兔肺静脉心肌细胞动作电位及TRPC3类通道电流特性
心肌细胞电生理
心肌细胞电生理
心肌细胞是心脏的主要组织成分之一，具有产生电信号和传递信
号的本领。
心肌细胞的电生理主要包括以下过程：
1.自律性（spontaneous depolarization）：心肌细胞具有自主
产生电信号的能力，其发生在心肌细胞的特定区域，这些区域被称为
起搏点。
其中最主要的起搏点是窦房结，它产生的电信号引起牵引心
肌细胞的传导而致心脏收缩。
2.动作电位（action potential）：动作电位是以电化学反应为
基础，通过心肌细胞细胞膜上的离子通道传播的一种电信号，其传播
过程包括快速上升 (depolarization)、平台期 (plateau phase)和快
速下降 (repolarization) 三个阶段。
3.传导（conduction）：传导是指心肌细胞之间的电信号的传递，也被称为电波。
当一个心肌细胞发生动作电位时，它会通过跨膜电势
变化影响其他相邻细胞的电位，从而通过心肌组织传导，引发心脏收缩。
4.心肌细胞复极化（repolarization）：心肌细胞复极化是指动
作电位终止和细胞膜上离子通道重新恢复到其基础状态的过程。
在复
极化期间，细胞膜上的钾离子通道打开，让钾离子从内部流出，使细
胞膜电位恢复到负电位并维持安静状态，等待下一次动作电位的产生。
总之，心肌细胞电生理是指心肌细胞产生、传导和控制电信号的过程。
正常的心肌细胞电生理有助于心脏的正常功能，而电生理的异常可能会引起各种心律失常或心脏的结构和功能异常。
心脏的电生理特性(完美版)ppt
心肌兴奋(Fen)性的周期性变化
*有效不应期effective refractory period ERP： ①绝对不应期absolute refractory period ARP ： 膜电位-55mv以前，钠通(Tong)道失活 ②局部反应 local reaction： 膜电位-55mv～-60mv
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心肌细(Xi)胞分类
快反应自律细胞
心房肌细胞 心室肌细胞
快反应非自律细胞 慢反应自律细胞
房室束细胞 浦肯野细胞 窦房结细胞 房结区细胞
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慢反应非自律细胞
结希区细胞 结区细胞
心脏各部(Bu)分心肌细胞的跨膜电位
SAN：窦房结 AM：心房肌
AVN：结区 BH：希氏区
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心肌兴(Xing)奋性的周期性变化
•a,b: 局部反应
•c,d,e: 可扩(Kuo)布的 动作电位
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心肌(Ji)兴奋性的周期性变化
概念
兴奋性 与膜电位关系 Na 通道
ARP
ERP
RRP
SP
任何刺激不能引 任何刺激不能引 大于阈值刺激才 小于阈值刺激即
起动作电位
窦房结细(Xi)胞动作电位特征
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Pacemaker Potentials
Leaky membrane auto-depolarization
autorhythmicity
the membrane is more permeable to K+ and Ca++
ions
2 期(Qi)
平台期，是心肌动作电位时程较(Jiao)长的主要原因，也
二、心脏各部分心肌细胞的动作电位及其离子流的基础
1 、慢反应细胞：如窦房结细胞和房室结细胞。
它们的共同特点是细胞膜上的快钠通道比较稀少，动作电位去极化由 I Ca-L 引起，幅值小，去极化速率慢；由于 I K1 通道贫乏，复极过程无平台，不存在 2 、3 期之分（见表 1 ）。
表 1 窦房结细胞和房室结细胞的动作电位特点窦房结房室结细胞直径 5 ～ 10 m m 5 ～ 10 m m 最大舒张电位－ 50 ～－ 60 mV － 60 ～－ 70 mV最大去极速率 1 ～ 10 v / s 5 ～ 15 v / s动作电位超射20 mV 20 mV动作电位射程100 ～ 200 mS 100 ～ 300 mS2 、快反应细胞：如工作心肌和浦肯野细胞。
细胞膜上 I K1 通道和 I Na 通道充分表达，动作电位去极化由 I Na 内流引起，幅值大，去极化速率快； I K1 通道的内向整流特性使心室肌和浦肯野细胞复极化过程呈现平台。
心房肌 I to 通道比较发达， I to 影响到动作电位 2 期，使之不能形成平台。
I Na 通道密度在浦肯野细胞和心室壁中层 M 细胞高，所以它们的去极化速率比较快。
延迟激活钾流的慢成份 I Ks 通道在室壁中层 M 细胞密度低，所以 M 细胞复极化慢，其动作电位时程长于心内膜下和心外膜下的心室肌细胞（表 2 ）。
心脏各部分心肌细胞动作电位图形及其与心电图波形的时间关系见图 4-1 。
表 2 心房肌、心室肌、浦肯野细胞的动作电位特点心房肌心室肌浦肯野细胞细胞直径10 ～ 15 m m 10 ～ 20 m m 为心室肌 3 倍静息电位－ 80 mV － 80 ～－ 90 mV MDP － 90mV最大去极速率100 ～ 200 v / s100 ～ 200 v / sM 细胞 300 v / s可达 800 v / s动作电位超射30 mV 30 ～ 40 mV 40 mV动作电位射程100 ～ 200 mS无平台，无 2 、 3期之分200 ～ 300 mSM 细胞最长，心内膜下细胞次之，心外膜下最短。
心室肌细胞动作电位的主要特点
心室肌细胞动作bai电位的主要特征是：0 期去极du化速度快，幅度高；复极过程zhi复杂dao，持续时间很长。
由除极化过程和复极化过程所组成的。
心室肌细胞复极化过程分为四个时期：
1、1期(快速复极初期)：由+30 mV 迅速下降到0 mV。
主要是快钠通道关闭，一过性钾离子外流（Ito）增加，氯电流正常情况下对1 期影响不大，但是儿茶酚胺（交感神经兴奋）可增加离子流的作用。
2、2期(平台期)：是快反应心肌细胞动作电位时程长的主要原因。
主要是L 型钙电流（慢钙通道），还有钠内流（受阻可出现第二平台期）、Na+-Ca2+ 交换电流、内向整流钾电流（Ik1）、延迟整流钾电流（Ik）。
3、3期(快速复极末期)：是复极的主要部分，钙离子内流停止，钾离子外流增加（Ik，Ik1 通道），Ik的逐渐加强是促使复极的重要因素，可与膜电位形成正反馈。
Ⅲ类抗心律失常药抑制 Ik 可明显延长动作电位。
4、4期(静息期)：是钠泵、Na+-Ca2+ 交换体、钙泵维持的动态平衡。
需要注意的是：
1、心室肌细胞处于绝对不应期时，无论给予多强刺激，心肌都不能去极化反应（包括动作电位+局部电位）。
2、生理学中把可兴奋细胞受刺激后产生动作电位的能力称细胞的兴奋性。
心室肌细胞处于绝对不应期和局部反应期时，均不能产生动作电位，故兴奋性均为零。
3、心室肌细胞的动作电位存在平台期→有效不应期特别长（从0期到3期复极化膜电位恢复到-60mV期间约200~300ms，相当于整个收缩期和舒张早期）→心肌不会发生强直收缩（而始终进行收缩和舒张交替的活动）。
兔肺静脉肌袖心肌细胞TRPC3离子流的特性
・
３ ３ ４・
中国心脏起搏与心 电生理杂志 ２ ０ １ ３年第 ２ ７卷第 ４期
兔 肺 静 脉 肌袖 心肌 细胞 Ｔ Ｒ Ｐ Ｃ ３离 子 流 的 特 性
林勇 黄 卫斌 张蓉芳 曾松 刘泰楗
［ 摘要］ 目的 采用 Ｔ Ｒ Ｐ Ｃ ３通道 特异性 阻断剂证实兔肺静脉 肌袖 细胞 （ Ｐ Ｖ Ｃ） 与左 房心肌细胞 （ Ｌ Ａ Ｃ ） 上存在 Ｔ Ｒ －
Ｐ ＜ ０ ． ０ ５） 。结论 基－ ５ 一 氰基吡啶
Ｐ Ｖ Ｃ和 Ｌ Ａ Ｃ存在 Ｔ Ｒ Ｐ Ｃ ３通道 ， 且两者 Ｉ Ｔ Ｒ Ｐ 。电流密度的差异与 Ｐ Ｖ Ｃ动作电位时程较长有关。
［ 关键 词］ 电生理学 ； 兔心脏 ； 肺静脉 肌袖心肌 细胞 ； 膜片钳制 ； 瞬 时感受器 阳离子通 道 ； 吡唑类 复合 ２ 一 氨基一 ３甲
３ ６ １ ０ ０ ０， Ｆ ｕ ｊ ｉ ａ ｎ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ； ３ Ｄ ｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍ ｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｐ ｈ ｙ ｓ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ａ ｎ ｄ Ｂ ｉ ｏ ｐ ｈ ｙ ｓ ｉ ｃ ｓ ，Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｌ ｉ ｆ ｅ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ，Ｐ ｅ ｋ ｉ ｎ ｇ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｂ ｅ ｉ ｊ ｉ ｎ ｇ
心室肌细胞动作电位的主要特点
心室肌细胞动作电位的主要特点首先，心室肌细胞动作电位由去极化和复极化两个过程五个时期组成：0 期（快速去极化期）、1 期（快速复极化初期）、2 期（平台期）、3 期（快速复极化末期）以及4 期（完全复极化期，或静息期）。
0 期去极化主要由钠内向电流(INa) 引起。
瞬时外向电流(Ito ) 是引起心室肌细胞1 期快速复极的主要跨膜电流，其主要离子成分是K+。
在2 期早期，L型钙通道介导的Ca2+的内流和IK（延迟整流钾通道）介导的K+的外流处于平衡状态，膜电位保持于零电位上下。
随着时间的推移，钙通道逐渐失活，K+外流逐渐增加，缓慢地复极，形成2 期晚期。
3 期的离子流主要是外向电流。
IK的逐渐加强是促进复极的重要因素, IK1对3 期复极也起明显作用，它在复极化至-60mV 左右时开始加强，加速了3 期的终末复极化。
4 期膜电位虽已恢复到静息水平，但并不意味着各种离子流的停息。
由于在动作电位期间发生了各种离子流，只有将动作电位期间进入细胞内的Na+和Ca2+排出细胞，而使流出细胞的K+回到胞内后才能恢复细胞内外离子的正常水平，保持心肌细胞的正常兴奋性。
其次，窦房结细胞的动作电位属慢反应电位，其动作电位形状与心室肌等快反应电位很不相同。
其特征为:动作电位去极化速度和幅度较小，很少有超射，没有明显的1 期和平台期，只有0 、3 、4 期，而4期电位不稳定，最大复极电位绝对值小。
在3 期复极完毕后就自动地产生去极化，使膜电位逐渐减小，即发生4 期自动去极化。
当去极达阈电位水平时即可爆发动作电位。
由于窦房结P 细胞膜缺乏钠内向电流（INa）通道，其动作电位0 期的产生则主要依赖ICa-L。
窦房结P 细胞缺乏Ito通道，因此其动作电位无明显的1 期和2 期，0 期去极化后直接进入3 期复极化过程，其复极化主要依赖IK来完成，IK 的激活不仅使动作电位复极，并且使之达到最大复极电位水平。
IK 的进行性衰减是窦房结细胞4 期自动去极化的重要离子基础之一,除此之外，If的进行性增强以及ICa-T也在4期自动去极过程中发挥一定作用。
离体兔肺静脉肌袖心肌细胞电生理特性
Ｌ ｕ Ｊ ｎ ｕ ，Ｌ ａ ｉ ａｆ ｎ ｉ ｕ ｈ ｉ ｉＹｕ ｎ ，Ｌ ｕ Ｔ ｉ ｇ ，Ｈｕ ｎ ｅｂ ｎ ｅ ａ ｇＷ ｉｉ’
（ ．Ｘ ａ ｅ ｈ ｎ ｓａ ｅ ｃ ｉｇＨ ｓ ｉ ｌ ｆ ｕｉｎＭｅ ｉａ Ｕ ｉｅ ｉ ， ｉ ｎ３ １ ０ ， ｕｉｎ Ｃ ｉａ ２ ｃ ｏ ｌ ｆ ｉ ｃ １ ｉｍ ｎＺ ｏ ｇｈ ｎＴ ａ ｈｎ ｏｐｔ ｊ ｄｃｌ ｎｖｒ ｔ Ｘ ａ ６ ０ ４ Ｆ ｊ ， ｈｎ ； ．Ｓ ｈ ｏ ｏ ｆ Ｓ ｉ ａｏ Ｆ ａ ｓｙ ｍｅ ａ Ｌｅ － ｅ ｅ ， ｅ ｉｇＵ ｉｅ ｉ ， ｅ ｉｇ １ ８ １ Ｃ ｉ ｓｙ ｊ ａ
（９ ５ １ ． ０±１ ６ ） ， Ｐ ５ （ ２ ４ ． ６ ｍｓ Ａ Ｄ ０ ５ ． ０±７ ９ ） ｓｖ ２ ． ０４ ． ６ ｍ ， Ｐ ９ （ ２ ． ５４８ ２ ） ． ３ ｍ ｓ（ ８ ９ ４ ３ ） ｓ Ａ Ｄ ０ １ ３ ３ ． ６ － －
ｍ ｓ（９ ６ ９ ４ ） ） 均 有 显 著 性 差 异 （ ｓｖ ６ ．５４ ．４ ｍｓ ， － Ｐ均 ＜ ．５ ； 一 定 的 刺 激 频 率 范 围 内 ， 静 脉 的 刺 激 均 能 传 导 至 左 心 ００ ）在 肺
有 钾 离 子 通 道 阻 滞 剂 ２ｍ ｌＬ氯化 铯 （ ｓ １的 台 式 液 ， 察 二 者 早 后 除 极 （ Ａ 发 生 的 可 ｍｏ ／ ＣＣ ） 观 Ｅ Ｄ）
能性 。 结 果 Ｐ Ｃ 的 Ａ Ｄ ０ Ａ Ｄ ０ Ａ Ｄ ０ 均 较 Ｌ Ｃ 长 （ Ｐ ２ （ ３ ０ － ． ４）ｐ ｓ Ｖ Ｐ ２，Ｐ ５，Ｐ ９ Ａ Ａ Ｄ ０ ２ ． ９ ４ ５ ４ ｌＳｖ
ｃｅ（ Ｖ ）ｏ ｒｂ ｉ ａ ｐｙ ｇｉｔ ｃ ｌ ｌ ｅｏｄｎ ｃ ｎｑ ｅ ｏ ｒｕｉｅｇａｓｍ ｃ ｅ ｃ ｏ ｅ ｔ ｏ ｓｒｅｔｅ ｅ ｃ ｉ ｌ ｏ － ｌ Ｐ Ｃ ｆ ａ ｂｔ ｐ ｌｉ ｒ ｅ ｕａ ｒｃｒ ｉ ｔ ｈ ｉ ｆ ｏ ｔ ｌ ｉ ｏ ｌ ｔ ｄ ， ｏ ｂ ｅｖ ｌ ｔ ｃ ｎ ｎ ｎａ ｌ ｒ ｇｅ ｕ ｎ ｓ ｒ ｅｒ ｈ ｅ ｒａ ｃ ｄ ｃｉ ｅ ｅ ｎＰ Ｃ ａ ｄｌ ｔ ｔ ｕ ａｄｏ ｙ Ｌ Ｃ ｎ ｐ ｒａｈｔｅｍ ｃ ａ ｉ ｆ ａ ｘ ｓ ａ ａ ｉ ｂ ｉａ ｏ ｒ ｉ — ｕ ｔ ｎｂ ｔ ｅ Ｖ ｎ ｆ ａｒ ｍ ｃ ｒｉｃｔ ｏ ｗ ｅ ｉ ｅ（ Ａ ）ａ ｄｔ ａ ｐ ｏ ｃ ｅ ｈ ｎｓ ｏ ｒ ｙ ｍ ｌ ｔａ ｆ ｒｌｔ ｎ ｉ ｎ ｏ ｈ ｍ ｐ ｏ ｒ ｌｉ ｌ ｉ ｏ ｇ ａ
简述心室肌细胞动作电位的特点及分期解读
心室肌细胞的动作电位分5期，即0期、1期、2期、3期和4期。
各期特征：0期为去极化过程，膜内电位由-90 mV迅速上升到+30 mV 左右。
主要是Na+内流所致.1期为快速复极初期，膜内电位由+30 mV快速降至0 mV左右，主要是K+外流所致.2期为平台期，膜内电位下降极为缓慢，基本停滞在0 mV 左右，形成平台状.此期是心室肌动作电位的主要特征,主要是Ca2+缓慢内流与少量K+外流所致.3期为快速复极末期，膜内电位由0 mV快速下降到原来的-90 mV，由K+外流所致.4期为静息期，膜电位维持在静息电位水平.此期离子泵活动增强，将动作电位期间进入细胞内的Na+、Ca2+泵出，外流的K+摄回.使细胞内、外离子分布恢复到兴奋前的状态. 1、除极过程（0期）：膜内电位由静息状态时的-90mV上升到-20mV~+30mV，膜两侧由原来的极化状态转变为反极化状态，构成了动作电位的上升支，此期又称为0期。
历时仅1~2ms。
其正电位部分成为超射。
形成机制：当心室肌细胞受到刺激产生兴奋时，首先引起钠离子通道的部分开放和少量钠离子内流，造成膜部分计划，当去极化到阈电位水平（-70mV）时，膜上钠离子通道被激活而开放，出现再生性钠离子内流。
于是钠离子顺电-化学梯度由膜外快速进入膜内，进一步使膜去极化、反极化，膜内电位由静息时的-90mV急剧上升到+30mV。
决定0期除极化的钠离子通道是一种快通道，激活迅速、开放速度快，失活也迅速。
当膜去极化到0mV左右时，钠离子通道就开始失活而关闭，最后终止钠离子的继续内流。
2、复极过程：当心室肌细胞去极化达到顶峰后，立即开始复极，但复极过程比较缓慢，可分为4期： 1）快速复极初期（1期）：心肌细胞膜电位在除极达到顶峰后，有+30mV迅速下降至0mV，形成复极1期，历时约10ms，并与0期除极构成了锋电位。
形成机制：钠离子的通透性迅速下降，钠离子内流停止。
同时膜外钾离子快速外流，形成瞬时性钾离子外向电流，膜内电位迅速降低，与0期构成锋电位。
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基金项目：厦门市科技局与卫生局联合资助的重大课题（项目编号：A000275）作者单位：厦门大学附属中山医院心脏中心（361000）通讯作者：黄卫斌E-mail:xmhuangbo@ ·基础研究·兔肺静脉心肌细胞动作电位及TRPC3类通道电流特性戴增欢黄卫斌李源刘泰槰【摘要】目的兔心房和肺静脉上的非选择性阳离子通道与TRPC3非常相似，本实验通过对兔肺静脉肌袖心肌细胞（PVC）和心房肌细胞（LAC）动作电位及TRPC3类通道电流特性的研究，进一步探讨TRPC3类通道在早后除极（EAD）中的作用及起源于肺静脉的阵发性房颤的电生理机制。
方法采用全细胞膜片钳技术分别记录PVC和LAC的动作电位及非特异性阳离子流，同时加用胰岛素，观察胰岛素对动作电位及电流的影响。
结果PVC动作电位时程较LAC的明显延长，并可以诱发第二平台反应，加用胰岛素后PVC和LAC动作电位时程均明显缩短。
通过加用GdCl3，我们在PVC和LAC上可记录到非选择性阳离子流，且PVC的电流密度较LAC的小；而如果我们加用胰岛素，PVC和LAC的电流密度均增加，且PVC的电流密度较LAC增加的少。
结论PVC较LAC的动作电位时程（APD）明显延长,表明其具有产生EAD的明显倾向，进而可能导致快速性心律失常的发生，胰岛素可明显的缩短动作电位时程。
PVC的电流密度较LAC的明显减小，PVC和LAC存在的复极离子流的差异构成了两者动作电位差异的基础；胰岛素可使电流密度增加，可初步判定PVC和LAC上存在的TRPC3类通道为TRPC3。
【关键词】兔；肺静脉肌袖心肌细胞；胰岛素；非选择性阳离子流［中图分类号］R540.4+1R541.7［文献标识码］A［文章编号］1005－0272（2011）02－113-04Characteristics of the action potentials and the channel similar to TRPC3in the cardiomyocytes from rabbit pulmonary vein sleeves Dai zenghuan,Huang weibin,Li yuan,Liu taifeng.Heart Center,XiaMen ZhongShan Hospital Affliated to Xiamen University.Xiamen,361000,China.【Abstract】Objective The nonselective cation current in cardiomyocytes from rabbit pulmonary vein sleeves （PVC）and left atrial cardiomyocytes（LAC）are similar to the channels of canonical transient receptor potiential 3（TRPC3）,we study the characteristics of the action potentials and the channel similar to TRPC3in the cardiomyocytes from rabbit PVC and LAC to investigate the role that the channels similar to TRPC3play in early after depolarization（EAD）and the ionic mechanism of the paroxysmal atrial fibrillation originated from the pulmonary vein sleeves.Methods We used the current-clamp technique to record action potential,and voltage-clamp to record ioninc currents in both PVC and LAC,then added insulin to the solution to record the effect of it to the action potentials ionic currents in both PVC and LAC.Results PVC had longer action potential duration than LAC,in addition PVC could be induced the second plateau response easily,after adding insulin the APD of PVC and LAC are both decreased.We can record nonselective caution current in both PVC and LAC by adding GdCl3, besides the current densities in PVC was significantly less than that in LAC；Also we can find after adding insulin the current densities were increased in both PVC and LAC，PVC is less than LAC.Conclusion PVC had longer action potential duration than LAC,suggesting a strong tendency of EAD genesis in PVC,then leading to induce the rapid arrhythmia.The APD can be significantly decreased by adding insulin.The current density in PVC is significantly less than that in LAC.The difference in repolarizing ionic current between PVC and LAC forms a basis of the difference in their action potential configuration;the current densities in PVC and LAC can be increased by insulin telling us that the channel similar to TRPC3existed in the PVC and LAC might be TRPC3.【Key words】rabbit;cardiomyocytes in pulmonary vein muscle sleeves;insulin;nonselective cationcurrent心房颤动是临床最常见的心律失常之一, Haissaguerre等[1]的研究证实起源于肺静脉内的局灶电活动引起了房颤的发生，肺静脉肌袖是阵发性房颤起源最主要的部分，肺静脉肌袖和左房后壁为房颤发生和维持最主要的部分，经导管电学隔离肺静脉或者消融肺静脉局灶可以根治房颤[2，3]，因此肺静脉肌袖的电生理特性的研究有助于临床对房颤的治疗。
此外，2001年，Bode等[4]研究发现非选择性阳离子通道的特异性阻断剂狼蛛毒可在兔心房上抑制因急性牵张引发的房颤,目前研究在多种心肌细胞上已经发现数种非选择性阳离子通道电流，国内丁怀玉等[5]在兔心房和肺静脉肌袖心肌细胞上发现了非选择性阳离子流，且兔心房和肺静脉上的非选择性阳离子通道与TRPC3非常相似。
本研究通过对兔肺静脉肌袖心肌细胞（PVC）和心房肌细胞（LAC）动作电位及TRPC3类通道电流特性的研究，进一步探讨TRPC3类通道在早后除极（EAD）中的作用及起源于肺静脉的阵发性房颤的离子流机制。
材料与方法1.兔心肌细胞的分离健康成年新西兰白兔，购自厦门大学医学院实验动物中心，体重1.5~2.5kg，耳缘静脉注射肝素（肝素浓度500IU/kg）抗凝，并用乌拉坦（750mg/kg）麻醉后开胸取心脏及肺组织，置于通氧的冰台式液中，剪去心包，心脏经修饰后连接在Langendorf心脏灌流装置上，经主动脉根部逆行用无钙台式液灌流（灌流压约70cmH2O，恒温37℃），边灌流边进行修剪，清楚分离出肺静脉，肺静脉肌袖位于左房与肺静脉交界处，此处有明显颜色变化，从左房的棕色变为肺静脉的白色，长度约1~2.5mm，较易辨认。
灌流至液体变清后改灌酶液，酶液反复循环灌流，至心脏膨大，松弛变软后（约7~10min）剪取心房肌细胞及位于左房与肺静脉交界处的肺静脉肌袖，放入上述酶液中37℃条件下温孵，震荡，经充分吹打，在细胞数量与质量达到最佳时收集细胞悬液放入KB液中保存（-4℃）备用。
2.膜片钳全细胞记录选取大小适中，形态完好，边缘整齐，表面无颗粒，横纹清晰，无收缩的细胞在室温下进行试验。
吸数滴细胞保存液加于1ml灌流槽中，置于倒置显微镜（TE2000-U型，日本NIKON）载物台上，细胞静置沉底贴壁8~10min，正常加钙台式液灌流清洗细胞，流速大约1.5ml/min。
微电极分部拉制，充灌电极液后电阻3~5MΩ，采用高阻封接，负压破膜，形成全细胞钳制，脉冲信号由PATCHM ASTER软件控制，经EPC10放大器（HEKA Electronic CO，德国）放大后通过Ag-Agcl电极丝和填充电极内液的玻璃微电极导入细胞，产生的电流信号经EPC-10放大器转换并存储于计算机硬盘中，供测量分析用。
在全细胞电流钳制模式下，用900pA×15ms的刺激脉冲刺激细胞，引出并记录动作电位。
在全细胞电压钳制模式下记录非选择性阳离子流时，维持电位为-40mV，持续50ms，以灭活钠通道，实验电位为-80mV至+70mV，以10mV 阶跃递增，持续时间为450ms，刺激间隔为3s。
3.胰岛素对动作电位及通道电流的影响记录肺静脉肌袖心肌细胞的动作电位和非选择性阳离子流，并与左房心肌细胞进行比较，记录过程中加用0.1mmol/L GdCl3（一种非特异性阳离子通道的阻断剂）及胰岛素（2μmol/L）观察动作电位及电流的变化。
4.溶液与试剂用于分离细胞的无钙台式液（mmol/L）：NaCl 136.9、KCl5.4、NaHCO311.9、MgCl20.53、NaH2PO4 0.33、HEPES5、Glucose10，用95%O2，5%N2饱和，用NaOH将PH调至7.35。