基因工程第七章 重组子的筛选和鉴定

等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操 作中形成的喷雾、 试剂及任何与扩增产物接触的东 西。
菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物 理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数 不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法 可用于检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分 破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙 签点在LB（+Amp）平板，记录号码。 在PCR管中加其他成分（最后加酶） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。
菌落PCR和常规PCR的比较
菌落PCR：
常规PCR：
1、抗体与产物的结合方式 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性 质可分为几种作用方式：
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 125I标记的二抗
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
3、菌落PCR
是直接以转化菌的单个克隆为模板，通过特 异性引物或通用引物对插入载体中的目的基因快 速扩增，用于鉴定和筛选阳性转化菌的技术。
与传统的鉴定方法相比，由于其具有快速、 经济、简便的特点而被广泛用于转化菌、特别是 大量转化子的鉴定和筛选 。
操作步骤
在PCR管中加7.5μL无菌水。 为平板上将要挑取的菌落标上号码（每组挑取8个
2、基本操作
将外源基因克隆在pUC18 的lacZ’标记基因内部，使之灭 活，此时重组子呈Apr、lacZ-， 白色菌落；而非重组子则呈Apr、 lacZ+，蓝色菌落。
将转化后的受体细胞涂布 在含有X-gal和乳糖诱导物IPTG 的培养基中，培养一段时间后观 察菌落颜色。
二、根据插入基因的表型筛选 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活筛选法
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素 抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
（3）影印平板筛选法
若在Tetr中插入外源DNA则：
先将转化液涂布含有Amp 的平板；
再将Amp平板上的转化子 影印至含有Tet的平板上；
在Amp平板上生长、但在 Tet 平板上不长的转化子即 含有目的重组子。
退火温度由 58℃ 提高到62℃ 是由于原来引物 中的酶切位点和保护碱基与待扩增的基因是不配对 的，现在配对的数量增多，退火温度越高,特异性越 强。
循环次数减少是因为25～30个循环的扩增量 足够进行检测，如果量太大跑出的电泳条带呈现︼ 型，不易确定分子量。
菌落PCR出现假阳性 样品污染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染
二、免疫沉淀检测法
主要检测分泌型产物。 1、原理
抗原—抗体沉淀反应。
2、方法
把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入 基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时， 就会与抗体反应形成“沉淀圈”。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位 溶菌处理（溶菌酶）。
三、酶联免疫吸附测定（ELISA）
Enzyme-linked immunosorbant assay
1、原理： 一抗（primary antibody）: 与目的蛋白特异结合。 二抗（secondary antibody）：与一抗的特异性结合。
二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底 物转变为有色的物质，再通过比色测定有色物质的 含量（或吸光度），从而检测目的蛋白的存在。
待测基因 产物蛋白
一抗
二抗
1、原位杂交筛选
特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以 直接找出阳性菌落。
2、斑点印迹杂交
3、R-环检测法
（1）原理： DNA-RNA杂交。
（2）选择过程 用外源基因的mRNA与重组载体杂交。
在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的 时候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链 更稳定。电镜下可见一种R-环形结构。
1、弥补缺陷 营养缺陷型筛选法
转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌 株的突变型缺陷。
受体菌： his外源基因： his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2、增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
例： 小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二 氨嘧啶有抗性。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
第七章 重组子的筛选和鉴定
由于重组率和转化率不可能达到理想极限， 因此必须借助各种筛选和鉴定方法，区分转化子 与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与 非目的重组子。
重组子筛选和鉴定常用方法
遗传学检测法 核酸分子杂交检测法 物理检测法 外源基因产物检测 核酸序列分析及其他方法
第一节 遗传学检测法
（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： （Polyacrylamide gel electrophoresis）
在电场的作用下线性蛋白 质链在聚丙烯酰胺凝胶介
电泳buffer
质中向正极移动，移动的 速率主要取决于其分子量 大小（链的长短），从而 把不同分子量的肽链分开。
电泳buffer
点样
电泳方向
最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）
四、免疫印迹（western blotting）法
在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测 胶上的蛋白质泳带。
1、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
（SDS-PAGE）： （1） SDS:
是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白 质维持线性状态，并与蛋白质结合，使 蛋白质带上负电荷。
一抗
二抗
125I 标记的二抗 结合蛋白
2、基本原理
① 一种免疫血清含有多种IgG抗体，它们识别不同 的抗原及其表位；
② 抗体分子能够十分牢固地吸附在固体基质（如聚 乙烯）上，而不会被洗脱掉；
③ 通过体外碘化作用，IgG抗体便会迅速地被放射 性同位素125I标记上，制备二抗。
3、放射性抗体检测法过程
Da
（3）蛋白Marker
已知分子量的蛋白质混合 液，与待测样品一起电泳， 为样品蛋白质提供分子量 估计。
商品化供应
道尔顿(质量单位, 等于 一氧原子质量的十六分 之一。 一克约为6×1023道尔顿
Dalton SDS PAGE
（4）凝胶中的蛋白质染色： ① 直接染色 考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出>0.3-1μg/带，但可褪色回 收。
一、根据载体表型筛选 （一）、抗药性标记及其插入失活筛选法
1、原理： pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。
Tetr上有插入位点BamH I和Sal I;
Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
2、pBR322抗菌素标记选择 （1）四环素： 抑制细菌生长，但不杀死细菌。 （2）氨苄青霉素抗性基因： 产生-内酰胺酶，使碘-青霉素指示液（I2-KIAampicillin）（蓝灰色）褪色，变为白色。
缺点：需要电镜！
4、Southern印迹杂交
Southern blot 筛选
结果
5、 Northern blotting
用DNA（或RNA） 探针检测RNA样品。
主要检测插入片段 是否被转录。
从宿主细胞中提取 RNA，再用探针杂 交。
第三节 物理检测法—电泳检测法
一、直接电泳检测法
1、基本原理： 质粒的电泳速率与其分子量成反比，因此分
或用合适的内切酶切下插入片段，再用其它酶 切这个片段，电泳后比较结果是否符合预计的 结果。
A
BAΒιβλιοθήκη B空 载 重体 组 载 体
不同克隆的酶切结果
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
三、PCR扩增检测法
1、原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片段。
2、过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片段引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
设阴性对照 操作过程：
（1）菌落PCR完毕后电泳检测带型，在LB 平板上挑选有正确带型的菌落。
（2）阳性克隆提取质粒 （3） 酶切检测条带的分子量 （4） 测序，检查点突变
第四节 免疫化学检测法