PCR实验室污染与对策
PCR实验室污染与对策
PCR实验室污染与对策PCR（Polymerase Chain Reaction）实验室是进行核酸分析和生物学研究的重要场所。
然而，由于PCR实验室使用高灵敏度的技术，可能会受到外源性DNA污染的影响，导致结果的失真甚至错误。
因此，PCR实验室污染的问题需要引起重视，并采取相应的对策来减少对实验结果的影响。
外源性污染主要指的是在实验室环境中引入外部DNA污染源。
这些污染源可能包括实验室用具（如罗氏管、管盖、显微镜片等）、实验材料（如引物、模板DNA等）、工作人员（如手部皮肤上的DNA）以及空气中的微生物等。
为了减少外源性污染，可以采取以下对策：1.消毒和清洁实验室：实验室应定期进行彻底的清洁和消毒，包括工作台、工具和设备等。
使用消毒剂对工作台和设备进行彻底的消毒，防止污染源的交叉感染。
3.使用无DNA污染的试剂和材料：选用经过严格筛选和检测的PCR试剂和材料，确保其无DNA污染。
同时，使用专门为PCR实验设计和包装的罗氏管和管盖，减少外源性DNA污染的可能。
4.严格的实验室操作规范：建立和执行严格的实验室操作规范，包括实验室的通风设施、培训工作人员、制定标准操作流程等。
工作人员应按照规范操作，遵守实验室操作规程，确保实验的准确性和可靠性。
内源性污染是指实验过程中引入的内源性DNA污染。
内源性污染通常是由前一PCR扩增反应的产物污染了下一PCR反应。
1.严格控制实验操作的顺序：按照从低到高浓度的样品进行PCR扩增。
首先进行阴性对照，检测PCR反应体系中是否存在污染。
然后进行低浓度样品的扩增，最后进行高浓度样品的扩增，以减少内源性污染的可能。
2.应用反转录酶酶和RNA不是DNA模板：在RNA模板的PCR扩增反应中，可以使用反转录酶酶将RNA转录成cDNA。
由于RNA是DNA的模板，反转录过程不会引入外部DNA污染，从而减少内源性污染的可能。
3.使用消除污染酶：在每一PCR扩增反应中加入消除污染酶，可以在扩增反应结束后对DNA污染进行降解。
PCR实验室主要污染源与防污染措施
PCR实验室主要污染源与防污染措施1. PCR实验室主要污染源（1）临床样本中存在的⼤量待测微⽣物；（2）科研中得到的质粒克隆；（3）以前分析研究的特定微⽣物；（4）⼤量存在于实验环境中的特定微⽣物；（5）以前扩增产物的残留污染。
这也是PCR实验室最容易产⽣的将造成假阳性的污染。
PCR扩增可以引起实验室中扩增产物的积累，通常，⼀次典型的PCR扩增可以产⽣10^9拷贝的靶序列，如果⽓溶胶化，甚⾄最⼩的⽓溶胶都会含有10^6拷贝的扩增产物。
如果不加以控制，在短期内累积的⽓溶胶化的扩增产物即会污染实验室中的试剂、仪器设备和通风系统，从⽽造成严重的实验室污染，出现⼤量的假阳性结果。
⼀些RNA扩增技术如基于核酸序列的扩增（NASBA）、转录介导的扩增（TMA）和Qbeta复制酶等不易产⽣扩增产物的污染，这是由于它们的扩增产物为RNA，可以被环境中的RNA酶迅速地降解。
2. 防污染措施（1）严格分区实验室及严格遵守⼯作程序基因扩增实验室分为试剂准备区、样本准备区、PCR扩增区、产物分析区等，必需备有各⾃必需的仪器设、⼯作服、⼿套、加样器和通风系统。
在每个区使⽤的试剂和废物，必需直接在其各⾃的区域内分装或包装。
操作⼈员必需注意防⽌通过他们的头发、眼睛和⾐服将扩增产物从污染区携带⾄清洁区的可能性。
（2）化学清污实验台⾯可使⽤10%的次氯酸钠（漂⽩剂）清洗，然后再⽤70%⼄醇或清⽔洗去次氯酸钠。
次氯酸钠具有氧化损伤核酸的作⽤，从⽽使可能留在实验台⾯的扩增产物被破坏掉。
要注意的是，次氯酸钠不能区分提取的DNA和PCR扩增产物，⽤次氯酸钠处理的样本不能⽤于核酸扩增检测。
在实际⼯作中，有些物品⽐如放置扩增反应管的盘必需从污染区转回清洁区时，在转回之前，应将其置于2-10%的次氯酸钠溶液中过夜，并充分冲洗。
（3）扩增产物的修饰临床PCR检测通常由3或4个步骤组成：核酸提取和扩增检测试剂的配制。
使⽤商品试剂盒时，试剂的配制量可⼤⼤减少；样本的处理即靶核酸的提取；PCR扩增；扩增产物的分析。
PCR防污染措施
PCR防污染措施PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，广泛应用于基因检测、疾病诊断和基因工程等领域。
然而，PCR试验的进行容易被外源污染影响，导致实验结果的错误解读和不准确性。
因此，为了确保PCR实验的准确性和可靠性，必须采取一系列严格的防污染措施。
首先，实验室环境的净化非常重要。
实验室应该具备洁净的条件，不受外界环境污染物的干扰。
实验室门口应设置自动门，并设有空气帘，以减少外界空气的进入。
另外，实验室内应安装高效过滤器，筛选空气中的微小颗粒和粉尘，以防止其进入实验区域。
其次，在实验操作过程中，必须遵循严格的操作规程，包括实验人员的着装要求、实验器具的清洁消毒、试剂的使用及存储等。
首先，实验人员必须穿戴专业的实验服，并佩戴带有面罩和手套的个人防护装备，以防止身体的细胞、气溶胶和细菌污染样品。
其次，所有实验器具必须经过高温和化学消毒处理，以保证实验过程中不发生交叉污染。
此外，试剂应储存于干燥、阴凉、无菌的条件下，以保持其有效性和纯度。
第三，实验材料的选择也十分重要。
实验室应选择经过质检合格的高质量实验材料，避免带有细菌、真菌或其他污染物的材料。
特别是PCR试剂盒、试剂和酶，应选择具有高纯度、无外源DNA污染和无核酸酶活性的产品，以避免试剂本身对PCR反应的污染。
此外，对实验区域的划分和操作步骤的规范也是防污染的重要措施。
实验室应根据实验需求合理划分清洁区、PCR试验区和污染区，严格实施区域间的物品和人员流动控制。
清洁区是指进行物品清洗、消毒、储存的区域；PCR试验区是指进行预PCR、PCR扩增的区域；污染区是指处理和存放PCR产物、样品的区域。
在任何情况下，这些区域都应有明确的标识和严格的操作流程，以防止交叉污染。
最后，实验过程中采取的一些技术手段也可以有效地防止PCR反应的污染。
例如，利用分光光度计和荧光传感器实时监测PCR反应，可以及时发现污染，保证结果的准确性。
此外，在PCR反应的每个步骤中都应有一个阴性对照组，以排除外源污染的影响。
PCR应用问题及对策
PCR假阴性结果是指应该被扩增的DNA序列没有被扩增出来，导致实验结果出现偏差。
详细描述
PCR假阴性问题通常是由于引物设计不当、退火温度不合适、模板浓度过低等原因引起的。为了解决 这个问题，需要优化引物设计和退火温度，同时提高模板浓度，以确保PCR实验的准确性和可靠性。
交叉污染问题
总结词
PCR交叉污染是指在实验过程中，一个样品中的DNA序列污染到了另一个样品中，导 致实验结果出现偏差。
详细描述
PCR交叉污染问题通常是由于操作不规范、实验室环境不洁净等原因引起的。为了解决 这个问题，需要采取一系列措施，如加强实验室管理、规范操作流程、定期对实验室进
行清洁和消毒等。
引物二聚体问题
要点一
总结词
PCR引物二聚体是指引物自身结合形成的二聚体结构，影 响PCR扩增效率。
要点二
详细描述
PCR引物二聚体问题通常是由于引物设计不当、引物浓度 过高、退火温度不合适等原因引起的。为了解决这个问题 ，需要优化引物设计和退火温度，同时控制引物浓度，以 确保PCR实验的准确性和可靠性。
详细描述
巢式pcr技术通过设置两对引物，先进 行外引物扩增，再进行内引物扩增， 可以增加特异性，减少非特异性扩增， 提高pcr检测的准确性。
建立多重pcr技术
总结词
建立多重pcr技术可以提高pcr检测的效率和 特异性。
详细描述
多重pcr技术可以在同一管中同时进行多个 基因的扩增，不仅可以节省时间和成本，还 可以通过同时检测多个基因来提高检测的特 异性和可靠性。
设计特异性更好的引物
总结词
设计特异性更好的引物是解决pcr技术应用 问题的重要对策之一。
详细描述
通过合理设计引物，特别是退火温度和引物 长度等参数，可以提高引物的特异性，减少
PCR实验室的污染与对策
（五）体会
PCR检测过程中，防止污染是很重要的 一项工作。只需几个DNA分子作模板就可大 量扩增，应特别注意反应体系被痕量DNA模 板污染，这是造成假阳性最大的可能。
通常我们对PCR实验室污染的预防是采 取不同操作分区进行、分装试剂、改进实验 操作等规则，对污染的处理是用稀盐酸擦拭 或浸泡、紫外线照射等。而对于实验室的通 风方面没有给予足够的重视，
PCR实验室的污染与对策
河北医科大学第三医院 冯忠军
PCR技术是一种体外核酸扩增技术， 模拟自然DNA复制过程，通过重复高温 变性、低温退火、中温延伸等简单的3 个温度循环，将靶DNA扩增数百万倍， 显示极高的敏感性。
30次循环后靶序列扩增的数量
1 cycle = 2 Amplicon
2 cycle = 4 Amplicon
将两种批号的HBV试剂拿到其他规范的PCR实 验室检测，也显示试剂没有问题。
该实验室用消毒液擦拭工作台面后， 打开所有的紫外灯照射一天，将所使用加 样器、离心管、Tip头、手套、记号笔、记 录本等都更换掉，再将标本进行检测，结 果全部标本仍然为“阳性”。
第二天，仍然用消毒液擦拭工作台面 后，再打开所有的紫外灯照射一天，将HBV 标本重新检测，同时设臵了两个阴性对照 (A和B)，
据计算，一个气溶胶颗粒可含48000拷 贝，由其造成的污染是一个值得特别重视的 问题.
三、PCR实验室污染的监测
一个好的实验室，要时刻注意污染的监 测，考虑有无污染、什么原因造成的污染， 以便采取措施，防止和消除污染.
PCR实验，不在于能否扩增出目的片段 （阳性结果）来，而是在于是不是有重复 性以及有没有设臵对照。
仅含扩增反应混合液的对照管的功能：
☻监测扩增试剂是否发生污染，具有较强的污 染鉴别性。
避免PCR实验室交叉污染的预防措施
避免PCR实验室交叉污染的预防措施PCR实验室交叉污染是一个常见但严重的问题。
交叉污染可能导致错误的实验结果，并浪费大量的时间和资源。
为了避免PCR实验室交叉污染，以下是一些预防措施：1.设立区域：按照操作流程将实验室划分为不同的区域。
例如，将制备PCR反应体系的区域和扩增反应的区域分隔开来，确保实验者在不同的区域操作。
2.空间隔离：确保设备、试剂和操作区域的有效隔离。
使用独立的PCR工作站，在每个工作站上进行不同的PCR实验，并且在不同的PCR实验之间进行清洁和消毒。
3.重复实验器具：在进行PCR实验之前，确保所有实验器具都进行彻底的清洁和消毒。
最好为每个PCR实验使用新的试剂盒和器具。
4.清洁实验台和仪器：在每次实验之前和之后，对实验台和设备进行彻底的清洁和消毒。
使用含酒精的消毒剂对实验台面、机器表面和仪器的每个部分进行清洁，并确保完全干燥。
5.使用负控制：为了确保结果的准确性，应该在每次PCR实验中设置负对照。
负对照通常是使用无DNA模板的反应体系。
这有助于排除实验中的任何污染。
6.分离样品：在进行PCR实验之前，确保每个样品都在不同的管子中操作，并在操作过程中避免将不同样品的器具接触。
每次更换样品时，应彻底清洁操作区域。
8.操作员培训和规范操作：确保所有操作员都经过PCR实验室的培训，并且了解交叉污染的风险和如何避免。
开展定期的回顾培训，以确保操作员持续遵循规范操作。
9.使用控制措施：避免使用可能产生污染的物品，例如手套、实验室衣、口罩等。
确保动作轻柔，减少颗粒物和污染的产生。
10.定期消毒实验室：除了日常清洁之外，定期对实验室进行消毒，以减少细菌和病毒的存在。
特别应关注常接触的表面，如门把手、操作台面等。
通过采取上述预防措施，实验者可以最大程度地减少PCR实验室交叉污染的风险，准确获取实验结果，并确保实验的可靠性。
PCR实验室污染的原因分析、处理及整改措施
PCR实验室污染的原因分析、处理及整改措施2022年5月29日中午12:30开始PCR实验室假阳性频率增高,考虑可能出现实验室污染，检测工作立即停止，首先，查找污染源和明确污染范围。
经排查本次实验室污染的主要来源可能是部分配置好的反应体系放置时间过久、实验室二区出现扩增产物的污染。
一、发生污染的原因分析。
1.核酸检测工作频次过高，导致每批样本检测之间没有足够时间消毒。
2、核酸检测人员短缺，检测人员需要多次往返二区、三区，极容易导致扩增产物的污染。
二、实验室污染的处理：1.生物安全柜的操作台消毒处理：使用5000mg∕L含氯消毒剂进行喷洒消毒。
消毒液需要现用现配，24小时内使用。
2.实验室台面、地面、物体表面等的消毒处理：立即使用润湿有5000mg∕L含氯消毒剂的毛巾擦拭、消毒。
清洁、消毒通风系统滤网。
采用房间固定和可移动紫外灯进行紫外照射2小时以上。
3.清理污染物时：严格遵循活病毒生物安全操作要求，采用压力蒸汽灭菌处理，并进行实验室换气等，防止次生危害。
整改措施：1.严格实验室功能分区确保实验室人、物及空气单向流动核酸检测实验室的人、物及空气流向按照试剂储存和准备区一样本制备区T扩增和产物分析区，防止扩增产物随人流、物流及空气进入扩增前的区域。
空气流向应按照从试剂储存和准备区一样本制备区一扩增区一扩增产物分析区方向空气压力递减的方式进行。
2、力口强实验室检测安全管理(1)基本要求核酸检测应当在生物安全二级实验室进行，并应在生物安全风险评估的基础上，采取适当的个体防护措施，包括手套、口罩和隔离衣等。
开展新冠病毒核酸检测的实验室应当制定实验室生物安全相关程序文件及实验室生物安全操作失误或意外的处理操作程序，并有记录。
(2)实验室前安全要求应使用2000mg∕L含氯消毒剂或75%酒精进行桌面、台面及地面消毒。
消毒液需每天新鲜配制，不超过24小时。
转运至实验室的标本转运桶应在生物安全柜内开启。
转运桶开启后，使用2000mg∕L含氯消毒剂或75%酒精对转运桶内壁和标本采集密封袋进行喷洒消毒。
动物疫病PCR检测实验室的污染与对策
动物疫病PCR检测实验室的污染与对策动物疫病PCR检测实验室是用于检测动物疫病的重要场所，它的存在对于动物疾病的检测和预防具有非常重要的意义。
实验室环境的污染问题一直存在着，如果不及时采取有效的对策，将会对实验室的工作产生严重的影响，而且还可能对实验室工作人员和动物健康造成威胁。
对动物疫病PCR检测实验室污染问题的认识和对策的制定至关重要。
1. 空气污染：实验室通常会产生大量的粉尘、细菌、病毒等微生物颗粒，这些颗粒会悬浮在空气中形成空气污染，对实验室的工作环境和动物健康造成威胁。
2. 地面污染：实验室地面可能会受到化学试剂的溅洒，或者动物排泄物的污染影响，导致地面污染的问题。
3. 设备污染：实验室中使用的设备和仪器可能会受到微生物污染，例如PCR仪、离心机等。
4. 人员污染：实验室工作人员长时间在实验室内工作，容易受到环境污染的影响，把外部的污染带入实验室。
以上污染问题如果不及时处理，将会对实验室的工作和动物健康带来严重影响。
1. 空气净化：通过安装空气净化器和通风系统，及时清除实验室内的空气污染，保持室内空气的清新。
2. 地面清洁：定期对实验室地面进行清洁和消毒，防止地面污染的问题。
4. 人员防护：实验室工作人员要做好个人防护，例如佩戴口罩、手套等，避免外部污染物进入实验室。
5. 室温控制：保持实验室的温度和湿度稳定，避免微生物的滋生和繁殖。
6. 定期检测：定期对实验室进行环境检测和微生物检测，及时发现和处理污染问题。
通过以上对策的制定和实施，可以有效解决动物疫病PCR检测实验室的污染问题，保障实验室的工作顺利进行，同时也保障实验室工作人员和动物的健康安全。
在实验室的日常管理中，还需要加强对环境污染的认识，加强实验室管理，加强人员的督导，提高实验员的素质水平，严格执行实验室卫生制度，及时排查隐患，加强清洁消毒，最大限度地减少外部环境对实验室的污染。
实验室还要加强对于环境消毒的技术研究，选择适合的消毒剂和技术，确保对于实验室内的环境进行有效的消毒，最大限度地减少污染对实验结果的影响。
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(三)PCR扩增产物污染 这是PCR反应中最主要最常见的污染问 题.因为PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检 测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物 污染，就可造成假阳就可形成假阳性.
还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染 的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就 可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管， 开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形 成气溶胶而污染. 据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而 由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.
l PCR标准反应体系 DNA模板 引物 反应缓冲液 Mg2＋ dNTP 耐热聚合酶 ddH2O
(三) 实验操作注意事项 尽管扩增序列的残留污染是造成假阳 性反应的主要原因，但样品间的交叉污染 也是原因之一。 因此，不仅要在进行扩增反应时谨慎 认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有 环节都应该注意。
6 cycle = 64 Amplicon
7 cycle = 128 Amplicon
30
难 忘 的 1995 年 ------- 被 称 之 为PCR临床检验爆炸年？
天下大乱！ 到天下大治！
但令人头痛的问题是易污染，极其微 量的污染即可造成假阳性的结果。如果形 成气溶胶污染而扩散，则可引起整个PCR实 验室的污染，处理起来非常麻烦，严重的 甚至要关闭PCR实验室。
仅含扩增反应混合液的对照管的功能： 1、监测扩增试剂是否发生污染，具有较强的污 染鉴别性。 2、如想鉴别实验室是否发生污染，可将一个或 多个空管打开静置于标本制备区30～60分钟， 然后加入扩增反应混合液，同时以水替代核酸 样本扩增，如为阳性，而上述仅含扩增反应混 合液的对照管为阴性，则说明实验室以前扩增 产物的存在。
（四）污染的排除
在确定了污染的原因后，工作人员就开始着 手排除污染，每天都打开整个PCR实验室的门窗和 排气扇，让整个实验室通风，用消毒液擦拭整个 PCR实验室，打开所有的紫外灯照射。 每隔3 d按上述步骤检测一次，一直这样处理 了一个多月，A阴性对照才转为阴性。 连续检测三次A和B阴性对照,每次结果都均为 阴ห้องสมุดไป่ตู้,才确定PCR实验室恢复正常。
（二）阳性对照的设置 PCR反应实验室应设有PCR阳性对照，它是 PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎 理论要求的一个重要的参考标志. 阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经 各种鉴定是该产物的标本，强阳性对照可产生大 量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染 源。 当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心 中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。
该实验室用消毒液擦拭工作台面 后，打开所有的紫外灯照射一天，将 所使用微量进样器、离心管、枪头、 手套、记号笔、记录本等都更换掉， 再将HBV标本进行检测，结果全部标本 仍然为阳性。 第二天，仍然用消毒液擦拭工作 台面后，再打开所有的紫外灯照射一 天，将HBV标本重新检测，同时设置了 两个阴性对照(A和B)，
出现污染后，工作人员首先考虑可能 是试剂的污染，更换新批号的HBV试剂重新 检测后，结果仍然为全部标本阳性。 将HBV标本拿到其他正规的PCR实验室 检测，结果标本中阴、阳性结果都有，阴 性对照是阴性，阳性对照是阳性，说明标 本没有被污染。 将两种批号的HBV试剂拿到其他正规的 PCR实验室检测，也显示试剂没有问题。
防止PCR实验室污染的方法
一． 污染的预防 进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些 操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或 杜绝污染的出现。 （一）划分操作区： 目前，PCR尚不能做到单人单管和实现完全闭 管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实 验操作在三个不同的区域内进行，各工作区要有一 定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。 切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他 两个工作区。
(一)标本间交叉污染: 1、收集标本的容器被污染； 2、标本放置时，由于密封不严溢于容器外； 3、容器外粘有标本造成相互间交叉污染; 4、标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪 污染导致标本间污染; 5、有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或 形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染.
(二)PCR试剂的污染: 主要是由于在PCR试剂配制过程中，由 于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR 核酸模板污染.
移液器污染是一个值得注意的问题. 尽可能用可高压处理的移液器，由于 移液器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污 染，最好使用可高压处理的移液器。
移液器的灭菌
Research移液器的下半部可拆卸下来经高温高压灭菌处理
n 121 °C，1 bar，20 分钟，灭 菌完毕后，在室温下完全晾干后 再 装上 n 10mL的移液器中的滤芯只能灭菌 一次，灭菌后略微有膨胀，但不 影响功能 n 所有的research移液器都可以 暴露于UV射线下
（二）污染的发现
2004年8月12日，该实验室按正常的操 作规程检测HBV DNA标本，同时设立了阴性 对照和阳性对照(均为试剂盒中配备)，扩 增结束分析结果时，发现HBV DNA所有的标 本及阴、阳性对照均为阳性，提示操作过 程中出现污染，但具体是什么原因引起的 污染还不清楚。
（三）污染源的追踪
PCR实验要分区进行： 所有的试剂准备在一个房间，在这个房间做 master mix，任何样本都不能带入这个房间。 所有的样本处理在另一个房间，做好master mix后在这个房间加样本。 PCR扩增反应另一个房间； PCR产物鉴定在另外一个房间。 所有工作按照这样一个顺序。
PCR反应中的对照： （1）只有master mix （2）将master mix中加入第一个房间里的水 （3）master mix中加入第二个房间的水 （4）master mix中加入处理样本时做阴性对照的水 （5）不加任何试剂和样本，只有相同体积的水。 如果（1）中有扩增条带，则是试剂污染，（2）或（3） 中有信号是各自房间中水污染，（4）中有信号是样本处理时 有污染，（5）中有信号是PCR反应过程中有污染（机器或反应 管），这样比较容易知道污染来源。
PCR实验室污染的监测
一个好的实验室，要时刻注意污染的监 测，考虑有无污染、什么原因造成的污染， 以便采取措施，防止和消除污染.
PCR实验，不在于是不是能扩增出带来， 而是在于是不是有重复性、是不是有统计 性、有没有设对照，其实这3点做任何实验 都是必需的，尤其是对照，前两点对分析 单次实验结果可能影响不大，但对照就不 一样了。如果PCR有问题，没有对照很难分 析原因的，即便是PCR出的结果很好，没有 对照也无法说明是不是假阳性，关键还是 对照。
A对照：打开试剂反应管的盖 子，在空气中暴露10 min，盖上盖 子，上机检测； B对照：试剂的反应管不开盖 子，直接上机检测。 结果：全部标本和A对照为阳 性，而B对照为阴性。
至此，虽然还查找不到污染源是什么， 但有一点可以肯定，PCR实验室污染是气溶 胶扩散而引起的。 后来经过调查，发现污染是由于该实验 室新来了一个清洁工人，没有经过培训就直 接上岗，在打扫实验室卫生时，用扩增区的 扫笤和拖把打扫了标本制备区的卫生引起。
一次实验室污染的经历
某实验室曾经遭遇过气溶胶的污染，所 幸的是经过一段时间的处理，最终将PCR实 验室污染排除掉了。
（一）实验室情况
l 实验室设置 实验室分为试剂准备区、标本制备区、扩增 区三个区，试剂存放在试剂准备区，标本是在标 本制备区处理，处理完的标本置于扩增区上机扩 增。 l 使用试剂 试剂是由中山大学达安基因股分有限公司提 供的乙型肝炎病毒(HBV)荧光定量PCR试剂。 l 操作人员 经过卫生部临检中心或省临检中心理论和操 作培训并通过考试取得合格证。
PCR实验室的污染与对策
河北医科大学第三医院
冯忠军
PCR技术是一种体外模拟自然DNA复 制过程的核酸扩增技术，该技术通过 重复高温变性、低温退火、中温延伸 等简单的3个温度循环，能将靶DNA扩 增数百万倍，获得极高的检测 敏感性。
30次循环后靶序列扩增的数量
No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1
通常我们对PCR实验室污染的预防是采 取不同操作分区进行、分装试剂、改进实验 操作等规则，对污染的处理是用稀盐酸擦拭 或浸泡、紫外线照射等。而对于实验室的通 风方面没有给予足够的重视， 为了防止实验分区间之间的相互污染， 各个实验分区间都是尽可能的密闭，从而使 得实验室出现PCR产物残留污染的几率增大。
理想的PCR实验室设置
产物分析区 扩增区 标本制备区 试剂准备区
空气流向 空气流向
空气流向
空气流向
缓冲间
缓冲间
缓冲间
专用走廊
工作流向
各区独立，注意风向，因地制宜，方便工作
（二）分装试剂：
PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的 超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加 样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增 后的DNA和其他来源的DNA： 1．PCR用水应为高压的双蒸水； 2．引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物 区 配 制； 3．引物和dNTP应分装储存，分装时应标明时 间，以备发生污染时查找原因。
从本次PCR实验室污染排除的过程可以 看出，污染得以排除的一个关键是通风。 适当的给予实验室通风，可起到空气稀释 的作用，有利于PCR产物残留量的减少，加 快实验室污染的排除。 将该PCR实验室的教训报告给大家，是 想引起各位同行对实验室通风给予足够的 重视，不要再有类似的情况发生。
PCR实验室污染的原因
1 cycle = 2 Amplicon
2 4 8 16 32 64 1,048,576 1,073,741,824
2 cycle = 4 Amplicon
2 3 4 5 6 20
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon