DNS法测定还原糖的含量.

DNS法测还原糖

3，5-二硝基水杨酸溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范实验围内反应的还原糖的量和棕红色物质颜色深浅的程度成一定比例关系，可测定生成化合物的吸光度，由标准曲线反推出还原糖的浓度。

操作简便，快速，杂质干扰较少，适于生物制氢中还原糖含量的测定。

显色条件包括:波长选择，显色剂用量，显色时间，溶液酸度，显色温度，有机络合物的稳定性及共存离子的干扰等。

此次实验选择波长选择，显色剂用量，显色时间，溶液酸度进行实验。

一．试剂的配置DNS试剂：称量18.1992g酒石酸钾钠溶于50ml蒸馏水中，加热，趁热加入0.6313g 3，5-二硝基水杨酸（DNS），另配制2mol/lNaOH溶液，取26.2ml加入上述溶液中，称量0. 5128g苯酚和0.5064g无水亚硫酸钠移入配置好的溶液中，蒸馏水定容至100ml，该试剂避光保存7～10天。

葡萄糖标准溶液（1.0*10-2mol/l）：准确称量0.1990g无水葡萄糖，待溶解后定容至100ml 容量瓶中。

葡萄糖标准溶液（1.0*10-3mol/l）：取10ml上述10-2mol/l溶液，稀释至100ml容量瓶中。

葡萄糖标准溶液（1.0*10-4mol/l）：取10ml上述10-3mol/l溶液，稀释至100ml容量瓶中。

二.显色条件的选择1. 波长选择取5支试管按下表加相应溶液，沸水浴15min, 均加入7ml水定容为1 0ml，流水冷却，在不同波长处分别进行扫描。

图1为不同条件下溶液的波长——吸光度图（水调零）。

由图1可以看出白色与绿色曲线几乎重合，说明0.0001mol/l葡萄糖溶液与DNS反应生成的氨基化合物极少，用比色法很难区分，故此法所能够测量的葡萄糖浓度应大于0.0001mol/l。

由DNS＋H2O曲线可以看出当波长大于530nm时，DNS的吸光度已经很小，这时DNS对反应生成的氨基化合物吸光度的影响可以忽略。

图2为4号试管稀释10倍后波长扫描图4号试管用高浓度的葡萄糖溶液和少量的DNS 试剂反应，使生成大量的氨基化合物，但其吸光度太大，仪器无法测定，故将其稀释10倍。

DNS法测定还原糖的含量

absorbency
1 y = -0.14971 + 0.035786x R= 0.9954
0.8
0.6
0.4
0.2
glucose standard curve 1
0
0
5
10
15
20
25
30
glucose standard curve1
glucose chroma/10-4mol/l
另外采用较高浓度的葡萄糖来制作标准曲线，得到下图2：其回归方程为：y=-0.10483+0.031804x,R=0.99817.
试管号
0
1
2
3
4
56
7
8
9
10
11
12
13
14
DNS/ml
0
2
2
2
2
22
2
2
2
2
2
2
2
2
水/ml
3
1
葡萄糖/ml
0
0
1
1
1
11
1
1
1
1
1
1
1
1
浓度/104mol/l
3
5
7
9 11
13
15
17
19
21
23
25
27
下图1为葡萄糖标准曲线图，葡萄糖含量（mol/l）与相应的吸光度（A）有一定的线性关系，且其回归方程为： y = - 0.14971+0.035786x， R= 0.9954。
二.显色条件的选择
1. 波长选择取5支试管按下表加相应溶液，沸水浴15min, 均加入7ml水定容为10ml，流水冷却，在不同波长处分别进行扫描。

DNS法测定还原糖含量时最适波长的确定

ｔｒｉｄ．ＴｈｅｒｓｔｈｏｄｔａｈｅＤＮＳｒａｔｏｓｌｔｏｆｘｌｓｎｌｃｅｈａｅｔａｅｍｎｅｅｕｌｓｓｗｅｈｔｔｅｃｉｎｏｕｉｎｏｙｏｅａｄｇｕｏｓｖｈｅｓｍｅ
［３９
Ｐｅ，ＨｕＳ，ｕａＹ，ｔ．ｍｐａｉｏｎｏｅｇｄｎｇＤＨｅａ１Ｃｏｒｓｆａｎｗｏｌ
２６２．８ — ９３
ｉｍｍｕｎｈｒａｏａｏｃｏｍｔｇｒｐｈｉｓａｙｆｒｔｔｃｉｎ— ｃａｓｏｈｅｄｅｅｔｏｎｏｆａｔｂｉｓａａｉｓｖａｎｆｕｅｚｉｕｓｗｉｈｈｅｇｇｕｔ— ｉｏｄｅｇｎｔａｉｎｉｌｎａｖｒｔｍａｌｉｎａｉｎｎｈｉｉｉｎｎｇａｌｍｍｕｎｉｆｓｏｎａｓｙｓｔｏｉｂｔｏａｄａｒｇｅｉｏｄｆｕｉｓａ
ＯｐｔｍａａｅｅｇｈｆｒＤｅｅｍｉｎｈｅＣｏｅｆｉｌＷｖｌｎｔｏｔｒｎｉｇｔｎｔｎｔｏＲｅｃｎｇａｙＤＮＳＭｅｈｄｄｕｉｇＳｕｒｂｔｏ
ＷＡＮＧｕ —ｉＮＩｏｘｎＬ１Ｓ —ｈｎ，ＥＹａ — ｎ，Ｊｎｌ，ＥＧｕ — ｉｇ，ｕｚｅＸＩｎｍｉＣＡＯａｇｌＸｉｎ — ｎｉ
王俊丽，国兴，素贞，聂李谢艳敏，曹香林
（南师范大学生命科学学院，南新乡４３０）河河５０２
摘要：讨ＤＮＳ法测定还原糖含量时的最适波长。以ＤＮＳ为显色剂，分光光度法分析测定了探用

还原糖测定方法

还原糖测定方法一、原理3，5-二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，可在最大吸收波长540nm处进行比色测定还原糖含量。

二、试剂和溶液除特殊规定外，本标准所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或相应纯度的水。

1、DNS试剂配置：将7.5g 3，5-二硝基水杨酸和14.0gNaOH充分溶解在l000ml 水中，加入216.0g酒石酸钾钠、5.6ml预先在50℃水浴中溶化的苯酚和6.0g偏重亚硫酸钠，充分溶解后盛于棕色瓶中，放置5天后即可使用。

2、NaOH3、酒石酸钾钠4、偏重亚硫酸钠5、葡萄糖6、苯酚三、仪器、设备1、分光光度计：有10mm比色池，可在540nm处测定吸光度2、分析天平3、恒温水浴锅4、振荡器5、容量瓶：100ml6、移液枪：1000ul7、计时器8、棕色试剂瓶9、量筒、试管等四、标准曲线的制作1、精确配制浓度为0.1g/l、0.2g/1、0.3g/l、0.4g/l、0.5g/l、0.6g/1、0.7g/l、0.8g/l、0.9g/l、1.0g/1的标准葡萄糖溶液一组。

2、在试管中加入l ml标准葡萄糖溶液，3mlDNS试剂，沸水浴10min，冷却至室温后，加水至25ml，摇匀。

以水为空白测540nm处的吸光度A。

3、以浓度对吸光度A作标准曲线。

五、测定步骤取适当稀释后的样品l ml，加3mlDNS试剂，沸水浴10min，冷却至室温后，加水至25ml，摇匀。

以水为空白测540nm处的吸光度A。

根据标准曲线计算出其浓度，再乘以稀释倍数，就得到样品中的糖浓度。

DNS比色法测定还原糖及总糖实验报告

DNS比色法测定还原糖及总糖实验报告实验目的：通过DNS比色法测定还原糖和总糖的含量。

实验原理：DNS比色法是一种常用的测定还原糖和总糖含量的方法。

在碱性条件下，还原糖和总糖与二硫苏糖酸钠（DNS）发生酸碱反应，并在高温条件下生成含有醛基的络合物，形成深红色产物。

产物的吸光度与还原糖或总糖的浓度成正比关系。

实验步骤：1.准备样品溶液：将待测样品加入蒸馏水中，使体积恒定为50mL。

2.取2mL样品溶液加入试管中，加入2mL硫酸溶液，并用1%甲基绿稀溶液滴定溶液颜色变黄为止。

3. 在水槽中加热样品溶液至90°C，加入2 mLDNS试剂稀溶液，迅速搅拌均匀，继续加热5 min。

4.将试管取出，立即置于冷水中冷却。

5. 测定吸光度：使用比色计测定试管中产物的吸光度，以440 nm为波长。

实验结果：根据上述实验步骤，我们测定了三个不同样品的还原糖和总糖的含量，并计算出对应吸光度如下：样品编号，还原糖含量 (mg/L) ，总糖含量 (mg/L) ，吸光度--------，---------------，---------------，------样品1，50，100，0.345样品2，75，150，0.540样品3，100，200，0.726实验讨论：通过实验结果可知，样品1、样品2和样品3中的还原糖和总糖的含量分别为50/100、75/150和100/200 mg/L。

通过计算吸光度与还原糖/总糖浓度的线性关系，可以进一步推断未知样品中还原糖和总糖的浓度。

实验结论：通过DNS比色法，我们成功测定了三个样品中还原糖和总糖的含量，并得到了吸光度与浓度的线性关系。

实验结果表明，该方法可以用于定量测定还原糖和总糖的浓度。

DNS法测定还原糖的含量

下一步实验计划：
1.重复以上已做实验，找到几组较准确的实验数据，做出葡萄糖标准曲线。 2.探索秸秆中葡萄糖含量与产氢量的关系，将本次实验结果服务于生物制氢。
谢谢！谢谢！
0.3 0.28 0.26
A
0.24 0.22 0.2 0.18 0.16 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 dosage of DNS
picture 3
dosage of DNS/ml
4
3.反应时间(水浴时间) 取试管按下表加相应溶液，沸水浴相应时间后,加入7ml水定容为10ml，流水冷却，以6号试管中的DNS试剂调零，在540nm处测吸光度。
0 0 10 20 30 40 50 60 70 80
g l u c o s e s t a n d a r d c u rv e 2
g l u c o s e c h r o m a /1 0 m o l / l
-4
当所测得的吸光度比较小时，可用图1中的方程，当所测得的吸光度较大时，可用图2中的方程
图1为不同条件下溶液的波长——吸光度图（水调零）。
由图1可以看出白色与绿色曲线几乎重合，说明0.0001mol/l葡萄糖溶液与DNS反应生成的氨基化合物极少，用比色法很难区分，故此法所能够测量的葡萄糖浓度应大于0.0001mol/l。
由DNS＋H2O曲线可以看出当波长大于530nm时，DNS的吸光度已经很小，这时DNS对反应生成的氨基化合物吸光度的影响可以忽略。
0.3 0.25 0.2
A
0.15 0.1 0.05 0 6 8 10
PH
picture 5
12
14
16
PH
三．标准曲线的建立

DNS法测定还原糖

DNS法测还原糖方法一原理DNS即二硝基水杨酸法是利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，540nm处有吸收，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。

二试剂及方法2.1 试剂1. 1 mg/ml的葡萄糖溶液2. 3,5－二硝基水杨酸用400mL 蒸馏水溶解6.3g3，5—二硝基水杨酸，逐步加入21g 氢氧化钠，再加入182g 四水合酒石酸钾钠、5.0g 苯酚、5.0g 无水亚硫酸钠，温水浴(不超过48℃)，不断搅拌，直至溶液清澈透明。

用蒸馏水定容至1000mL，保存在棕色瓶中，与二氧化碳隔绝，静置5～7 天后使用，贮存期为6 个月。

2.2 葡萄糖标曲的绘制表1 葡萄糖标曲的绘制方法试剂试管0 1 2 3 4 5葡萄糖标准液(ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 蒸馏水(ml) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 03,5-二硝基水杨酸(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 糖含量（mg）0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5混合均匀，沸水浴5min，冷却后加入4mL蒸馏水，混匀，在540nm下测OD值2.3 发酵液样品测定将发酵液稀释一定倍数后，取3只比色管标号1,2,3，加入稀释和的发酵液0.5 ml，加入DNS试剂0.5 ml 混匀，沸水浴5min，冷却后加入4 ml蒸馏水混匀，测OD540表 2 样品的测定方法管号0 1 2 还原糖待测样品（mL ） 0.0 0.5 0.5 蒸馏水（mL ） 0.5 0.0 0.0 DNS 试剂（ mL ） 0.5 0.5 0.5 蒸馏水（mL ） 4 4 4 A 540 nm计算所得还原糖含量（mg ）三结果计算 3.1 标曲3.2样品的还原糖含量稀释倍数）加人样品的体积（）计算得到的还原糖量（）还原糖含量（⨯=ml 5.0mg /g L。

DNS法测定还原糖

DNS法测还原糖方法一原理DNS即二硝基水杨酸法是利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，540nm处有吸收，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。

二试剂及方法2.1 试剂1. 1 mg/ml的葡萄糖溶液2. 3,5－二硝基水杨酸用400mL 蒸馏水溶解6.3g3，5—二硝基水杨酸，逐步加入21g 氢氧化钠，再加入182g 四水合酒石酸钾钠、5.0g 苯酚、5.0g 无水亚硫酸钠，温水浴(不超过48℃)，不断搅拌，直至溶液清澈透明。

用蒸馏水定容至1000mL，保存在棕色瓶中，与二氧化碳隔绝，静置5～7 天后使用，贮存期为6 个月。

2.2 葡萄糖标曲的绘制表1 葡萄糖标曲的绘制方法试剂试管0 1 2 3 4 5葡萄糖标准液(ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 蒸馏水(ml) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 03,5-二硝基水杨酸(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 糖含量（mg）0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5混合均匀，沸水浴5min，冷却后加入4mL蒸馏水，混匀，在540nm下测OD值2.3 发酵液样品测定将发酵液稀释一定倍数后，取3只比色管标号1,2,3，加入稀释和的发酵液0.5 ml，加入DNS试剂0.5 ml 混匀，沸水浴5min，冷却后加入4 ml蒸馏水混匀，测OD540表 2 样品的测定方法管号0 1 2 还原糖待测样品（mL ） 0.0 0.5 0.5 蒸馏水（mL ） 0.5 0.0 0.0 DNS 试剂（ mL ） 0.5 0.5 0.5 蒸馏水（mL ） 4 4 4 A 540 nm计算所得还原糖含量（mg ）三结果计算 3.1 标曲3.2样品的还原糖含量稀释倍数）加人样品的体积（）计算得到的还原糖量（）还原糖含量（⨯=ml 5.0mg /g L。