重组子的筛选与鉴定

第三节、转化/重组酵母菌的筛选
营养缺陷互补基因 显性标记基因
一、利用营养缺陷互补基因的筛选方法
原理：受体细胞为某种营养缺陷型突变株，即 不能合成某种营养成分，在缺乏该营养成分的 培养基上不能生长；
携带相应营养成分合成基因的载体转化受体菌 后，使细胞在选择培养基（不含某种相应营养 物质的培养基）中能够生长，而未被转化的细 胞不能生长。
red+gam+噬菌体可在P2噬菌体溶源菌中呈溶原生长， 被定为SPi+ （ sensitive to P2 inhibition，对P2介入敏感） red-gam-噬菌体在P2溶源菌中则呈溶菌生长，定为Spi-。
填充片段内含有red及gam基因的载体如EMBL3和EMBL4
三、杂交筛选
菌落或噬菌斑杂交筛选
二、 重组噬菌体DNA转入大肠杆菌后 重组子的筛选
（一）取代型载体：根据λ基因组的大小筛 选，直接挑取噬菌斑即重组子
机理： 空载体太小而不被包装，不进入细胞； 重组λ-DNA可包装成噬菌体颗粒并感染大 肠杆菌产生噬菌斑； 未感染菌生长成菌落。
（二）插入型载体
空载体及重组载体都可包装，需要插入 失活载体上的标记基因筛选。
1、氨基糖苷类药物磷酸转移酶基因：Neo （neomycin）。
2、博来霉素抗性基因：Zeo（Zeocin）。如 pFLD1载体、
（一）Neo选择系统
Neo基因编码氨基糖苷磷酸转移酶，可 以灭活氨基糖甙类抗生素，是新霉素 （neomycin）、新霉素衍生物G418、 卡那霉素等抗生素的抗药基因。
第一步：正选择。在不进行插入失活抗性基因的相应 抗生素平板上转化子可以生长，非转化子不能生长， 可将转化子直接从平板上挑出来；
第二步：负选择。在插入失活抗性基因的相应抗生素 平板上转化子中的非重组子（未插入外源基因）可以 生长，重组子（插入外源基因）不能生长，应与第一 种抗生素板进行对照并在其上挑出含重组子的菌落。
hfL：high frequence lysogenization
3、spi-筛选
用目的基因取代λ噬菌体取代型载体上含有redgam（整合 基因）的填充片段后，使噬菌体由red+gam+转变为redgam-，感染P2噬菌体溶源菌后使细菌由溶原生长转换为溶 菌生长。 利用这种特性进行的筛选称为spi-筛选。
胞内表达的载体主要有：pHIL-D2， pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10， pGAPZ， pGAPZa等
组氨醇脱氢酶基因（histidinol
dehydrogenase gene，his4）缺失的毕赤
酵母
主要有三类：GS115 、 SMDI168 、KM71 均不能合成组氨酸
指编码的产物能够使转化或转染的细胞在有选 择剂或营养缺乏的情况下很好生长或表现出其 他可视特征的基因。
构建载体时，目的基因与选择标记基因在载体 上的空间关系有两种：
1、独立存在。用于区分转化细胞与未转化细胞 2、目的基因插入选择标记基因编码区或其基因
调控部分。用于区分空载体转化细胞与重组载 体转化细胞
1、用转化反应液涂布含氨苄的LB平板，长 出转化子—Ampr ；
2、用无菌牙签将Ampr的转化子逐一挑在 Tc平板上（或用无菌丝绒布、无菌滤纸 影印），比较两块板上的菌落生长情况， 从Amp板上挑选出Tc板上不长的菌落即 为重组子。
注意：氨苄平板菌落密度不宜过大
影印平板培养法
利用lacZ′基因的插入失活筛选重组子
2、λ噬菌体的cI基因的插入失活筛选
——cI筛选法
原理：cI基因编码的阻遏蛋白可使感染 了λ噬菌体的大肠杆菌进入溶原化状态； cI基因的插入失活使感染了λ噬菌体的大 肠杆菌由溶原状态进入溶菌状态。 重组噬菌斑：无色透明 非重组噬菌斑：浑浊 未转化菌：正常菌落
Polylinker插入不影响lacZ′基因表达
单酶切时有这种情况
噬菌斑
2、 cI基因插入失活筛选
例：λgt10 － BNNl02（C600hflA ）系统 C600hflA是一种hflA突变菌；cI基因正常表达
的噬菌体在其中溶原生长，不形成噬菌斑； 但cI基因插入失活的重组噬菌体却能形成噬菌
斑（Young and Davis 1983a）。
载体需携带his4，转染后的阳性重组子可以
用不含组氨酸的平板进行筛选
含URA3的载体及其相应的受体细胞
载体： 酵母菌的Yep系列载体：含Amp、Tc和 URA3（尿嘧啶）标记基因
受体细胞：EGY48菌株
Amp、Tc抗性基因用于在大肠杆菌中筛选重组子 URA3标记基因用于酵母转化细胞的筛选
二、酵母常用显性标记基因
（二）插入表达筛选
载体的选择标记基因前连接一段负调控序列， 插入失活负调控序列后，其下游的筛选标记基 因才能表达。
如pTR262质粒，在Tc（Tet）基因前有来自噬菌体的cI 基因，可编码cI阻遏蛋白，抑制Tet表达。
cI基因（ HindⅢ或BglⅠ位点）插入失活，Tc基因表达， 受体细胞在Tc板上生长；未转化细胞及及空载体转化细 胞Tc表达被抑制，在Tc平板上不生长。
lacZ ′基因插入失活筛选：蓝白筛选 cI基因插入失活筛选：cI筛选 利用Spi（sensitive to P2 inhibition）表型选择： Spi筛选
选择标记基因
1、利用lacZ′基因的插入失活筛选重组噬菌斑
如含有lacZ′基因的M13噬菌体及多种λ噬 菌体载体（ λ gt11）
重组噬菌斑无色透明，非重组噬菌斑呈 蓝色，未转化细胞长出菌落
-半乳糖苷酶显色剂：生色底物
IPTG及其作用
IPTG：即Isopropyl- -D-thioagalactoside，异丙 基- -D-硫代半乳糖苷
作用：乳糖操纵子诱导物，和载体上携带的大
肠杆菌乳糖操纵子的调节基因（Lac I ）编码
产物—阻遏蛋白结合，阻止其与操纵基因结合， 使操纵子控制的基因（lacZ等）得以表达。
反应体系细胞的组成：
1、不含外源DNA的受体细 胞
2、含空载体的细胞（酶切 未切开或重新环化的载 体转化的细胞）
3、重组子：
（1）含目的重组DNA的细 胞
（2）含非目的重组DNA的 细胞
鉴定
对筛选出的重组子DNA进行进一步酶切、 测序等，鉴定是否为目的重组子及重组 子DNA序列的正确性等。
选择标记基因（selectable marker gene）
培养基上形成正常的白色菌落；
sup4被外源基因插入失活后重组子呈红色。
YAC 载体带有trp 1、 leu 2和 his 3、 ura3 以及 sup4
密码子改变成UAA的无义突变又叫赭石突变
第四节、转染的哺乳动物细胞筛选
一、哺乳动物细胞常用的选择标记基因
1、新霉素抗性基因： neo（neomycin）
非重组子：仅含有空载体分 子的转化子。
期望重组子与非期望重组子
期望重组子：含有外源目的基因的 重组子。
非期望重组子：携带非目的基因的 重组子。
转化子、重组子、期望重组子关系
转化子 重组子 期望重组子
筛选（screening）
一般指从反应体 系细胞群中辨别 挑选出转化子或 重组子的过程。
lacZ基因编码β-半乳糖苷酶； lacZ′基因编码β-半乳糖苷酶的N端 序列α片段 ，互补菌染色体上携带的缺陷基因编码C端片断，两者 互补（α-互补）形omo-4-Chloro -3-Indoly- -DGalactoside)，5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半 乳糖苷
酵母常用营养标记基因
第一类：氨基酸合成基因：
组氨酸合成酶基因HIS4 色氨酸合成酶基因TRP1 亮氨酸合成酶基因LEU2 精氨酸合成酶基因 ARG4
第二类：核苷酸合成基因：
尿嘧啶合成酶基因（URA3）
例：含HIS的载体
分泌型表达载体主要有：pPIc9，pPIc9k， pHIL-S1，pPIcza，pYAM75P6；
替代途径
黄嘌呤
XMP XGPRT （＋）
GMP
HGPRT基因选择系统组成
1、受体细胞：普通哺乳动物细胞
2、载体：含有 gpt基因的载体，如 pAG4622（人-鼠嵌合轻链 表达载体） ，pSV2gpt （人-鼠嵌合重链表达载体）
3、培养基：筛选XPGRT 活性缺陷细胞的HAT选择培养基组 成如下：
霉酚酸 黄嘌呤（合成鸟苷酸GMP ） 腺嘌呤 胸苷（合成胸腺嘧啶） 透析除去鸟嘌呤的血清
霉酚酸能抑制次黄嘌呤核苷酸脱氢酶的作用而阻断嘌 呤核苷酸的经典合成途径。
携带gpt的载体转化受体细胞后，使受体细胞在含霉酚
酸的HAT培养基中启动核苷酸合成替代途径，利用培 养基中补加的黄嘌呤合成GMP，得以存活。
合成GMP 的不同途径
正常途径（经典途径）
IMP
XMP
GMP
（次黄苷酸）霉酚酸（×） （黄苷酸） （鸟苷酸）
报告基因（reporter gene）
指载体上携带的、表达产物容易被检测且能够 指示外源基因导入受体细胞与否及表达水平的 基因。
构建载体时，一般将报告基因与目的基因融合， 并将报告基因置于目的基因启动子控制之下， 报告基因与目的基因同步转化与表达。
第二节、大肠杆菌重组体的筛选
一、质粒载体转化大肠杆菌细胞的筛选
例
如pBR322质粒含有TC r、Amp r两个抗药性基因，外源 基因插入失活TC r后，会有三种不同表现的细胞:
未转化的受体细胞— TC sAmp s 含载体的转化菌落－ Ampr Tcr 含重组体的阳性菌落—Ampr Tcs
空载体转化菌落
空载体转化菌落及 重组载体转化菌落
筛选具体做法
含Lac I 的载体：如pUC8，需要诱导物 不含Lac I 的载体：如pUC18/19，不需诱导物