chap 10 animal

–大多数动物细胞继代培养后会转换成有限细 胞系和永久细胞系两类
3．有限细胞系和永久细胞系
有限细胞系(finite cell line)：即使培养条件均能满足细
胞繁殖生长，它们也只能在有限的时间内生存，经过运动
世代后细胞将逐渐死亡。 有限细胞系的存活时间的长短因细胞来源的年龄和种族不同 而有差异。年龄越大继代次数越少。人胚成纤维细胞约可 以培养50代，而成年人的成纤维细胞则不能继代50次，同 样是成纤维细胞，取自鸡胚的成纤维细胞可继代培养30代， 而小鼠的只能培养8代。
动物干细胞研究概况
第一节 动物细胞工程的主要领域及意义
单克隆抗体与现代医学 动物胚胎工程与畜牧业
动物细胞规模化培养与现代医药业
动物克隆的有益应用
一. 单克隆抗体技术与现代医学
单克隆抗体技术是用骨髓瘤细胞 (myeloma cell)与经特定抗源免疫 刺激的B淋巴细胞(antigen
stimulated B lymphoblast)融合
G1 8h 10.5h 5.7h 4.7h 1～10d
S 8.0h 7.6h 8.5h 4.1h 20h
G2 4.0h 3.2h 3.8h 2.8h 2~3d
M 0.8h 0.8h 1h 0.8h 1.0h
2．接触抑制(contact inhibition)现象
除少数悬浮培养细胞外，大多数正常二倍体细胞的生长都需要
促红细胞生成素、促间质细胞激素、绒膜促性腺激素、促黄体激素、 促滤泡激素、生长激素 白细胞活化因子、转移抑制因子、胸腺素、白细胞介素、干扰素、血 清胸腺因子、巨噬细胞毒力因子、β-细胞生长因子
激素 免疫调节因 子
四. 动物克隆技术的有益应用
动物克隆技术至少在以下几个方面具有广阔
的应用前景： 保存优良的动物品种； 拯救濒临灭绝的珍惜动物； 利用克隆动物工厂生产蛋白质药物，发
MRC-5 英国国立医学研究所Jacobs等人1966年从14周的正常男性 胚肺组织中获得，2n=46，属成纤维细胞，培养基采用BME附加10％ 的小牛血清。其倍增时间比WI-38短，对不良环境的敏感性比WI-38 低，用于生产人体疫苗。
Namalwa 它是上个世纪70年代由Singh从肯尼亚患有Burkitt淋巴 瘤的病人体中获得，后在瑞典Katolinska研究所建成的一株类淋巴 母细胞，该细胞系具有2.8%的高倍体率，多数细胞有12-14条标记 染色体，单个X染色体，无Y染色体。培养基采用RPMI1640附加7%的 胚牛血清。已被大规模用于生产α-干扰素。
4．动物细胞的环境敏感性
动物细胞与微生物和植物细胞相比，其培养难度要大一些，
其主要原因是动物细胞只有细胞膜，而没有细胞壁的保护。
动物相比对培养环境十分敏感，一切影响细胞膜变形的因素 都会影响动物细胞存活。 动物细胞培养对营养条件的要求也十分复杂。
第三节 动物细胞培养的环境与营养要求
动物细胞培养 的环境要求
3．有限细胞系和永久细胞系
永久细胞系或称连续细胞系：有限细胞系转换成永久细胞系的过度期 称为转换期(crisis)。 永久细胞系有如下特征：细胞形态变化，如细胞变小，黏附性减少， 具有较高的核质比；生长速率增加，倍增时间缩短；对血清的依
赖性减小；贴壁依赖性降低；细胞异倍体和非整倍体增加，细胞
接种到体内后，生癌率上升。永久细胞系的建立是动物细胞规模 化培养的前体。
二. 培养条件下动物细胞生长特性
在活体内，动物细胞在胚胎期即已高度分化，而且这种分化 是不可逆转的。 活体内的动物细胞按照分裂能力可以分为三大类：
第一类是能保持继续分裂能力的细胞-干细胞，可以继续不断地 分裂，如骨髓干细胞、各类前体细胞； 第二类细胞群是永久失去分裂能力的细胞，如各类高度特化的 细胞； 第三类是静止细胞群，即所谓的G0细胞，在正常情况下，它们 不分裂，也不合成DNA，但在受到刺激后，则重新进入细胞分 裂。如人的肝脏细胞等。 第一类和第三类细胞在适当条件下可进行离体培养。
移植、性别控制和基因导入，可望工厂化生
产遗传性稳定、生产性能优良的家畜，以加 快农畜良种化。
三. 动物细胞规模化培养与现代医药
动物细胞培养的产物
类 型 产 物
人疫苗
小儿麻痹症、狂犬、风疹、脑炎、乙肝表面抗源、疱症、某些癌症
动物疫苗
酶
口蹄疫、鸡痘病、猪霍乱、马脑炎、牛痢疾、犬瘟、草鱼出血病、犬 瘟病、 尿激酶、细胞色素P450、胃蛋白酶、胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶原激活 剂、胶原酶、酪氨酸脱羧酶、
植物细胞外面有细胞壁，而细胞之间有一层胶状物即胞间层
（middle lamella）将两个细胞粘合在一起，在两个相邻细胞之
有胞间连丝（plasmadesma）使细胞间相互流通。
动物细胞的细胞质中溶酶体 （lysosomes）较发达，同时还 含有许多酶原粒。
而植物细胞中则含有较多的质
体(plastid)，包括叶绿体 (chloroplast)、白色体 （leucoplast）和杂色体 (chromoplast)。
常用人工合成培养基组成及含量（mg/）
成 分 氨基酸 L-精氨酸 L-精氨酸•HCl L-天门冬氨酸 L-光氨酸 L-谷氨酸 L-谷氨酰胺 292 534 24 48 126 84 20 50 20 300 200 MEM DMEM RPM1640 成 分 VB12 VB6 VB1 盐酸吡哆醛 烟酰胺 异肌醇 叶酸 1.0 1.0 1.0 2.0 1.0 4.0 4.0 4.0 7.2 4.0 1.0 35 1.0 MEM DMEM RPM1640 0.005 1.0 1.0
2. 合成培养基
合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质对细胞体 内生存环境中已知物质在体外人工条件的模拟，经过反复 试验筛选、强化和重新组合后形成的培养基。这种培养基 在很多方面有天然培养基无法比拟的优点，它既能给细胞 提供一个近似于体内的生存环境，又便于控制和提供标准 化体外生存环境。
目前用于动物细胞培养的合成培养基种类很多，一般均包
得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)， 杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样
在体外无限增殖，又具有B淋巴细
胞产生特异性抗体的能力。因此， 单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术
(hybridoma technology)。
单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可提高疾病诊
断准确性。
单克隆抗体疫苗，可增加疫苗安全性。
单克隆抗体用于某些肿瘤治疗。
单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究。
二. 胚胎工程与畜牧业
利用胚胎技术可以以工厂形式大批量生产优质胚胎，从而可以
降低胚胎成本，扩大移植胚的来源，使农畜动物胚胎移植的推 广应用成为可能。 体外受精可以准确地确定受精的时间和胚胎 发育阶段，因此，利用体外受精技术进行核
2. pH
动物细胞培养适宜的pH一般在7.2-7.4，低于6.8或高于7.6都 不利于细胞生长，严重时会导致细胞死亡。
培养细胞对pH的要求因培养时间长短有关，一般原代细胞要求
较严格，而永久细胞系对pH具有较强的忍耐性。
3. 溶氧及气体环境
一般细胞在培养初期要求较低的溶氧水平，而在对数生长期 或培养后期，对溶氧水平要求增加，如果供氧不足，将导
含氨基酸、维生素、糖类、无机离子和其它辅助成分。
尽管各种合成培养基给细胞培养带来极大方便，但许多实 验表明，单纯使用合成培养基细胞的贴壁、增殖效果常常
不理想。因此，在使用时通常仍然需要加入一定量的动物
血清，常用的动物血清有小牛血清、鸡血清等。 常用的人工培养基MEM，DMEM，RPM1640
甘氨酸
L-组氨酸 L-组氨酸•HCl L-羟脯氨酸 L-异亮氨酸 L-亮氨酸 L-亮氨酸•HCl L-甲硫氨酸 L-苯丙氨酸 L-脯氨酸 L-丝氨酸 L-苏氨酸 L-色氨酸 L-酪氨酸 L维生素 VB2 生物素 D-泛酸钙 1.0 0.1 43 10 36 47 52 52 73 15 33 42
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动物细胞培养 的营养需求
一. 动物细胞培养的环境要求
1. 温度
温度是细胞体外生存的基本条件之一，来源不同的细胞， 其最适生长温度不尽相同
如昆虫细胞培养温度一般是25～28℃ 哺乳动物细胞的培养温度一般是37℃。 总体上讲，动物细胞忍受低温的能力比忍受高温的能力强。如哺乳 低温细胞在45℃下只能存活1小时，但在25℃条件下仍然能慢速生 长，并维持长时间不死，甚至在4℃下数小时后，再臵于适宜温度 下细胞仍然可以正常生长。
二. 培养条件下动物细胞生长特性
离体培养的动物细胞可分为：
贴壁依赖型：包括成纤细胞型、上皮细胞型
非贴壁依赖型：悬浮型细胞，如血液、淋巴组 织的细胞
兼性贴壁细胞：如中国地鼠卵巢细胞、小鼠 L929细胞
三. 培养条件下动物细胞的生理特点
1. 动物细胞的分裂周期长
动物细胞分裂周期一般为12～48小时，它不仅随细胞种属的
0.25
第四节 动物细胞培养技术简述
原代培养
细胞克隆选择 细胞系增殖与放大培养
大规模培养体系建立
常用克隆细胞系
WI-38 由美国人Hayflick等1961年从一女性高加索人的正常胚肺 组织中获得。2n=46，属成纤维细胞，培养基采用BME附加10％的小 牛血清，是最早被认为可安全传代的细胞系，在20世纪60年代广泛 用于制备疫苗。
10
15
氯化胆碱
对氨基苯甲酸 无机盐
1.0
4.0
3.0
1.0
42 20 105 105 146 30 66 50 50 40 15 15 20 42 95 16 72 94 30 20 5 20 20
CaCl2 Fe(NO3)39ּH2O KCl MgSO47ּH2O NaCl NaHCO3 NaH2PO4ּH2O Na2HPO47ּH2O (CaNO3)24ּH2O 其它成分 D-葡萄糖 KI 亚油酸