基因工程第七章 重组子选择筛选与分析

2．利用报告基因筛选植物转化细胞 在植物转基因研究中，载体携带的选择标记基因（selective gene）经常称为报告基因(reportor gene)，常用的报告基因有 抗生素抗性基因以及编码某些酶类或其他特殊产物的基因等。
（1）利用抗生素报告基因筛选植物转化细胞 ① 新霉素磷酸转移酶（neomycinephosphotransferase-II, NPTII）基因 新霉素(neomycin)与卡那霉素(kanamycin)、庆大霉素和 G418 等均属于氨基环醇类的抗生素，它们的结构相似，能抑制原核 细胞核糖体70S起始复合物的形成，从而阻碍了蛋白质的合成， 进一步抑制了细胞的生长。NptII基因催化ATP上- 磷酸基团转 移到上述抗生素分子的某些基团上，从而阻碍抗生素分子与靶 位点的结合，并使抗生素失活。因此，在含有上述抗生素的选 择培养基上培养植物转化材料仅有携带NptII基因的转化植物细 胞才能存活下来。
（1）抗药性筛选
这是利用载体DNA分子上的抗药性筛选标记进行筛选的方法。主要用 于重组质粒DNA分子的转化子筛选。重组质粒DNA分子携带特定的抗 药性选择标记基因，在含有相应选择药物的选择培养基上正常生长。 ① 氨苄青霉素（ampicillin，Ap 或Amp）: 含bla基因的菌体能转译 丙酰胺酶(-lactarnase)，可降解Ap。 ② 氯霉素 (chloramphenicol, Cm 或 Cmp): 含 cat基因的菌体能转译氯 霉素乙酰转酰酶 (chloramphenicol acetyltransferase)，使Cm乙酰化 而失效。 ③ 卡那霉素 (kanamycin, Kn或 Kan): 含Kan抗性基因菌体转译一种能 修饰Kn的酶，阻碍Kn对核糖体的干扰。 四环素(tetracymic, Tc或 Tet): 含Tc抗性基因的菌体转译一种能改变细 菌膜的蛋白，防止Tc 进入细胞后干扰细菌蛋白质的合成。 ⑥ 链霉素(strentomycin, Sm或 Str): 含Str 抗性基因的菌体转译一种能 修饰Sm的酶，抑制Sm与核糖体结合。
（2）插入失活筛选法 外源DNA片段插入载体DNA的BamHI位点，导致载体Tcr基因 失活，重组子具有AprTcs的遗传表型，而非重组子则为AprTcr， 重组子只能在Ap板上形成菌落而不能在Tc板上生长；非重组子 却在两种平板上都能生长。
β-galactosidase X-gal IPTG blue-coloured
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第一节 转基因筛选和选择的方法 转化子：将导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细 胞称为转化子 重组子：含有重组DNA分子的转化子被称为重组子 阳性克隆子：如果重组子中含有外源目的基因则又称 为阳性克隆子或期望重组子。 克隆子的筛选或选择：经过各种方法将外源DNA分子 导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克 隆子的筛选或选择。
（3）插入表达筛选法 插入表达法是利用外源目的基因插入特定载体后能激活筛 选标记基因的表达，由此进行转化子的筛选。例如pTR262质 粒载体，其Tcr基因的上含有一段噬菌体DNA的CI阻遏蛋白编 码基因及其调控序列，CI基因表达的阻遏蛋白可以抑制Tcr基因 的表达。当外源DNA片断插入CI基因的 HindIII 或 Bgl I 位点上 时，CI基因失活，Tcr基因因阻碍解除而得以表达，故阳性重组 子为Tcr表型，含有外源DNA插入片断的阳性重组子的转化菌才 能生长成菌落。
（2）利用生化报告基因筛选植物转化细胞
① -葡萄糖酸苷酶（-Glucuronidase, GUS）基因 作为一种水解酶，转化植物细胞所产生的-葡萄糖酸苷酶能够催化某些特殊反应的 进行，通过荧光、分光光度和组织化学的方法对这些特殊反应产物的检测即可确定 Gus报告基因的表达情况，以此区分转化子和非转化子。
பைடு நூலகம்
② 潮酶素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase, HPT)基因 某些植物细胞株系（如水稻）对卡那霉素具有一定的抗性，利 用卡那霉素筛选NptII基因转化体时假阳性率高，这时可采用 Hpt报告基因进行筛选。潮霉素原是一种链霉菌的产物，通过 与70S和50S核糖体的结合来抑制许多原核生物与真核生物的 生长。HPT酶能催化ATP上的- 磷酸基团转移至潮霉素分子上 而使之失活。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。 ③ 氯霉素乙酰转移酶（chloraphenicol acetyltransferase, CAT）基因 氯霉素可选择性地与原核细胞核糖体50S亚基结合，抑制肽酰 基转移酶的活性，从而阻断肽键的形成并最终抑制细胞生长。 CAT基因催化乙酰辅酶A转乙酰基，使氯霉素失活。
1．根据载体选择标记初步筛选转化子 载体DNA分子上通常携带了一定的选择遗传标记基因，可 进行转化子或重组子初步筛选。做法是将转化处理后的菌液 （包括对照处理）适量涂布在选择培养基上，在最适生长温度 条件下培养一定时间，观察菌落生长情况，即可挑选出转化子。 对于受体细胞而言，通常用LB培养基，在LB 培养基中加入 适量的某种选择物，即为选择培养基。选择物是由载体DNA分 子上携带的选择标记基因所决定。 （1）抗药性筛选法 （2）插入失活筛选法 （3）插入表达筛选法
第七章 重组子选择、筛选和分析
（ The Selection, screening and analysis of recombinants）
教学目的与要求： 1 ) Genetic selection and screening methods 2) Screening clone banks by nucleic acid hybridization （Southern blotting，Northern blotting） 3) Immunological screening for expressed genes (Western blotting) 4) Analysis of cloned genes (Restriction mapping, DNA sequencing)