重组体的筛选和鉴定
重组体的筛选方法
重组体的筛选方法重组体是一种重要的生物技术手段，它可以用于改良微生物、植物和动物的基因组，从而实现对目标基因的精准编辑和调控。
在进行重组体的筛选过程中，选择合适的筛选方法对于提高筛选效率和准确性具有重要意义。
本文将介绍几种常见的重组体筛选方法，帮助读者更好地理解和应用这一技术。
1. 抗生素筛选法。
抗生素筛选法是重组体筛选中最常用的方法之一。
通过将目标基因与抗生素抗性基因连接在一起，然后转化至宿主细胞中，能够通过对抗生素的耐受性来筛选出含有目标基因的重组体细胞。
这种方法简单易行，且操作方便，适用于微生物和植物等生物体的筛选。
2. 标记基因筛选法。
标记基因筛选法是利用标记基因与目标基因共转化至宿主细胞中，通过标记基因的表达情况来筛选出含有目标基因的重组体细胞。
常用的标记基因包括荧光标记基因、抗性标记基因等，通过检测标记基因的表达情况，可以快速准确地筛选出目标基因的重组体细胞。
3. PCR筛选法。
PCR筛选法是利用聚合酶链式反应（PCR）技术来筛选重组体。
通过设计特定的引物，可以扩增出含有目标基因的DNA片段，从而实现对重组体的筛选。
PCR筛选法具有高灵敏度和高特异性的优点，能够准确地检测出目标基因的存在，是一种常用的重组体筛选方法。
4. 免疫筛选法。
免疫筛选法是利用抗体对目标蛋白的特异性识别来筛选重组体。
通过将目标蛋白与标记蛋白连接在一起，然后转化至宿主细胞中，利用抗体对标记蛋白的特异性识别来筛选出含有目标蛋白的重组体细胞。
这种方法对于筛选蛋白重组体具有重要意义，能够快速准确地筛选出目标蛋白的重组体细胞。
5. 酶标记筛选法。
酶标记筛选法是利用酶标记技术来筛选重组体。
通过将目标基因与酶标记基因连接在一起，然后转化至宿主细胞中，利用酶标记基因的表达情况来筛选出含有目标基因的重组体细胞。
这种方法操作简便，能够快速准确地筛选出目标基因的重组体细胞。
总结。
重组体的筛选方法多种多样，每种方法都有其特点和适用范围。
何水林版基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
4. DEAE-葡萄糖转染法 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量
基因工程重组体克隆的筛选和鉴定
基因功能的正向遗传筛选技术
突变体库的构建
通过化学诱变、同源重组 等技术构建大规模突变体 库。
表型筛选
通过特定表型筛选出具有 特定功能的突变体。
突变基因的鉴定
通过测序等技术鉴定出突 变基因，并研究其功能。
05
克隆基因的应用前景
克隆基因在医学上的应用
疾病诊断与治疗
利用克隆技术获取特定基因，可用于疾病诊断、药物研发和个性化治疗。
基因敲入
将特定基因敲入生物体基因组，观察 生物体表型变化，以确定该基因的功 能。
基因表达干扰
通过转录因子或RNAi技术干扰特定 基因的表达，观察生物体表型变化， 以确定该基因的功能。
正向遗传筛选
通过突变体库筛选具有特定表型的突 变体，鉴定突变基因，以研究该基因 的功能。
基因敲除和敲入技术
基因敲除技术
基于测序的筛选
对转化子进行全基因组测序或目的基因片段测序，与已知序列进行比 对，判断是否含有目的基因。
蓝白筛选法
原理
步骤
利用载体上标记基因的表达产物对转化子 进行筛选，通过菌落颜色的变化判断是否 含有目的基因。
将转化子涂布在含有抗生素的培养基上， 培养后观察菌落颜色变化，蓝色菌落为阳 性克隆，白色菌落为阴性克隆。
基因表达的蛋白质印迹分析
原理
利用特异性抗体检测样品中特定蛋白质的表达情况，通过显 色反应或荧光信号对蛋白质进行定性或定量分析。
用等 方面的研究。
04
克隆基因的功能研究
基因功能研究的方法
基因敲除
通过基因工程技术将特定基因敲除， 观察生物体表型变化，以确定该基因 的功能。
Northern印迹杂交
原理
基于RNA的电泳分离和转移，将RNA 片段与标记的探针进行杂交，以检测 特异的RNA转录本。
第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定第一节转化基因片段在体外只是一段核酸分子，是化学物质，无法表现出遗传物质的生命活性。
只有当其存在于活细胞后，生命的特征才能充分展示出来。
在分子克隆实践中，在体外操作的核酸分子只有进入细胞以后才能达到克隆的目的。
一、重组DNA分子转入原核生物细胞1. 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌转化（transformation）——重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。
（1）CaCl2处理后的细菌转化或转染A、制备感受态细胞受体细胞的细菌，经一定浓度的冰冷的 CaCl2（50～100 mmol／L）溶液处理后变成。
所谓感受态细胞，处在感受态状态的菌体有摄取各种外源 DNA的能力。
转化：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程；转染：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程；好的感受态细胞，每微克的超螺旋质粒DNA可得5×107个转化体。
B、细胞转化（或转染）的具体操作过程：①将处于对数期的新鲜培养物于0℃4000转/分离心10分，回收细菌细胞；②将细胞用0℃的0.1mol/L CaCl2低渗溶液处理30分钟，离心回收细胞，再用适量0℃的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，以诱导感受态产生。
③加入适量DNA，于42 ℃热处理混合物90秒，使DNA分子被细胞吸收；④将混合物快速转到冰浴中，冷却1~2分，加入适当的培养基，在37 ℃培养45分，使细胞复苏并表达质粒所携带的转化基因；⑤通过选择培养基上平板培养，选择转化体。
⑥如果用抗菌素筛选转化体，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。
（2）电穿孔转化法基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。
基因工程第七章 重组子的筛选和鉴定
菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物 理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数 不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法 可用于检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分 破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙 签点在LB（+Amp）平板，记录号码。 在PCR管中加其他成分（最后加酶） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。
重组体筛选的方法
重组体筛选的方法
重组体筛选是一种用于寻找具有特定性质或功能的重组分子的方法。
下面列举了一些常用的重组体筛选方法：
1. 亲和筛选（Affinity screening）：利用目标蛋白与重组体之间的亲和力进行筛选。
可以通过将目标蛋白固定在固相材料上，然后将重组体溶液注入固相材料中，通过洗脱和分离来筛选出与目标蛋白相互作用的重组体。
2. 循环进化（Directed evolution）：采用类似于自然进化的方法，通过连续的基因突变和筛选来改进重组体的性能。
通常使用基因库构建、突变（例如误配PCR、DNA shuffling等）和活性筛选（例如细胞表面显示、酶活性测定等）等方法。
3. 细胞表面显示（Cell surface display）：利用细菌或酵母等微生物表面展示重组体，并通过流式细胞术（FACS）等方法筛选出具有目标性质的重组体。
4. 体外显示（In vitro display）：重组体通过与其DNA或RNA编码的蛋白质、磷酸盐结合或共价耦合，以形成重组体-核酸复合物。
然后通过结合亲和柱或筛选酶活性等方法对重组体进行筛选。
5. 亲和柱筛选（Column chromatography screening）：利用亲和柱固定目标蛋白，然后通过洗脱和分离来筛选具有亲和性的重组体。
6. 生物传感器筛选（Biosensor screening）：利用生物传感器的敏感性和选择性来筛选具有目标性质的重组体。
常见的生物传感器包括表面等离子体共振（SPR）传感器和电化学传感器等。
上述方法可能结合使用，根据具体的研究目标和条件来选择最合适的筛选方法。
重组体的筛选方法
重组体的筛选方法1、重组体的基本筛选概念重组体（recombinant）指从不同生物系统中获取的非天然表达载体，以用于表达特定蛋白质或DNA片段，通常为了检测某种生物活性，以改良生物机理或更改特定特性。
重组体的筛选是对重组体表达的非天然蛋白质进行筛选的过程，可以用来鉴定新的蛋白质、表达具有特定生物活性的蛋白质，或确定新的重组体表达载体。
表达系统筛选通常包括利用基因工程技术在指定载体上表达特定基因编码片段，然后使用分子生物学、免疫学和生物化学方法进行在细胞水平或分子水平上进行分析和筛选，以鉴定具有特定生物活性的重组体表达系统。
2、方法（1）载体筛选。
在大多数重组体表达系统中，筛选的首要任务是识别具有最佳表达能力的载体，其中也可能涉及到大量的载体类型。
可以分别从细胞系、染色体、质粒、全基因组、融合蛋白等不同类型的载体中选择重组体。
有些载体可能会更有效地表达特定基因，而有些可能会产生低产蛋白，因此需要进行大量的筛选才能有效地识别最佳的表达系统载体。
（2）表达率筛选。
在细胞中表达的蛋白质必须具有最大的表达量才能产生最佳的活性，因此对重组蛋白质的表达量非常重要。
在大多数情况下，使用多种不同的表达系统技术来评估重组体表达质量，例如利用Western和Northern blotting、Immunoprecipitation、活性测定和流式细胞术等技术。
（3）特异性筛选。
在获得足够数量的蛋白质之后，必须进一步确定表达体的特异性，特异性不仅取决于重组蛋白质可以被正确表达和结构功能完整，而且应该是特异性，以使其产生预期的生物活性。
因而，重组体的筛选过程还必须包括一项评估表达蛋白质的特异性的步骤，释放的生物活性水平是最重要的特征，在此筛选步骤中，可以使用酶抑制试验、衍生物筛选、细胞学剂量响应性试验或免疫学、化学、物理学方法来评估重组表达体的活性。
3、结论重组体表达是一种实用技术，它旨在确定特定生物学活性的最佳表达系统，以获得有价值的蛋白质或未知活性的分子。
重组克隆的筛选与鉴定
4、 选择得过程
(1)四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA,导致四环素 抗性基因失活,可用四环素﹢环丝氨酸 得平板,选择重组克隆。
Tetr插入失活得细菌,其生长可被四环素 抑制,不被环丝氨酸杀死,保留下来;
Tetr不失活得细菌,能抗四环素,正常生长, 但可被环丝氨酸杀死。
图 四环素抗性插入失活
二、利用抗生素抗性基因:pBR322
以pBR322为例,说明利用抗生素抗性基因得插 入失活得原理。
1、 原理
在pBR322上有多个单一得限制酶位点,如 BamH I位点,恰好在一个四环素抗性基因内。 如果有外源DNA插入BamH I位点,那么涉及 四环素抗性得基因就损坏,因此,带有重组 pBR322质粒得细胞,仍对氨苄青霉素有抗性, 但对四环素得抗性消失(敏感)。
pUC18/19得结构图
氨苄青霉素抗性基因 Lac Z基因:编码-半乳糖苷酶得部分肽
段。 Lac Z上有插入外源DNA得MCS位点。
4、 筛选得方法:蓝白斑法
利用蓝白斑法筛选pUC8/9重组子,就是 一种直接检测-半乳糖苷酶活性得方法。
①先将转化子涂于含有氨苄青霉素得培 养基,能合成-半乳糖苷酶。
该技术已广泛应用于基因得表达、基因 定位、克隆基因得筛选、酶切图谱得制
作、基因组中特定基因序列检测、遗传 病疾病得诊断及生物分类等方面。
一、核酸分子杂交得基础
1、 变性与退火 DNA以双链形式存在,在进行分子杂交
时,先将双链DNA分子解聚为单链,这一 过程称为变性。
两条单链通过碱基互补,聚合成稳定得 双链区得过程称为退火或复性。
图 表型筛选加酶切筛选
０
A
A
T T
TA AT
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转入萤火虫 的luciferase 的烟草
GFP- Kac的狗
GFP 老鼠
GFP Alba 發青綠光 芒的 兔子
①新霉素磷酸转移酶基因（NPTⅡ）抗新霉素、
卡那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选 动植物转化子的选择标记基因。
外源DNA
PstI酶切
黏性末端
pBR322 4363
PstI酶切 黏性末端
连接酶 重组子(ampstetr) 空载体(amprtetr) 插入子(ampstets)
导 入
重组子转化子(ampstetr) 空载体转化子(amprtetr)
涂布在含Tc的平板上
野生型的E.coli (ampstets)
影印在含Ap的平板上 空载体转化子(amprtetr)
（3）环丝氨酸： 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
质4-甲基伞形花酮，以此筛选含GUS基因的转化
子。 由于植物细胞GUS本底非常低，因此广泛地应用
于筛选植物转化子。
尤其是GUS基因的3’端与其他结构基因连接产生
的嵌合基因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍 有GUS活性，可用于外源基因在转化生物体中的 定位分析。
⑤萤火虫荧光素酶基因（LUC）
LUC表达产物萤火虫荧光素酶（LUC）在Mg2+的
重点：
常用的抗菌素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶联免 疫吸附测定（ELISA）
难点：
免疫印迹（Western Blotting）法的原理
转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。 非转化子：未接纳载体或重组分子的转化细胞。 重组子：含有重组DNA分子的转化子。 非重组子：仅含有空载载体分子的转化子。 期望重组子：含有目的基因的重组子。 非期望重组子：不含有目的基因的重组子。
筛选植物转化细胞常用的报告基因
报告基因（reporter gene）：系指其编码产物能 够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经 成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表 达活性的一类特殊用途的基因。
报道基因（reporter gene)
（1）大肠杆菌的β-D-葡萄糖苷酸酶 （β-D-glucuronidase，GUS）；
作用下，可以与荧光素和ATP底物发生反应，形 成与酶结合的腺苷酸荧光素酰化复合物，经过氧 化脱羧作用后，该复合物转变成为处于激活状态 的氧化荧光素，可以用荧光测定仪快速灵敏地检 测出产生的荧光，是目前研究动植物转基因很好 用的一种报告基因。
Luc基因检测十分迅速，灵敏度高，成本低，不 存在放射性同位素检测对人体健康和环境生态所 造成的危害，也没有内源荧光产生的背景干扰， 因此，Luc是一种理想的报告基因。
选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有 中止密码；（不破坏肽）。
β-半乳糖苷酶显色反应筛选法
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
蓝白菌落
筛选白色菌落
3.噬菌斑筛选法
噬菌斑(plaque)
噬菌斑是指在 宿主细菌的菌 苔上，噬菌体 使菌体裂解而 形成的空斑。
4.载体提供选择动植物转化细胞常用的标记基因
（2）细菌和萤火虫的荧光素酶 （luciferase）；
（3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因 （Green Fluorescent Protein）。
（4）其它
几种报道基因的作用原理
紫外光照
GFP
发绿色荧光
4-甲-β-D-葡萄糖苷酸 GUS 荧光产物
5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸 GUS
8.1 遗传学检测法
一、利用载体提供的表型特征筛选重组体
1 抗药性标记及其插入失活选择法
原理： pBR322质粒上有两个抗生素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
因插入外源DNA而导致基因失活的现象称之为插入失活效应。
对比两个平板上的菌落，凡在Tc平板上生长而在Ap平板上不能生长的菌落则是 重组质粒转化子克隆，挑选阳性克隆，分离出重组质粒。
pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素抗性基因 Tetr ： 抑制细菌生长，但不杀死细菌。
（2）氨苄青霉素抗性基因 Ampr ： 产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为 青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KIAampicillin）（蓝灰色）褪色。
②潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）赋予转化子能
抗潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植 物转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。
③氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）也被用于筛选
动植物转化子的标记基因。
④β-葡萄糖酸酶基因（GUS）
GUS的基因产物β-葡萄糖酸酶（GUS）能够催化
4-甲基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸，产生荧光物
无环丝氨酸培养基
氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
2.蓝白斑筛选法
乳糖 Xgal
-半乳糖苷酶
原理：
半乳糖 半乳糖
+ 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺 失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因 组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
8 重组体的筛选和鉴定
筛选（Screening） 遗传表型（phenotype）：是生物体遗传组成同环境 相互作用所产生的外观或其他特征。
本章教学目的和要求：
掌握常用的抗生素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶 联免疫吸附测定（ELISA）和免疫印迹（Western blotting）法的原理；了解转译筛选法和真核生物的报道 基因筛选法。