小鼠脾细胞培养实验
[整理版]小鼠脾细胞的体外培养及形态观察
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小鼠脾细胞的体外培养及形态观察黄殿玲,李核,何文琴,李霞,杨佩,王纯摘要：用组织块法和冷消化法对小鼠脾细胞在含血清培养液中进行原代培养,并对正常细胞形态进行观察。
结果表明组织块法和消化法培养可获得比较均一、稳定的细胞群,细胞呈典型的成纤维形态。
关键字：脾细胞原代培养形态多细胞生物的细胞可以分离出来，在适宜的培养液以及培养箱中存活，并在一定的时间内，保持其形态、生理、生化特性，经过一定时间还可以观察到一定量的细胞。
直接从身故体内分离的细胞，如小鼠的脾细胞，在体外培养的过程中尚未发生细胞分裂、增殖的细胞即为原代培养细胞；原代培养细胞在一定条件下可以继续增殖，在数量上大量扩增，此时的细胞为继代培养细胞。
在生物体内或体外，正常的细胞只能分裂一定的次数，然后停止分裂，最终死亡。
这一过程称为衰老，此为正常的现象。
只有细胞被转化后，细胞可以无限增殖，就称为细胞系/株。
细胞培养基要满足细胞的生长需要，包括pH、渗透压、营养和生长因子等，已保证细胞的增殖。
细胞培养皿是特殊制造的使细胞可以贴壁。
这就要为细胞的培养创造适宜的环境，使细胞更容易存活或生长。
细胞培养箱常指二氧化碳培养箱。
它可以提供合适的温度和二氧化碳浓度。
二氧化碳和培养基中的缓冲系统共同作用，保持细胞培养液的酸碱度。
超净台通过将空气进行过滤，为细胞培养的各种操作提供了一个干净的环境，使细胞培养免于细菌和真菌的污染。
在细胞原代培养的操作过程中，这个设备是必要的，细胞本来就比较易感染，不易存活，在空气中，以及人体表面存在许多易感染细菌，所以为了提高细胞的存活率，一定要保持操作过程干净，无污染。
细胞培养是细胞生物学研究的中心技术。
通过细胞培养可以观察研究细胞的某些生理特性，同时在体外进行细胞培养，也打破了以往的细胞只能在生物体内增殖、分裂。
其特点包括：大量实验材料；单一、纯粹细胞类型培养基的成分可控，即生长条件可控/全合成、无血清培养基；易于观察；易于操作。
1 材料与方法1.1 实验材料取出生一周的小鼠，采用颈椎脱臼的方法牺牲小鼠。
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；【实验原理】A.细胞培养细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。
当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。
传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。
但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。
被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。
因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。
细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。
小鼠脾细胞分离+CFSE染色步骤
小鼠脾细胞分离+CFSE染色步骤小鼠脾脏淋巴细胞分离与CFSE染色步骤实验材料：小鼠1只、组织剪1把、镊子2把、75%酒精、小鼠固定板、1640培养液（10%FBS，1%双抗）、含0.1%FBS的PBS溶液（无菌）、PBS溶液（无菌）、ACK溶液（无菌）、移液管、枪头、组织研磨棒（无菌）、12孔细胞培养板、15mL离心管、300目尼龙网（无菌），细胞计数板，手术台布。
实验前准备工作：做好上述实验器具的灭菌工作；将手术台布裹在小鼠固定板上，喷75%酒精，组织剪和镊子用75%酒精浸泡后置于生物安全柜中紫外照射30min；实验步骤：1. 取一只6-8周小鼠颈椎脱臼处死后，将其全部浸泡于75%酒精中5min。
2. 取出小鼠将其固定于固定板上，用组织剪和镊子沿小鼠腹白线剪开腹腔，拨开小肠在腹腔左上方紧贴小肠部位取褐红色长条型脾脏，用组织剪剪开筋膜同时不要把脾脏剪破，将取下的脾脏用PBS冲洗两遍，剪去脾脏上连接的结缔组织。
3. 将脾脏转移入组织研磨棒中，向其中加入2mLPBS溶液后研磨三下，尽量不残留较大组织块；再用3ml PBS冲洗研磨棒后，将脾脏研磨液经300目尼龙网过滤至15mL离心管中，再用2ml PBS冲洗研磨器内壁，同样过滤至15mL离心管中，离心500g，5min。
4. 弃上清后，加入2mL 常温ACK，轻微吹打，裂解红细胞1min 后加入等体积（2mL）PBS 终止裂解，轻微吹打细胞混匀后离心500g，5min。
CFSE染色开始：5. 弃上清，用4ml PBS（0.1%FBS）重新混匀细胞，反复吹打为单细胞悬液，再用300目尼龙网过滤。
取10μL细胞液于细胞计数板上计数，并将细胞浓度调至1.0×107/ml。
6. 提前将CFSE按照说明书配成5mM母液并2ul分装储存于-80冰箱备用，其工作浓度为0.5-25μM.7. 分出一部分细胞加入24孔板中，用于做CFSE空白对照8. 2μlCFSE + 6ml浓度1.0×107/ml的细胞，工作浓度约为1.67μM，37℃，10min，避光。
小鼠脾细胞原代培养及染色法鉴定细胞死活
姓名刘睿实验题目小鼠脾细胞原代培养及染色法鉴定细胞死活科目细胞生物学实验系年级2012级生科2班学号201200140063同组者马俊才日期2012.04.02【实验目的】1.回顾细胞培养的有关知识；2.学习小鼠脾细胞的分离技术及简单的细胞培养技术3.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；4.了解细胞原代培养的基本方法及操作过程；5.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；6.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；7.学习实验过程的详细描述及实验记录。
【实验原理】1.细胞原代培养原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
是用无菌的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体内进行培养，使其不断生长、繁殖，人们借以观察细胞生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点培养条件易改变和控制便于单因子分析便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察在生物学的各个领域如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等已被广泛应用。
细胞培养的局限性在脱离机体复杂环境下细胞培养条件与躯体环境有一定距离观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况细胞培养得到的产物少。
2.染色法鉴别细胞死活细胞死活的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。
染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。
解刨小鼠提取脾细胞实验报告
解刨小鼠提取脾细胞实验报告
解刨小鼠提取脾细胞实验报告
一、实验目的
本实验旨在通过解刨小鼠，提取脾细胞，以便进行后续的免疫学研究。
二、实验材料和仪器
1. 实验材料：小白鼠、生理盐水、70%乙醇、福尔马林、石蜡等。
2. 实验仪器：手术刀、注射器、组织培养皿、显微镜等。
三、实验步骤
1. 解剖小白鼠：将小白鼠放入无菌条件下，用70%乙醇消毒表面。
然后用手术刀在胸部进行切口，打开胸腔，找到心脏，将心脏割断。
接
着将小白鼠向上抬起头部，用手术刀在颈部进行切口，打开颈部皮肤
和肌肉层，在颈动脉两侧夹住气管和食管，并清除周围组织。
最后将
气管和食管割断，并将颈动脉及其分支全部割断。
2. 取出脾脏：用注射器注入生理盐水，将脾脏从周围组织中分离出来，然后将脾脏放入组织培养皿中加入生理盐水洗涤。
3. 细胞处理：将清洗干净的脾脏放入福尔马林中固定30分钟，再用酒精和石蜡等物质进行包埋。
最后用显微镜观察并提取细胞。
四、实验结果
通过本实验，成功地解剖出小白鼠，并提取了脾细胞。
经过显微镜观察，我们可以看到细胞形态正常，并且数量充足。
五、实验注意事项
1. 实验操作要求严格无菌。
2. 解剖小白鼠时要保持手术刀的锋利度。
3. 在取出脾脏时要注意不要损伤其结构。
4. 细胞处理过程中要避免污染。
六、实验结论
通过本实验，我们成功地解剖了小白鼠并提取了脾细胞。
这为后续的免疫学研究奠定了基础。
同时，在操作过程中也需要注意无菌和仪器使用等方面的细节。
小鼠脾细胞原代培养,死活细胞鉴定
小鼠脾细胞原代培养,死活细胞鉴定山东大学实验报告山东大学实验报告 2013年6月8日姓名陈少坤系年级 2011级生科2班同组者张劲松王洪善科目细胞实验题目小鼠脾细胞原代培养，死活细胞鉴定一、前言细胞培养的概念:多细胞生物的细胞可以被分离出来，然后在体外特殊培养环境中继续存活，并保持其生理、生化特性直接从生物体分离出来，在体外培养过程中尚未分裂、增殖的细胞，称为原代培养细胞。
原代培养细胞在一定条件下可以继续增殖，在数量上大量扩增，这时就成为继代培养细胞。
细胞培养基要满足细胞的生长需要，包括 pH、渗透压、营养和生长因子等，已保证细胞的增殖。
细胞培养皿是特殊制造的使细胞可以贴壁。
细胞培养箱常指二氧化碳培养箱。
它可以提供合适的温度和二氧化碳浓度。
二氧化碳和培养基中的缓冲系统共同作用，保持细胞培养液的酸碱度。
超净台通过将空气进行过滤，为细胞培养的各种操作提供了一个干净的环境，使细胞培养免于细菌和真菌的污染。
细胞培养特点:大量实验材料单一、纯粹细胞类型培养基的成分可控，即生长条件可控/全合成、无血清培养基易于观察易于操作，改造活细胞必需通过控制物质进出细胞膜来保持内部生理环境的稳定性。
细胞死后，细胞膜通透性发生改变，原先不能进入细胞的物质也能够进入细胞。
台盘蓝染料正常情况下被活细胞阻拦在细胞膜外，只有细胞膜受损或者细胞死亡后，才能进入细胞。
因此，活细胞一般不能被台盘蓝染色，而死细胞会被染成蓝色。
伊红和苏木精是最常用的细胞染色剂。
山东大学实验报告山东大学实验报告二、实验目的回顾细胞培养的有关学习分离小鼠脾细胞的技术学习悬浮细胞的计数学习简单的细胞培养技术学习实验过程的详细描述及实验记录三、实验用品试剂:小鼠，70%酒精，蒸馏水， PBS, 细胞培养液，台盘蓝，伊红溶液仪器解剖盘，镊子，剪子，盖玻片，载玻片，显微镜，吸管，血细胞计数器四、实验步骤一、原代培养1.采用颈椎脱臼的方法牺牲小鼠。
2.将小鼠浸泡在 70%酒精中几分钟。
磁珠分离小鼠脾脏nk细胞的具体方法
磁珠分离小鼠脾脏nk细胞的具体方法下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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2. 细胞分离试剂盒。
脾细胞提取实验报告
一、实验目的1. 学习掌握脾细胞提取的基本原理和方法。
2. 熟悉无菌操作流程，提高实验操作技能。
3. 了解脾细胞在免疫学研究中的应用。
二、实验原理脾脏是人体重要的免疫器官，其中含有丰富的免疫细胞，如B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞等。
脾细胞提取实验旨在从脾脏中获取这些免疫细胞，为后续的免疫学研究和实验提供材料。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：成年小鼠、胰蛋白酶、Hanks平衡盐溶液（HBSS）、FBS、离心管、吸管、解剖显微镜、手术刀、镊子、剪刀、无菌操作台等。
2. 实验仪器：细胞培养箱、低温离心机、细胞计数仪、显微镜等。
四、实验步骤1. 小鼠麻醉与解剖- 将小鼠置于解剖显微镜下，用麻醉剂将其麻醉。
- 小心切开小鼠腹部皮肤，暴露脾脏。
- 使用手术刀将脾脏从体内取出。
2. 脾细胞制备- 将脾脏置于Hanks平衡盐溶液中，轻轻漂洗去除杂质。
- 使用剪刀将脾脏剪成小块，放入装有胰蛋白酶的离心管中。
- 将离心管置于37℃水浴中消化10-15分钟，期间轻轻摇动。
- 停止消化后，用吸管将消化后的脾细胞悬液转移至新的离心管中。
- 1000g离心5分钟，弃去上清液。
- 加入适量的FBS，重悬细胞，制成脾细胞悬液。
3. 细胞计数与纯度鉴定- 使用细胞计数仪对脾细胞悬液进行计数，计算细胞总数。
- 取少量脾细胞悬液，进行染色（如台盼蓝染色），在显微镜下观察细胞活力和纯度。
4. 细胞培养- 将脾细胞悬液接种于细胞培养瓶中，放入细胞培养箱中培养。
- 定期观察细胞生长情况，记录细胞生长曲线。
五、实验结果1. 脾细胞悬液经离心后，上清液清亮，细胞沉底。
2. 细胞计数仪显示细胞总数为1.5×10^7个。
3. 台盼蓝染色结果显示细胞活力约为90%。
4. 细胞培养过程中，细胞生长良好，呈典型的淋巴细胞形态。
六、实验讨论1. 脾细胞提取实验过程中，无菌操作至关重要，应严格遵循无菌操作规程。
2. 胰蛋白酶消化脾细胞时，消化时间不宜过长，以免损伤细胞。
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山东大学实验报告
2011年3月30日
姓名 张行润 系年级 2009级生科4班 学号 同组者 张少华
科目 细胞生物学实验 题目 小鼠脾细胞培养实验 仪器编号
105
一、 实验目的
了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。学习细胞计数、营养液的配制等，初步
掌握无菌操作方法。
二、 实验原理
(一) 细胞原代培养
原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到
第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或
器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生
长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、
氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度
与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。
(二) 细胞死活鉴定
死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的
细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应
机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。
染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，
或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：
死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和
屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。常
用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴
离子型染料，不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细
胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。
死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种
无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具
有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的
酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，
使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。
除此之外，还有一些细胞器的专有染料。如液泡系的专有染料中性红。中性红是一
种低毒性染料，可以使活细胞液泡着红色，而细胞质和细胞核不被着色；死细胞的液泡
不被着色或浅染，染料弥散于整个细胞中，细胞核和细胞质被染成红色。有时侯为了增
加染色效果可以将两种染料结合使用，如甲基蓝-中性红混合染色法。
三、 实验器材
剪子，棉球，75%酒精，移液枪，无菌操作台，正置光学显微镜，倒置光学显微镜， 解
剖盘，滴管，离心管，离心机，注射器，Eppendorf管，培养皿，酒精灯，塑料培养皿，
载玻片，盖玻片，血细胞计数板等。
四、 实验材料
小鼠1只，细胞培养液（含生长因子），Trypen Blue染液，PBS缓冲液，
五、 实验步骤
(一) 细胞的原代培养
1. 取材：
取小鼠一只，采用断头法处死。清水洗小鼠浸入75%酒精中消毒3min，取出转入超
净工作台内的解剖盘中，无菌操作打开腹腔，取出其脾脏，除去其周围的脂肪组织，并
用PBS液自上而下淋洗1-2次，转入无菌培养皿中待用。
2. 分离脾细胞：
用滴管向培养皿中注入30滴PBS缓冲液，再用’L’型针头注射器在皿中吸取0.2
毫升PBS液注入脾脏，注射时沿长轴注射。然后再用针头在脾脏上扎眼，并用’L’型针
头轻轻刮出脾细胞。在均匀吹匀脾脏细胞。
吸取上述分离的单个脾细胞悬液，放入Eppendorf管中，使量至1mL，以1000r/min
离心5min。
3. 培养脾细胞：
取塑料培养皿一套，用移液枪吸取培养液2mL加入塑料皿中，并将皿标记待用。取
离心后的Eppendorf管，弃去上清液，用移液枪（200ul）吸取塑料皿中的培养液400ul
加入弃去上清的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，吸取200ul脾细胞悬液接
种于上述塑料皿中，混匀后放入37°C，5%CO2的培养箱中培养。
(二) 细胞死活鉴定及计数
1. 试剂配制：用生理盐水配成5%Tyrpen Blue染液，备用。
2. 染色计数：
取0.5mL细胞悬浊液放入试管中，加入1-2滴染液。混合。2-5min后将细胞放在血
细胞计数板上观察死活情况，注意不要有气泡产生，放大倍数
为10x10。染色后活细胞不着色，死细胞显示蓝色。注意染色
时间不能超过15min，否则染液将细胞毒杀。
3. 计数：
在10x10倍的显微镜下观察，计算血细胞计数板的4个4
小方格的细胞数量。包括细胞总数与死细胞数量。压线者计上
不计下，计左不计右。
4. 计算细胞活力：
根据公式：
图1.血细胞计数板示例图
六、 注意事项
1、严格进行动物消毒，需用75%酒精消毒。
2、严格进行无菌操作，防止细菌、霉菌、支原体污染，避免化学物质污染。
3、吸取液体前，瓶口和吸管硬行火焰消毒；吸取液体时，避免碰撞。
4、离心管入台前，管口、管壁应消毒。
5、实验者离开超净台时，要随时用肘部关闭工作窗。
6、器材使用时既要注意用火焰消毒，又要防止烫伤、烫死细胞。
七、 实验结果
本次试验中计数所用材料为培养1-2周后的小鼠脾细胞，培养液呈粉红色，且未被
染菌，说明原代细胞培养过程中小鼠脾细胞得到增殖，部分营养物质和其生存所必须的
物质被消耗掉。
本次试验采取的是Tyrpen Blue染液，活细胞不会被染色而呈无色，死细胞会被其
染色而呈蓝色，在光学显微镜下以10×10的倍数来观察得细胞总数和活细胞数，可由公
式计算出细胞活力。
图2：细胞Trypen Blue染色后图片（10x10）
下面是我们小组的实验结果：
表1：总细胞数和活细胞数统计表（10×10）
计算得其细胞活力为20.7%
八、 分析总结
本次实验中我们小组所测细胞活力为20.7%，并不算高，分析得应有以下原因可能影
响实验结果（包括误差）：
a) 若在无菌操作的过程中操作不规范，导致染菌，会极大的影响观察，导致实验失
败；
b) 若在离心分离呈单细胞的过程中离心机转速过快或时间过长很可能会导致细胞
破裂，导致小鼠脾细胞大量死亡；
c) 染色时间过长，或观察时间过长都会导致染色试剂将细胞杀死，使细胞活力骤降，
这是导致细胞活力比较低的重要原因；
d) 实验中的一些操作不正确或不规范的情况、计算带来的误差等也会直接导致实验
误差。
项目 总细胞数 活细胞数 细胞活力
1 114 23 20.2%
2 117 25 21.4%
3 148 30 20.3%
4 100 21 21.0%
总计 479 99 20.7%