PCR法快速鉴定阳性克隆实验的改进
阳性克隆鉴定和质粒DNA提取
确保质粒DNA的质量和纯度，可以提高阳性克隆鉴定的准 确性，为后续实验提供可靠的基因材料。
推动基因工程领域的发展
对阳性克隆鉴定与质粒DNA提取的关联性进行深入研究， 有助于推动基因工程领域的发展，为基因治疗、基因编辑 等应用提供技术支持。
05
实验设计与操作注意事项
实验设计原则
明确实验目的
根据研究目标选择合适的克隆鉴定和质粒DNA提取方 法。
选择合适载体
根据实验需求选择合适的载体，如质粒、噬菌体等。
设计引物
针对目标基因设计特异性引物，用于PCR扩增和测序 验证。
操作注意事项
无菌操作
精确计量
控制温度和时间
实验过程中需保持无菌 操作，避免污染。
准确称量试剂和样品， 保证实验结果的准确性。
团队协作
实验过程中，团队成员积极沟通、协作，共同解决遇到的问题，提高了实验效率。
不足之处
在实验过程中，我们也遇到了一些问题，如PCR扩增效率不高、质粒提取量不足等。这些 问题提醒我们在后续实验中需要更加注意细节，优化实验条件。
未来工作展望
深入研究
在后续实验中，我们将进一步研究重组质粒的功能和表达情况，以及其在细胞内的稳定性和传递 效率等问题。
严格控制实验过程中的 温度和时间，避免对实
验结果产生影响。
防止交叉污染
使用一次性枪头和离心 管，避免交叉污染。
实验结果记录与数据分析
详细记录实验步骤和数据
记录实验过程中的操作步骤、试剂用 量、温度、时间等关键信息。
数据分析
对实验结果进行统计分析，如PCR产 物电泳图谱分析、测序结果比对等。
结果解读
鉴定步骤
01
PCR检测常见问题与解决途径
PCR检测常见问题与解决途径利用PCR方法检测转基因成分时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。
尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。
为了提高转基因检测的准确性和可靠性，PCR检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。
一个好的PCR方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性，尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。
本文对PCR检测中出现的假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的原因与其解决方法予以综述。
一、假阳性：（一）假阳性现象假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。
如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。
实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。
（二）造成假阳性的原因1. 样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；2. PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水与其它溶液被PCR核酸模板污染。
3. PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。
因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。
4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时与污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。
据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
5. 实验室中克隆质粒的污染：由于克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具与试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性与具有很强的生命力，其污染可能性也很大。
阳性克隆的PCR鉴定
PCR反应参数:退火
•引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基 组成、引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物 的浓度。实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约 低5℃，时间一般为30-45sec。
PCR反应参数:延伸
•延伸反应通常为72℃,接近于Taq DNA聚合酶的最适 反应温度75℃.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因 为Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃.
PCR反应体系-模板DNA
•就模板DNA而言, 影响PCR的主要因素是模板的数量和 纯度. 一般反应中的模板浓度为 50-100 ng/ml. •模板量过多则可能增加非特异性产物. DNA中的杂质也 会影响PCR的效率.
PCR反应体系— PCR反应缓冲液
•缓冲液一般含10-50mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl和适当浓度的Mg 2+ .
•另外，反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或 100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性。
•加入T4噬菌体的基因32蛋白，对扩增较长的DNA片段 有利。
PCR反应参数:变性
•在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min非常重要,它可 使模板DNA完全解链。变性不完全,往往使PCR失败, 因为未变性完全的 DNA双链会很快复性,减少DNA产 量。
•引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低 都不利于引发反应，因为GC含量决定了DNA双链 的解链温度（Tm）。另外，上下游引物的GC含量 不能相差太大。
•一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。 引物过• dNTP应用NaOH 将pH调至7.0。 dNTP原液可配成 5-10mmol/L并分装, -20℃贮存。一般反应中每种 dNTP的终浓度为20-200μmol/L。 • 理论上4 种 dNTP各20μmol/L, 足以在100μl反应中合 成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可 抑制Taq DNA聚合酶的活性. •4种dNTP的浓度应该相等, 以减少合成中由于某种 dNTP的不足出现的错误掺入。
一种热激PCR法高效鉴定重组克隆
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第２ ７卷第 ２期
２１ ００年 ４月
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生 物 学 杂 志
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PCR实验常见失败原因、对策分析及体系优化
PCR实验常见失败原因、对策分析及体系优化PCR虽然为一个简单的实验,但在实际过程中可能会出现各种问题.产生问题的原因可能来源于以下几个方面：实验操作，试剂质量，PCR反应过程中各种试剂的含量,以及反应条件，温度设置等，本文对各个方面进行了讨论，大家遇到问题后可以对号入座的查一下.当然，具体问题的解决还依靠实验者就可能的原因逐项排除,并不断的摸索才能彻底解决.假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件.寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改.酶失活：需更换新酶,或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性.需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭.引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带.反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
基因克隆转化实验报告
一、实验目的1. 掌握基因克隆的基本原理和操作步骤；2. 学习基因克隆转化实验技术；3. 验证目的基因在受体细胞中的表达。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因从基因组中提取出来，并在受体细胞中稳定复制、表达的过程。
基因克隆转化实验主要包括以下步骤：目的基因的提取、克隆载体构建、目的基因与克隆载体的连接、转化受体细胞、筛选阳性克隆、鉴定阳性克隆等。
三、实验材料1. 材料：大肠杆菌DH5α、克隆载体pUC19、目的基因片段、DNA连接酶、限制性内切酶、DNA聚合酶、质粒提取试剂盒等；2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、离心机、恒温培养箱等；3. 试剂：LB培养基、氨苄青霉素、IPTG、X-gal等。
四、实验方法1. 目的基因的提取：采用PCR技术扩增目的基因片段，利用限制性内切酶将目的基因片段与克隆载体连接；2. 克隆载体构建：将目的基因片段与克隆载体pUC19连接，构建重组克隆载体；3. 转化受体细胞：将重组克隆载体转化到大肠杆菌DH5α中；4. 筛选阳性克隆：在含有氨苄青霉素的LB培养基上培养转化后的菌落，挑选白色菌落进行PCR验证；5. 鉴定阳性克隆：对PCR验证阳性的菌落进行菌落PCR，将扩增产物进行电泳，观察条带是否与预期大小一致。
五、实验结果1. 目的基因提取：PCR扩增产物电泳结果显示，目的基因片段大小与预期一致；2. 克隆载体构建：重组克隆载体转化到大肠杆菌DH5α后，在含有氨苄青霉素的LB培养基上培养，观察到白色菌落；3. 筛选阳性克隆：PCR验证结果显示，白色菌落中含有目的基因片段；4. 鉴定阳性克隆：菌落PCR结果显示，阳性克隆中含有与预期大小一致的目的基因片段。
六、实验讨论1. 实验过程中，DNA连接酶和限制性内切酶的用量、转化效率等因素对实验结果有一定影响，需根据实际情况调整；2. 实验中，菌落PCR验证和鉴定阳性克隆是确保实验结果准确的关键步骤；3. 基因克隆转化实验技术在生物科研和生物医药领域具有广泛的应用前景。
12阳性克隆的PCR鉴定
一、实验目的 掌握利用PCR技术对阳性克隆的检测技术
三、实验材料、器具及药品 实验材料 待检测的阳性克隆菌株. 实验器具 微量取液器(10μl, 20μl)， 台式高速离心机， PCR仪。
实验药品
10×PCR缓冲液(含Mg2＋)
dNTP (每种2.5mmol) Taq酶 2U/ul DNA模板 引物RV-M：GAGCGGATAACAATTTCACACAGG(Tm=54℃) 引物M13-47：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC(Tm=54℃) 引物溶液浓度 10pmol/ul
10×PCR Buffer Taq酶
dNTPs ddH2O Total
2 0.4
1 12.6 20
990
• 混匀后离心，进行PCR扩增.(94℃预变性5min，94℃ 变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸45sec,循环 25次,72℃延伸10min。)
• 扩增产物进行电泳检测:
四、实验步骤
• 取1ml菌液6000rpm离心3min，弃去900ul上清液， 利用剩余上清弹匀沉淀，沸水浴15min，12000离心 • 5分钟，取上清液进行PCR检测。 • 在0.2ml RCR管内配置20ul反应体系：
体积
模板 引物1 引物2 2 1 1 55 55 110 22 55 693 18 55管 每管 2
阳性克隆筛选实验报告
一、实验目的本实验旨在通过分子克隆技术，将目的基因插入到载体质粒中，并通过转化大肠杆菌，筛选出含有目的基因的阳性克隆。
具体步骤包括：质粒提取、DNA片段的扩增、质粒与DNA片段的连接、转化大肠杆菌、阳性克隆的筛选与鉴定。
二、实验材料1. 仪器设备：- 离心机- PCR仪- 紫外分光光度计- 电泳仪- 热浴箱- 离心管- 研钵- 移液器- 平板培养箱2. 试剂：- 质粒提取试剂盒- DNA提取试剂盒- PCR试剂- DNA连接酶- 转化试剂- 抗生素（氨苄青霉素、四环素等）- 培养基（LB、固体LB培养基等）- 其他常用试剂（如：DNA酶、RNA酶、缓冲液等）3. 实验材料：- 目的基因片段- 载体质粒- 大肠杆菌菌株（如DH5α）三、实验方法1. 质粒提取：使用质粒提取试剂盒，按照说明书提取含有目的基因的质粒。
2. DNA片段的扩增：采用PCR技术，以目的基因片段为模板，扩增目的基因。
3. 质粒与DNA片段的连接：将PCR产物与载体质粒进行连接反应，构建重组质粒。
4. 转化大肠杆菌：将连接好的重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中。
5. 阳性克隆的筛选：- 培养液筛选：将转化后的菌液涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，培养过夜。
- 蓝白斑筛选：观察菌落颜色，白色菌落可能为含有目的基因的阳性克隆。
- 抗生素平板筛选：将白色菌落接种到含有氨苄青霉素和四环素的LB固体培养基上，培养过夜，验证菌落是否具有抗生素抗性。
6. 阳性克隆的鉴定：- 酶切鉴定：将白色菌落提取质粒，进行酶切反应，电泳检测酶切产物。
- PCR鉴定：将白色菌落提取质粒，进行PCR反应，检测目的基因是否存在。
四、实验结果1. 质粒提取：成功提取出含有目的基因的质粒。
2. DNA片段的扩增：PCR产物在预期位置出现特异性条带。
3. 质粒与DNA片段的连接：连接反应成功，转化大肠杆菌。
4. 阳性克隆的筛选：- 培养液筛选：成功筛选出白色菌落。
PCR污染与对策
PCR污染与对策PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生.污染原因(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染.(二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三)PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最主要最常见的污染问题.因为PCR产物拷贝量大(一般为1 013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性.还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.(四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见.因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大.污染的监测一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染.对照试验1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志.阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下).但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照.2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照.它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照.②试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA 或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染.3.重复性试验4.选择不同区域的引物进行PCR扩增防止污染的方法一．污染的预防进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。
改良菌落PCR快速鉴定TRIM28基因阳性重组子的方法研究
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Ｔ Ｍ２ 基 因 的 阳性 重 组体 进 行 阳性 重 组 子 的 分 析 比 较 ，同 时 探 讨 了 Ｐ Ｒ 反 应 体 系 中 模 板 浓 度 和 ＤＭＳ 对 于扩 增 效 率 的影 ＲＩ ８ Ｃ Ｏ
响。 并对 鉴定 结 果 为 阳 性 的 克 隆进 行 了进 一 步 酶 切 和 蛋 白诱 导 表 达 分 析 。 结果 ： 用改 良的 菌 落 Ｐ Ｒ 法 简 单 快 捷 ， 果 可 靠 ， 运 Ｃ 结 反
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第27卷第2期 阜阳师范学院学报(自然科学版) V o l.27,N o.2 2010年6月 J o urnal of Fuyang T eache rs Colleg e(N atur al Science) J un.2010PCR法快速鉴定阳性克隆实验的改进崔亚东,刘生杰,聂传朋(阜阳师范学院生命科学学院,安徽阜阳 236041)摘 要:分析了常规PCR扩增鉴定阳性克隆实验中存在的问题,进行了改进探索:反转录PC R(R T-P CR)获得目的基因片段,T A克隆连接质粒载体、转化大肠杆菌感受态细胞;利用目的基因的特异性引物,用菌液PCR法直接筛选重组克隆,在筛选的阳性菌液中扩增到与目的基因片段大小一致的阳性条带,与质粒PC R及酶切的阳性对照一致,验证了菌液PCR具有可靠性。
实验证明,自身引物菌液PCR法用于定性筛选重组阳性克隆,是一种简便、快速、有效的方法。
关键词:菌液PCR;质粒PCR;限制性酶切;重组克隆;筛选中图分类号:Q785 文献标识码:A 文章编号:1004-1069(2010)02-0051-04Improving of experiment on PCR rapidscreening for recombinant clonesCU I Ya-dong,LIU Sheng-jie,N IE Chuan-peng(School of Lif e Science,Fuyang Teachers College,Fuyang Anhui,236041,China)Abstract:Analysing the pro blems o n PCR Screening for v eco mbina nt clo ne,w e put for wa rd sug gest tio ns to them: The aim ed c DN A frag ments w ere acquired by R T-P CR.Th e pro ducts w er e inser ted to the cloning T-v ecto r s.DH5α(E. coli)tra nsfo rmed by r ecombinant pla smid w as inocula ted.The same size positiv e strips as the c DN A fr agme nts w er e visible in Ba cteria Liquid P CR o f th e scr eened po sitiv e clo nes with specific primer s fo r a mplifica ting ta rg et ge nes.T he r esults we re in g rea t ag r eement w ith tho se obtained by plasmid PCR a nd double enzyme dig estio n as po sitiv e co ntro ls.T he Conclusio n is that Bacteria Liquid PC R is a simple,efficient and r elia ble tech nique fo r screening positive clo nes o f r eco mbinant genes.Key words:bact eria liquid PCR;plasmid P CR;restrictio n enzy me dig estio n;r eco mbinant clo nes;sc reening 在分子生物学的研究中,重组子筛选是分子克隆技术中非常重要的步骤之一,因为转化获得的重组体不一定是预期所需的,其中可能包括:载体自连、多拷贝插入DN A、反向连接及各种可能的突变等不需要的重组子,因此需要对重组体筛选。
筛选方法主要有:蓝白筛选;提取并纯化质粒,依靠酶切或测序等手段检测插入DN A是否正确;PC R筛选;菌落杂交等[1]。
这些方法各有其优缺点:菌落杂交筛选能进行大规模操作,但必须使用同位素,操作复杂,因此目前使用的越来越少;提取质粒酶切法需要提取质粒,当筛选的样品较多时,操作比较繁琐;蓝白斑筛选法需要载体有特殊结构,在实际运用中存在不少的假阳性,需要进一步验证。
由于PCR技术具有简便、快速及灵敏等特点,PCR筛选常被应用于阳性克隆的鉴定。
但是常规的PCR扩增需要进行细菌质粒制备等多步骤后才能进行基因扩增,操作繁琐,耗时较长。
为简化操作程序, D.Gussow和T.Clackson[2]首先应用菌落PCR直接鉴定抗性平板上的重组克隆,即用无菌牙签挑取单个菌落到TE缓冲液中,煮沸5min,涡漩振荡后收稿日期:2010-04-30基金项目:安徽省教育厅教研项目(2008jyx m460)资助。
作者简介:崔亚东(1963-),男,副教授。
研究方向:昆虫生化及分子生物学。
短暂离心,用1～2μL裂解液作为DN A模板,省去抽提模板DN A这一步,大大节约了时间和成本。
本研究中,我们在鉴定二化螟Chilo sup pressalis(Walker)热休克蛋白基因60、70 (HSP60、HSP70)及其核糖体18sRN A基因克隆时,对PCR法快速鉴定阳性克隆实验进行了改进,即采用目的基因两端的特异引物,直接用菌液作为模板,适当延长PC R的预变性时间,使得细菌能够充分破裂,DN A大量释放,省去煮沸过程,更节约了时间,简化了操作程序;为证实菌液PCR结果可靠性,我们提取质粒DN A,进行质粒PCR和双酶切作为阳性对照,证实菌液PCR的结果完全正确,值得进一步的推广应用。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 主要试剂M-M LV反转录酶、Taq DN A聚合酶、pM D-18载体及限制性内切酶EcoRI、HindI I I购自宝生物(大连)工程公司;DN A回收试剂盒为北京百泰克生物公司产品;大肠杆菌菌株DH5α为本实验室保存;其他试剂购自上海生物工程公司。
1.1.2 目的基因从二化螟血淋巴细胞提取总RN A,利用M-M LV反转录酶合成cDN A第一链,然后经PCR扩增、纯化回收获得二化螟HSP60、HSP70基因片段。
将二化螟血淋巴细胞用SDS/蛋白酶K消化液(蛋白酶K:20μg/m L,SDS:1%)消化0.5h,酚/氯仿抽提法提取基因组DN A,然后经PCR扩增、纯化回收获得二化螟核糖体18S基因片段。
1.1.3 引物根据已发表的和登录在GenBa nk中的热休克蛋白HSP60、HSP70和核糖体18sRN A基因的保守性区域,并通过Blast的同源性分析,分别设计引物。
HSP60基因上游引物P1:5′-GCKGGDGAYGGN ACN ACNWC-3-,下游引物P2:5′-TCDCC RAADCCRGGN GC TT TKA -3-;HSP70基因上游引物P3:5′-GTGAGAGNGCGAW GCGAAKCCT-3-,下游引物P4:5′-TACRGAGCGACAGDGN AGTGAC-3-;18SRN A基因上游引物P5:5′-TCCCT GGTG TGATCCTGCC AG T-3-,下游引物P6:5′-AC TAGGGCGGT ATCTGA TCGC-3-。
引物由上海生物工程公司合成。
1.2 方法1.2.1 目的基因的连接、转化将二化螟HSP60、HSP70和核糖体18S PCR产物分别与pM D-18载体进行连接,连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,并涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基上,37℃下培养24h,待菌落长出后,用灭菌牙签挑取白斑,接种到3m L LB液体培养基(含抗生素)上,37℃、200r/min下振荡培养14h。
1.2.2 菌液PCR鉴定阳性克隆PCR采用20μL反应体系。
取培养的菌液2μL 作为模板,以P1和P2为上下游引物,进行PCR扩增,用于鉴定HSP60基因阳性克隆;以P3和P4为上下游引物进行PCR扩增,用于鉴定HSP70基因阳性克隆;以P5和P6为上下游引物进行PCR扩增,用于鉴定核糖体18S基因阳性克隆。
HSP60PCR反应条件:95℃预变性10min;然后95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸60s,循环30次;最后72℃延伸10min。
HSP70PCR反应条件退火温度为59℃,核糖体18S基因PCR反应条件退火温度为57℃,其余条件同HSP60PCR 反应条件。
反应结束后用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。
1.2.3 质粒PCR鉴定阳性克隆(阳性对照)取培养的菌液,按碱裂解法提取质粒DN A,取1μL质粒DN A作为模板,用与菌液PCR法相同的引物以及相同的PC R反应条件,进行PCR扩增。
1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。
1.2.4 阳性克隆质粒酶切鉴(阳性对照)取质粒DN A10μL,用Eco RI和Hind III限制性内切酶进行双酶切。
1.0%的琼脂糖凝胶电泳检查酶切产物。
2 结果2.1 菌液PCR筛选阳性克隆以少许菌液直接作为模板进行PCR扩增,对HSP60基因克隆进行筛选,经电泳分析检测,可见约600bp左右的阳性条带;对HSP70基因克隆进行筛选,可见约470bp左右的阳性条带;对核糖体18S基因克隆进行筛选,可见约1010bp左右的阳性条带(图1)。
这些条带与采用RT-PCR方法扩增HSP60、HSP70基因以及PC R扩增18S基因的片段大小一致,因此推测为含有目的基因插入片段的阳性克隆。
52 阜阳师范学院学报(自然科学版) 第27卷 1-2:18S DN A 片段扩增产物;3-4:HS P 60cDN A 片段扩增产物;5-6:HS P70cDN A 片段扩增产;M :分子量标准。
Lan e1-2:PC R products of 18S DN A frag men t;Lan e3-4:PCR products of of HSP60cDNAfragm ent ;Lan e5-6:PCR products of HSP70cDNAfragment ;M :DNA marker图1 阳性克隆菌液PCR 电泳鉴定2.2 质粒PCR 扩增结果为验证菌液PCR 筛选阳性克隆的正确性,取阳性克隆菌液提取质粒,进行质粒PCR,凝胶电泳分析表明,质粒PCR 和菌液PC R 扩增的结果一致(图2)。
1-2:18S DN A 质粒PC R 验证结果;3-4:HS P60cDN A 质粒PC R 验证结果;5-6:HS P70cDN A 质粒PC R 验证结果;M :分子量标准。