DNA序列分析
DNA序列分析
符号 G A T C R Y M K S W H B V D N
含义 G A T C G or A T or C A or C G or T G or C A or T A or C or T G or T or C G or C or A G or A or T G or A or T or C
• 功能位点又称为功能序列（functional sequence）、序列模式（motif）、信号（signal） 等。 • 核酸序列中的功能位点包括转录因子结合位点、 转录剪切位点、翻译起始位点等。 • 在蛋白质序列分析中，常使用序列模式这个名词， 蛋白质的序列模式往往与蛋白质结构域或者作用 部位有关。
功能位点示意
• 基因组序列中若干个相邻的功能位点组合 形成功能区域（functional region）。 • 功能位点分析的任务
– 发现功能位点特征 – 识别功能位点
1、利用共有序列搜索功能位点
• 共有序列（consensus）又称一致性片段
– 共有序列是关于功能位点特征的描述，它描述 了功能位点每个位置上核苷酸进化的保守性 例如: NTATN
单链上A和T、C和G的 出现频率相近。
单链上A和T、C和G的出现频率相近的解释
两联核苷酸频率
• 不同基因组中两个连续核苷酸出 现的频率也是不相同的 • 4种核苷酸可以组合成16种两联 核苷酸
对酵母基因组 两联核苷酸的 统计结果 其中核苷酸对 出现频率最高 的达到0.119
而出现频率最 低的只有 0.028
– 出现频率各为0.25。
• 而真实基因组的核苷酸分布则是非均匀的
核苷酸
A C G T
频率
0.3248693727808 0.1751306272192 0.1751306272192 0.3248693727808
DNA序列分析
第七章 DNA序列分析DNA的一级结构决定了基因的功能，欲想解释基因的生物学含义，首先必须知道其DNA 顺序。
因此DNA序列分析(DNA sequencing)是分子遗传学中一项既重要又基本的课题。
1986年由美国学者提出的，目前正在实施的人类基因组计划(human genome project)，则是要通过对人类基因组3×109bp全序列的序列分析和人类基因的染色体图谱制定达到了解其结构，认识其功能，即从分子遗传学水平来认识人类自身的结构和功能特征的目的。
核酸的核苷酸序列测定方法已经过近20年的发展，因而测序的具体方法五花八门、种类繁多。
但是究其所依据的基本原理，不外乎Sanger的核酸链合成终止法及Maxam和Gilbert的化学降解法两大类。
虽然原理不同，但这两种方法都同样生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或多种残基上。
由于DNA链上每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，因而上述每一组产物都是一些寡核苷酸的混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA片段上的位置所决定。
然后在可以区分长度仅相差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道之上，即可从凝胶的放射自显影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。
以下分别介绍。
1、Sanger的双脱氧链终止法这是1977年由英国剑桥大学分子生物学实验室的生物化学家Sanger（桑格）等人发明的，是一种简单快速的DNA序列分析法，利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸序列。
它的基本原理是：利用DNA聚合酶的两种酶促反应的能力。
第一是，DNA聚合酶能够利用单链的DNA作模板，准确地催化合成出DNA互补链。
实际上这是DNA在体外进行的复制过程。
第二是，DNA聚合酶能够利用2′，3′-双脱氧核苷三磷酸作底物，使之掺入到寡核苷酸链（由几个核苷酸组成的核苷酸链叫做寡核苷酸链）的3′末端，从而终止DNA链的生长。
DNA序列分析 doc
DNA序列分析引言DNA（脱氧核糖核酸）是生物体内负责遗传信息传递的分子，其中包含有机体基因的序列。
DNA序列分析是通过对DNA序列进行计算和统计分析，来揭示其中的信息和模式的过程。
DNA序列分析在生物学、遗传学、进化学以及疾病研究等领域中有着重要的应用和意义。
本文将介绍DNA序列分析的几个主要方面，包括DNA序列的基本概念、序列比对、序列重复性分析以及序列模式识别等内容。
DNA序列的基本概念DNA序列是由由四种碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鳞状嘧啶）构成的字符串，它们的顺序决定了生物体中的遗传信息。
DNA序列可以通过实验方法（如测序技术）或计算方法（如基因组学和转录组学）获取。
序列比对序列比对是比较两个或多个DNA序列之间的相似性和差异性的过程。
序列比对可以帮助我们理解DNA序列之间的相关性，发现基因的保守区域和变异位点，以及预测蛋白质结构和功能。
常用的序列比对算法包括全局比对算法和局部比对算法。
全局比对算法（如Needleman-Wunsch算法）适用于较为相似的序列，而局部比对算法（如Smith-Waterman算法）则适用于相似性较低的序列。
序列重复性分析序列重复性是指DNA序列中出现的重复模式。
序列重复性分析可以帮助我们识别基因组中的重复区域、转座子和重复序列。
重复序列在基因演化、基因组结构和疾病研究等方面起着重要的作用。
常用的序列重复性分析方法包括重复序列的寻找和分类、序列间重复比较以及重复序列的起源和进化分析等。
序列模式识别序列模式识别是通过寻找DNA序列中特定的模式或模板，来揭示序列中隐藏的信息。
序列模式识别可以帮助我们发现DNA序列中存在的转录因子结合位点、启动子序列以及编码区域等。
常用的序列模式识别方法包括正则表达式、隐马尔可夫模型和机器学习算法等。
结论DNA序列分析是生物科学中重要的研究领域，通过对DNA 序列的计算和统计分析，可以帮助我们深入理解基因组的结构和功能，揭示生物体间的亲缘关系，以及研究基因组变异和疾病相关的遗传因素。
DNA序列分析和基因功能预测
DNA序列分析和基因功能预测随着生物学的发展和深入研究，通过DNA序列分析和基因功能预测，我们可以深入了解组织、细胞和个体发生的各种生物学变化和生理现象，并更好地探索生命的奥秘。
一、DNA序列分析DNA序列分析是指对DNA片段进行识别和描述的一种技术手段。
这种技术最早是通过手动测序的方法进行研究。
随着计算机技术的发展，现在可以利用自动化技术进行大规模的DNA序列测序，大大提高了研究效率。
DNA分析的数据来源主要是测序技术产生的数据，这些数据需要经过预处理、数据清洗、质量控制和数据归一化等一系列的筛选和加工，以便进行下一步的分析。
在DNA序列分析中，存在着大量的技术和方法，比如基本的搜索算法、序列比对、motif分析、信号的预测和模型处理等。
例如，序列比对技术可以比对不同物种中相同的DNA序列，这有助于验证基因的结构和功能；motif分析可用于发现DNA序列中的顺序模式，以及对DNA序列中的相同重复序列进行分析。
二、基因功能预测基因功能预测是指通过DNA序列分析，预测基因产物的生物学功能，即锁定引起生物学功能的基因特征，并探究其产物的功能。
RNA序列排列和基因表达分析是基因功能预测的两种基本方法。
RNA序列排列是指利用全基因组或全转录组的信息来预测基因或转录本的功能。
基因表达分析是指通过分析不同物种或不同个体之间的基因表达模式，发现组织、器官和细胞生物学功能方面的变化。
在基因功能预测中，还有很多基于生物学背景的方法可以使用，比如互作网络分析和GO富集分析。
互作网络分析可以探究不同的基因之间的相互关系，并在此基础上推断其生物学功能。
而GO 富集分析则可以对基因间的功能进行归纳，从而更好地了解基因的生物学功能。
需要说明的是，DNA序列分析和基因功能预测虽然是两种不同的技术手段，但它们是相辅相成的。
DNA序列分析提供了基础数据，但基因的生物学功能由其产物的生物学特征决定。
因此，DNA序列信息必须结合基因或转录本的功能信息，才能更好地了解生物的生理生化过程。
DNA序列分析-东南大学生物信息学实验室
第五章 DNA序列分析对于DNA序列分析，除了序列比较之外，我们最关心的就是从序列之中找到基因及其表达调控信息。
寻找基因牵涉到两个方面的工作，一是识别与基因相关的特殊序列信号，如启动子、起始密码子，通过信号识别大致确定基因所在的区域。
另一个工作是预测基因的编码区域，或预测外显子所在的区域。
然后结合两个方面的结果确定基因的位置和结构。
绝大部分基因表达调控信息隐藏在基因序列的上游区域，在组成上具有一定的特征，可以通过序列分析识别这些特征。
本章主要讨论如何分析DNA序列中的信息，着重介绍功能位点分析和基因识别方法。
第一节DNA序列分析步骤和分析结果评价在DNA序列中，除了基因之外，还包含许多其它信息，这些信息大部分与核酸的结构特征相关联，通常决定了DNA与蛋白质或者DNA与RNA的相互作用。
存放这些信息的DNA片段称为功能位点，如启动子（Promoter）、基因终止序列（Terminator sequence）、剪切位点（Splice site）等。
在实际应用中，对于DNA序列需要根据不同的要求进行不同的处理，不存在一个通用的序列分析方法。
但是由于分析的对象都是DNA序列，并且在绝大部分情况，待解决的问题可以归纳为序列特征识别或者序列模式识别问题，目标是寻找基因及其表达调控信息，因而可以给出一个基本的DNA 序列分析方案。
（1）发现重复元素。
这是重要的一步，因为重复元素会给DNA序列分析带来许多问题。
例如，由于重复元素的存在，在搜索数据库时可能得到许多同样的结果，这些结果的得分很高，使解释数据库搜索结果变得复杂、困难。
所以一般先寻找并屏蔽重复的和低复杂性的序列，然后寻找基因以及与其相关的调控区域。
（2）数据库搜索。
通过数据库搜索，发现相似序列或者同源序列，根据相似序列具有相似结构及相似功能的原理，通过类比，得到关于待分析序列的初步信息，指导详细的序列分析。
例如，如果通过搜索发现待分析的序列与EST或已知的蛋白质编码序列相似，则可以推测待分析的序列是基因序列。
4DNA序列分析
Clustal输入多个序列
快速的序列两两比对，计算序列间的 距离，获得一个距离矩阵。
邻接法(NJ)构建一个树（引导树）
根据引导树，渐进比对多个序列。
第一步：输入序列文件
第二步：设定比对参数
参数设定窗口
0：碱基不匹配； 1：碱基完全匹配
第三步：开始序列比对
第四步：比对完成，选择保存结果文件的格式
Blastn---1
Blastn1的作用： ①对于已知的基因，可以分析其相似基因； ②对于未知的基因片段，可以分析其属于什么基因。
描述以表格的形式呈现（以匹配分值从大到小排序） Accession下程序比对的序列名称，点击相应的可以进入更为详细的map viewer Descriptions下是对所比对序列的简单描述 Max score匹配分值，点击可进入第四部分相应序列的blast的详细比对结果 Total score总体分值 Query coverage覆盖率 E value——E（Expect）值 Max ident——匹配一致性，即匹配上的碱基数占总序列长的百分数。 Links——到其他数据库的链接。
可直接查看所在ORF对应的 蛋白质的对数据库的比对
单击，详细查看一个ORF。进一步 确定ORF是否正确需要借助Kozak规 则。
Kozak规则
Kozak序列是存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的 起始中有重要作用。
Kozak序列 位于真核生物mRNA 5’端帽子(m7GPPPN)结构
Expect是输入序列被随机搜索出来的概率，该值越小越好。 Identities是相似程度，即输入序列和搜索到序列的匹配率 Gaps就是空白,即比对序列只有一条链上有碱基 strand=plus/minus即询问序列和数据库里面序列的互补链匹配
DNA序列分析
K
W
P
W
V
H
T
Q
*
D
E
C
*
I
S
R
使用DNASTAR软件的Editseq模块，可进行序列的 多种变换。
四、限制性酶切位点分析
限制性内切酶（restriction endonuclease）
展示DNA序列的酶切位点图 可选择限制性内切酶
在线平台NEBcutter V2.0
/NEBcutter2/index.php
常规的PCR引物设计实例
使用BLAST、DNASTAR、PRIMER 5.0等网络 和软件平台。步骤： 序列查找和下载。NCBI网站检索。 序列同源性比较。寻找同源保守区域。 引物设计与筛选。
引物的加工与修饰。
引物的评价与分析。
引物的合成与PCR实验。
1、Primer 5.0使用介绍
PCR反应循环
PCR反应体系
模板：DNA
引物：P1，P2 DNA聚合酶：Taq 原料：dNTP 反应缓冲液：Buffer 辅助因子：Mg2+
Taq
Mg2+ P1 dTTP P2 dCTP dGTP
dATP
引物（primers）
引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物
与目的区域一条DNA模板链互补，另一个引物与目
一、测序仪测序
Sanger双脱氧链终止法
二、测序结果文件的判读
ABI文件
Seq文件
Chromas
序列分析常 用软件：
Bioedit Clustal W, X DNASTAR Genedoc Vector NTI
Chromas软件：
打开ABI文件，可检测测序的质量好坏。 无杂峰、无套峰，信号强度正常。
生物信息学中的DNA序列分析方法与工具介绍
生物信息学中的DNA序列分析方法与工具介绍DNA序列分析是生物信息学领域中的重要研究内容，通过对DNA序列进行分析可以揭示生物基因组的组成、结构和功能，为进一步的生物学研究提供了重要的信息。
本文将介绍DNA序列分析的一些常用方法和工具。
首先要介绍的是DNA序列比对方法。
DNA序列比对是将一个DNA序列与另一个DNA序列进行对比，以确定两个序列之间的相似性和差异性。
在DNA序列比对中有两种常见的方法，即全局比对和局部比对。
全局比对是将整个序列进行比对，适用于两个相似的序列。
而局部比对则是找出序列中的一个片段，与另一个序列进行比对，适用于两个不太相似的序列。
常用的DNA序列比对工具有BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）和BWA （Burrows-Wheeler Aligner）。
其次是DNA序列组装方法。
DNA序列组装是将大量的DNA 片段拼接起来，以重建原始DNA序列。
DNA序列组装是一项复杂的任务，需要解决重复片段的问题和利用辅助信息进行拼接。
目前，在DNA序列组装中常用的方法有重叠组装方法和重建图方法。
重叠组装是通过比对DNA序列片段之间的重叠区域来进行拼接，常用的重叠组装工具有SOAPdenovo和Velvet。
而重建图方法则是通过构建一张图，将DNA序列的片段作为节点，辅助信息作为边，来进行拼接，常用的重建图工具有SPAdes和ABySS。
DNA序列分析中还有一个重要的方法是序列标识和注释方法。
序列标识是将DNA序列进行标记，以便于后续的分析和注释。
常用的序列标识方法有基因预测和开放阅读框（ORF）预测。
基因预测是通过寻找DNA序列中具有编码蛋白质的基因，以确定基因的位置和功能。
而ORF预测则是通过寻找DNA序列中具有编码蛋白质的开放阅读框，以确定蛋白质编码区域。
常用的序列标识工具有GeneMark和Glimmer。
此外，DNA序列分析中还有一些其他的方法和工具。
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在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端， 使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三 磷酸核苷(ddNTP)，由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟 基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部 具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长 短不一片段的混合物。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中 掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个
序列测定的技术
经典方法:
Sanger双脱氧链终止法(Sanger,1977) Maxam-Gilbert DNA化学降解法(Maxam &Gilbert,1977)
新技术方法:
➢ 杂交测序法 ➢ 质谱法 ➢ 单分子测序法 ➢ 原子探针显微镜测序法 ➢DNA 芯片法
第一节 Maxam-Gilbert化学降解法
第三代基因组测序技术实现单分子速读
据《自然》杂志网站2月8日报道，在美国佛 罗里达州马可岛召开的“基因组生物学与技 术进展大会”上，来自加利福尼亚门洛帕克 市的太平洋生物科技公司(Pacific Biosciences)介绍了其研制的第三代基因组测 序仪，该测序仪实现了一次标记一个分子式 的单分子速读。
DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工 测序包括sanger双脱氧链终止法和maxamgilbert化学降解法。20实际80年代中期，测
序仪出现。发展至今，自动化测序已成为当 今DNA序列分析的主流。美国pe abi公司已 生产出373型、377型、310型、3700和3100 型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实 验室中使用最多的一种型号。
化学降解法：人们用专一 性作用于A、T、G、C碱基的化 学药剂分别处理经内切酶切割 而成的一定长度DNA片段，通 过控制反应时间，既可获得分 别以A、T、G、C为结尾的四组 由所有可能长度核苷酸片段组 成的DNA片段群。
除了要研究与DNA的高级 结构、DNA-蛋白质结构相关性 采用化学降解法外，对于单纯 以测序为目的的实验，普遍采 用后面所讲的酶促合成法。
最早的测序技术
测序技术最早可以追溯到20世纪50年代，早在1954年就已 经出现了关于早期测序技术的报导，即Whitfeld等用化学降 解的方法测定多聚核糖核苷酸序列。
第一代测序技术诞生
1 9 7 7年S a n g e r等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和 Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生。
碱基特异性化学切割反应： 硫酸二甲酯（DMS ）：使DNA分子中鸟
嘌呤（G）上的N7原子甲基化。 肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧
啶（C）的嘧啶环断裂；但高盐条件下， 只C断裂，而不与T反应。 哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。
在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下， 三种化学试剂按不同组合可以特异地切 割核苷酸序列中特定的碱基。
G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱 落。
G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和 G嘌呤环上的N原子质子化，利用哌啶使 A、G脱落。
T+C反应：肼（低盐） C反应：肼（高盐）
测定DNA长度~250bp。
化学裂解法测定DNA的核苷酸序列
第二节 Sanger链终止法
1977年Sanger设计了一种通过DNA复制来识别4种碱基的方 法，进行DNA序列测定，即双脱氧链终止法。
此后， 在S a n g e r 法的基础上，80年代中期出现了以荧光 标记代替放射性同位素标记、以荧光信号接收器和计算机信 号分析系统代替放射性自显影的自动测序仪。另外，90年代 中期出现的毛细管电泳技术使得测序的通量大为提高。除此 之外，这一时期还出现了一些其他的测序方法，如焦磷酸测 序法（pyrosequencing）、连接酶测序法（sequencing byligation, SBL）、杂交测序法（sequencing by hybridization, SBH）等。
第九章 DNA序列分析
第一节 Maxam-Gilbert化学降解法 第二节 Sanger链终止法 第三节 DNA片段序列测定的策略 第四节 核苷酸序列的生物信息分析
DNA测序（DNA sequencing，或译DNA定序）是 指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤 （A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的 （G）排列方式。确定DNA双股链上每一个独立结 构单元或碱基的确切顺序。
第二代自动测序技术 尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体
基因组到人类基因组草图等大量的测序工作，但由 于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最 理想的测序方法。经过不断的开发和测试，进入21 世纪后，以Roche公司的454技术、Illumina公司的 Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的第二 代测序技术诞生了。 与第一代技术相比，第二代测序技术不仅保持了高 准确度，而且大大降低了测序成本并极大地提高了 测序速度。使用第一代Sanger的测序技术完成的人 类基因组计划，花费了30亿美元巨资，用了三年的 时间；然而，使用第二代SOLiD的测序技术，完成 一个人的基因组测序现在只需要一周左右的时间。 由于第二代测序技术产生的测序结果长度较短，因 此比较适合于对已知序列的基因组进行重新测序， 而在对全新的基因组进行测序时还需要结合第一代 测序技术。
DNA序列的正确测定，是进行基因结构和功能分析， 绘制基因图谱、转基因检测等方面工作的重要前提。 同时DNA测序技术为快速、简捷分析蛋白序列及结 构提供了工具。
DNA测序的发展： 1953年，Watson和Crick推导出DNA双螺旋
结构；
1954年，Whitfeld发明化学降解测序法； 1972年，Berg开发DNA重组技术； 1975年，Sanger发明加减测序法； 1977年，Sanger发明双脱氧测序法； 1986年，第一台半自动测序仪出现； 2000年，Drosophila全基因组测序完成。