重组克隆的筛选和鉴定

重组克隆的筛选与鉴定是基因工程中必不可少的
一、载体遗传标记法
——抗药性筛选法
原理：


例如，pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr Tetr上有插入位点BamH I; Ampr上有插入位点Pst I。
抗药性标记插入失活选择法外源目的序列插入在 载体的抗药性基因中间使这抗药性基因失活，即 抗药性标志消失
选择过程：
重组子因LacZ’基因的插入灭活而呈白色，非重组子则显蓝色
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
重组克隆筛选


凝胶电泳检测法
质粒DNA的电泳迁移率与其分子量大小成比例，带有 外源 DNA 插入序列重组体 DNA 比不具有外源 DNA 插入序
列的分子量较大，在凝胶中的迁移速度要缓慢些。
反应物 母液浓度 PCR体系浓度 1 ×加入量 ul 6 ×加入 量ul
模板DNA 缓冲液Buffer 4种dNTP混合物
100 ng/ul 10× 10 mmol/L
100 ng 1× 400 umol/L
菌落 1.0 0.5
6 3
Taq DNA聚合酶 引物Primer（不同） 无菌双蒸水
5unit/ul 10 umol/L
重组克隆的筛选和鉴定
原理

载体遗传标记法
1.抗药性筛选法 2.营养缺陷型筛选法 3. -半乳糖苷酶显色反应选 择法

其它方法
1.凝胶电泳检测法 2.PCR法
引言



转化子（接纳载体或重组分子的转化细胞）与 非转化子（接纳载体或重组分子的转化细胞）； 重组子（含有DNA重组分子的转化子）与非重 组子（仅含有空载载体分子的转化子）； 期望重组子（含有目的基因的重组子）与非期 望子（不含目的基因的重组子）
1unit 0.5 umol/L
0.3 0.5 7.7
1.8 3 46.2
一、载体遗传标记法
——-半乳糖苷酶显色反应选择法
原理：



载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的 片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因 （ 片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能 的-半乳糖苷酶。


PCR法
利用合适的引物，以提取的质粒为模板进行PCR反应， 通过对PCR产物的电泳分析来确定目的基因是否重组入载 体中。
重组克隆筛选


PCR法的改进与优化
（1）以转化的单菌落为模板,通过PCR挑取 重组子克隆 ； （2）将待筛选的重组克隆重新进行液体培 养，而后进行PCR ；

Hale Waihona Puke Baidu
1、反应体系，在PCR管配制10ul的反应体系：