的作用。采用不 同浓度的乙醇或丙酮梯度脱水逐步的除去样品中的水分。
6.2.2 样品的干燥：
1. 自然干燥法：把样品暴露在空气中直接干燥，只适用于表 面比较坚硬或含水分较少的生物样品。如：昆虫、骨骼、牙 齿、毛发、种子、果壳、花粉、植物标本，以及微小材料如 细菌等。具体做法是：先将样品固定，并系列脱水到100％， 在大气中让脱水剂自然挥发即可，但注意环境要干燥。因为 脱水剂的表面张力系数比水小所以样品在脱水剂中不会过多 变形而影响其结构。
6.1.4常规生物样品制备技术
制备过程如下： ①取材 根据需要，切取适当大小的样品。专门的SEM备有 灵活可动，范围较大的样品台，样品可大些。装在透射电 镜上的扫描附件，活动范围较小，样品直径应在3～4mm左 右。 ②漂洗 用缓冲液把组织表面洗净，否则会影响正常形态， 但以快速和轻巧为宜，尽量保护器官或组织的表面结构， 使其不致因不慎的操作造成人为损伤。 ③固定 用2.5～5％戊二醛/缓冲液在室温或4摄氏度下前固定。 具体时间可根据样品的需要而定，一般单细胞10-30分钟， 较大的或较硬的样品可达1-2h或更长时间。 ④漂洗 用缓冲液洗3次，洗去未结合的戊二醛。 ⑤重固定 1％锇酸/缓冲液4摄氏度下后固定10～60min。有 时为了提高样品的反差和固定效果，可以综合固定液，如 随意选用戊二醛、多聚甲醛、锇酸等按照不同的比例混合 使用。
扫描电子显微镜样品的制备
样品制备技术的重要性
样品制备工作是电镜工作中最繁重、最艰 难的工作，又是最重要的环节，熟悉和掌握样 品制备技术是应用电镜来解决问题的首要条件。 根据电镜的类型、研究目的和样品类型及状态 的不同，相应采用不同的制样方法。制样方法 的选择和制样过程的技术控制将直接影响观察 和分析的结果。
高真空扫描电镜样品制备
1. 粉末样品的制 备 湿法:用适合 的分散剂在超声波 清洗器中分散
干法:适宜于不易团聚的样品
2. 块状样品的制备
将欲观察样品的有规律地粘结在样品台上
特殊表面处理--表面蚀刻
表面蚀刻是SEM样品制备的重要方法之一。特别适用于 对大块样品内部的结构形态和多相复合体系的相分布研究。 蚀刻法样品制备主要是基于如下原理：即利用蚀刻剂 与样品中不同组份或不同结构区域之间相互作用速率或程 度的不同，因而可以有选择或优先地溶解或破坏其中的某 一相或组份而保留下另一相或组份。 因此，蚀刻法可用于研究高聚物的结晶形态，以及共 混或填充高聚物中的相分布状态和各相之间的相互作用状 况；无机复合材料的相结构形态等。
送检样品须知
1.送检样品必须为干燥固体、块状、片状、 纤维状及粉末状均可。 2.应有一定的化学、物理稳定性，在真空 中及电子束轰击下不易分解、挥发或变 形。 3.样品无腐蚀性、放射性和磁性。
选择不同的制样方法：电镜的类型(扫描电镜,
透射电镜,电子探针) 要求, 研究目的, 样品类型
形貌观察 1.环境扫描电镜二次电子图像观察的样品制备 2.高真空扫描电镜二次电子图像观察的样品制备 3.背散射电子图像观察的样品制备 成分分析 X射线微区分析的样品制备技术 结构分析 背散射电子衍射的样品制备技术
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图1. HIPS树脂SEM 像 (早期文献 照片），溶剂 蚀刻， 可见 橡胶相被溶解 后留下的空隙
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本 实 验 室 采 集 分 离 的 小 杆 线 虫 Ｔ ｍａ ｕｉ ｎ品 系 ， 三 等齿属无 花果品 系 ， 结线 虫。 根
１ ２ 使 用 仪 器 ．
Ｋ Ｑ 一２ Ｄ Ｘ １０型多槽式 超声 波 清洗 机 、 Ｆ 一 ０型 Ｇ Ｄ３ ２
真 空 冷 冻 干燥 仪 、 日立 Ｓ３０ Ｎ型 扫 描 电 子 显 微 镜 。 －４０
１３． ． ３ 固定
Ｃ， Ｏ 临界点 干燥和 真空冷冻 干燥技 术及 相互组 合 技
术在线虫扫描 电镜 样 品制 备 中的应 用 ， 果报 道 如 结
摘 要 ：扫描 电镜 是 线 虫分 类 研 究 中不 可 缺 少 的 重 要 工 具 ， 研 究 利 用 昆 虫 线 虫 小 杆 属 Ｒ ａ ｄｉ ｓ 、 等 齿 属 本 ｈ ｂ ｔ ｐ． 三 ｓ ｌ ｄｒ ｒ 、 物根 结 线 虫三 种线 虫为 试 材进 行 了 戊二 醛 固定 和 戊二 醛 一锇 酸 双 固 定技 术 、 Ｏ ｅａｔ ｅ 植 ｏ ｅ Ｃ ，临 界 点 干 燥 和 真
的 电镜 照 片 。 关 于 小 杆 科 线 虫 ，ｔ ｋ曾 用 相 同 。 Ｓｏ ｃ 的 方 法 对 哥 伦 比 亚 小 杆 线 虫 Ｒ ａｄｔ （ ｓ ｅ ｓ ｈｂｉ ￣ Ｏｃ ｉ ） ｈｕ
将 每种线 虫 的成 虫约 １０条均匀挑 入 ４个装满 ０ 蒸馏 水的 １５ｍ ． Ｌ离 心管 中 ， 分别记 为 １２ ３ ４号样 、、、
维普资讯
第２ ７卷 第 ３期
２０ ０ ８年 ６月
电 子 显
微 学 报
Ｖｏ 一 ７． ． ｌ２ Ｎｏ ３
２ ８０ ０ｏ — ６
Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｈ ｎ ｓ ｌｃ ｒ ｎ Ｍ ｉｒ ｓ ｏ ｙ Ｓ ｃｅｙ ｏ ｒ ａ ｆ Ｃ ｉ ｅ ｅ Ｅ ｅ ｔ ｏ ｃ ｏ ｃ ｐ ｏ ｉｔ
１ 材 料 与 方 法
１ １ 实 验 线 虫 ．
限， 可以观察 到 比 ０ ２ ． ｍ更小 的精细结 构 。 在线虫 的扫描 电镜 样品制备 中， 固定 、 若 脱水 和
干燥 环 节 技 术 不 当 ， 引 起 线 虫 体 表 严 重 变 形 ， 而 会 从 影 响 观 察 和 鉴 定 结 果 。 目前 对 斯 氏科 和 异 小 杆 科 线 虫 的 扫 描 电镜 制 样 技 术 研 究 和 应 用 较 多 ， 对 一 而
空 冷 冻 干燥 技 术 及 相 互组 合 技 术 的 比较 研 究， 果表 明 戊二 醛 一锇 酸 双 固 定和 真 空 冷 冻 干 燥 组 合 的 制样 技 术 更 、结
适 合 线 虫保 持 较 好 的 形 态结 构 ， 该 制 样 方 法 处理 的 线 虫 体 表 不 易 变形 ， 线 虫扫 描 电镜 制 样 可 参照 的 方 法 、 经 为
品 。 样 品 在 超 声 波 中 清 洗 １ 。 ０Ｓ
１ ３ ２ 样 品 处 理 ．．
对 ４个 离 心 管 中 的 线 虫 样 品 分 别 进 行 ４种 处
理。
ｃ ｏ ｂａａｎ ｐ 进 行 尝 试 ， 得 到 较 清 晰 的 图 ｏ ｍ ｉ ．ｓ ． ｌ ｎ 也
像 。但 是 ， 小 杆 科 其 它 种 的 线 虫 用 上 述 方 法 是 对 否 可 行 ， 且 用 近 年 来 应 用 较 多 的 真 空 冷 冻 干 燥 并 法 是 否 更 适 合 于 小 杆 线 虫 ； 外 ， 些 植 物 样 本 的 另 一 固 定 可 以仅 用 戊 二 醛 ， 用 剧 毒 的 锇 酸 ， 虫 是 否 不 线 也 可 以仅 用 戊 二 醛 固 定 。 针 对 上 述 问 题 ， 研 究 分 本 别 比较 了戊 二 醛 固定 和 戊 二 醛 一锇 酸 双 固 定 技 术 、
文 章 编 号 ：０ ０６ ８ （ ０ ８ ０ —２ ５０ １０ －２ １ ２０ ）３０ ５ —６
线 虫扫 描 电镜样 品制 备技术 的 比较
李 蕾。刘 奇 志 ， ， 王玉 柱 贾君 镇 孙 浩 元 刘海虹 ， ， ，
（ ． 国农 业 大 学 农 学 与 生 物 技 术 学 院 昆 虫 与 线 虫 学 实 验 室 ， 京 １０９ ； １中 北 ００ ４ ２ 北 京 市 农 林 科 学 院 果 树 林 业 研 究 所 ， 京 １０ ９ ； ． 北 ００ ３ ３ 中 国农 业 大 学 生 物 学 院 电镜 室 ， 京 １０９ ） ． 北 ０ ０４
样品 １ 离心 管 中的线 虫 用 于 处理 １ 戊 二 醛 一 ： 锇酸 双固定 、 真空冷 冻干燥 ；
样 品 ２离 心 管 中 的 线 虫 用 于 处 理 ２ 戊 二 醛 一 ： 锇 酸 双 固 定 、Ｏ 临 界 点 干 燥 ； Ｃ， 样 品 ３ 心 管 中的线 虫 用 于 处理 ３戊 二 醛 固 离 ： 定 、 空 冷冻干燥 ； 真 样 品 ４离 心 管 中 的 线 虫 用 于 处 理 ４ 戊 二 醛 固 ： 定 、 ０ 临 界 点 干燥 。 Ｃ，
关 键 词 ：扫 描 电 镜 ； 虫 ； 定 ； 燥 线 固 干
中 图分 类 号 ：Ｑ ５ ．７； ３ ６ ９ பைடு நூலகம் １ Ｑ ３
文 献标 识码 ：Ａ
线 虫分类是 研 究有 益线 虫 和有 害 线虫 的 基础 。
扫描 电子 显微 镜 是 线 虫 分类 研 究 中不 可 缺 少 的 工
具 ， 克 服 了光 学 显 微 镜 分 辨 率 受 光 波 长 限 制 的 局 它
１ ３ 实 验 方 法 ．
类新挖掘 出来 的 、 可用 于 生物 防 治 的小 杆 科线 虫
和植 物 线 虫 研 究 较 少 。
１ ３ １ 清 洗 ．．
在 斯 氏科 和异小杆科 线虫 的扫描 电镜 鉴定工作 中， 用戊二 醛 一锇 酸 双 固 定 的方 法 固定 线 虫 ， 合 结 Ｃ， Ｏ 临界点干燥 法 ， 制备 线虫样 品 ， 可以 获得较 清晰