浓香型和芝麻香型白酒酒醅中微生物菌群的研究

Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： ＰＣＲ－ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （ＤＧＧＥ） ａｎｄ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｌｉｂｒａｒｙ ｗｅｒｅ ｐｕｔ ｉｎｔｏ ｐｒａｔｉｃｅ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｋｎｏｗ ｔｈｅ ｒｕｌｅｓ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｇｒａｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｏｎｇ ａｒｏｍａ ｓｔｙｌｅ ａｎｄ ｒｏａｓｔｅｄ ｓｅｓａｍｅ ａｒｏｍａ ｓｔｙｌｅ ｌｉｑｕｏｒ ｉｎ Ｊｉａｎｇｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＤＧＧＥ ｐｒｏｆｉｌｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｖｏｒａｎｓ ｂｅｃａｍｅ ｔｈｅ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｔ ｔｈｅ ｅｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｂｌａｓｔｉｎｇ ｏｆ ｃｌｏｎｅｓ， ｏｎｌｙ Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ， Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｎｄ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｗｏ ｃｌｏｎｉｎｇ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ． Ａｎｄ ｓｏｍｅ ｇｅｎｕｓｅｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ａｎｄ ｎｏｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｖｉｏｕｓ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ ｏｆ ｌｉｑｕｏｒ Ｄａｑｕ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｇｒａｉｎｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： ｍｉｃｒｏｂｅ； ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｇｒａｉｎｓ； １６Ｓ ｒＲＮＡ； ｃｌｏｎｉｎｇ ｌｉｂｒａｒｙ；ＤＧＧＥ
工作由捷瑞 （ 上海） 完成。得到的序列通过 Ｇｅｎｅｂａｎｋ （ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／） 和 Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ ＰｒｏｊｅｃｔⅡ（ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ． ｅｄｕ／， ｒｅｌｅａｓｅ ９． ４０） 进行比较、鉴定， 寻找与目的序列同源性最高的已知分 类地位的菌种的 １６Ｓ ｒＲＮＡ 序列。
基金项目：中国白酒 １６９ 计划， 国家科技支撑计划（ ２００７ＢＡＫ３６Ｂ００） 。 收稿日期： ２００８－ ０１－ １０ 作者简介：王海燕（ １９７７－ ） ， 女， 江苏人， 讲师， 博士研究生， 研究方向为环境微生物分子生态学。 通讯作者：徐岩（ １９６２－ ） ， 教授， 博士生导师。Ｅ－ ｍａｉｌ： ｙｘｕ＠ｊｉａｎｇｎａｎ．ｅｄｕ．ｃｎ。
物构成。本研究采用 ＰＣＲ－ ＤＧＧＥ 技术， 动态检测、比较 法提取质粒， 载体特异引物 Ｔ７、ＳＰ６ 扩增获得 １６Ｓ ｒＲＮＡ
了浓香型和芝麻香型白酒酒醅在窖池发酵过程中细菌 片段； 选用 Ｈｉｎｆ Ｉ 和 Ｃｓｐ６ Ｉ 对 ＰＣＲ 产物进行酶切分型，
菌群结构的变化过程， 并通过构建 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因克隆 按酶切图谱将克隆子分成不同的操作分类单位； 每个操
１６Ｓ ｒＲＮＡ 全长扩增产物通过琼脂糖凝胶纯化回收
Ｎ１～Ｎ５： 浓香型酒醅（ 隔 ６ ｄ、６ ｄ、１０ ｄ、２０ ｄ 和 ２０ ｄ 取样） ； Ｚ１～Ｚ６： 芝麻香型酒醅（ 每隔 ５ ｄ 取样）
图 １ 不同时间点采集的浓香型和芝麻香型白酒酒醅 样品的 ＤＧＧＥ 指纹图谱
如图 １ 所示， 随着发酵时间的延长， 浓香型和芝麻 香型酒醅中的细菌多样性呈下降趋势。在发酵起始阶 段， ２ 种酒醅中微生物种类丰富。浓香型酒醅在入池发 酵约 １２ ｄ 后， 出现一条明显的亮带， 发酵约 ２０ ｄ 后此条 带消失； 而芝麻香型酒醅在发酵的第 ５ 天， 有两条条带 亮度突然增加， 随后亮度逐渐降低。可见这 ２ 条条带对 应的微生物在发酵过程中数量上变化很大。浓香型和芝 麻香型酒醅中的细菌群落结构差异较大。所以通过 ＤＧＧＥ 电泳， 可以区分两种不同香型酒醅发酵过程中的 微生物多样性。 ２．２ ＤＧＧＥ 图谱中主要条带的分子鉴定
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酿酒科技 ２００８ 年第 ２ 期（ 总第 １６４ 期）·ＬＩＱＵＯＲ－ ＭＡＫＩＮＧ ＳＣＩＥＮＣＥ ＆ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ２００８ Ｎｏ．２（Ｔｏｌ．１６４）
浓香型和芝麻香型白酒酒醅中微生物菌群的研究
王海燕 １， 张晓君 ２， 徐 岩 １， 赵立平 ２
（ １．江南大学生物工程学院教育部工业生物技术重点实验室， 江苏 无锡 ２１４１２２； ２．交通大学生命科学技术学院 微生物分子生态学与生态基因组学实验室， 上海 ２００２４０）
基 因 组 总 ＤＮＡ １６Ｓ ｒＲＮＡ Ｖ３ 区 扩 增 片 段 通 过 ＤＧＧＥ（ Ｂｉｏ－ Ｒａｄ） 分离研究微生物群落。丙烯酰胺凝胶 浓度为 ８ ％， 变性梯度范围为 ２８ ％～５２ ％（ １００ ％变性 剂为 ７ ｍｏｌ／Ｌ 尿素和 ４０ ％去离子甲酰胺） ， ＰＣＲ 产物上 样量为 ２００ ｎｇ。在 ２００ Ｖ、６０ ℃条件下电泳 ２４０ ｍｉｎ。电 泳完毕用 ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ（ １×ＴＡＥ， １∶１００００） 染 色 ４５ ｍｉｎ， 通过 ＵＶ Ｉ 成像系统来成像。对图谱中的主要条带进行 切胶回收， 通过重新扩增、克隆、比对、测序， 并对其序列 进行分鉴定酒醅中含有的微生物类群。
作分类单位选择 １ 个转化子进行 ＤＮＡ 序列测定， 测序
１ 材料与方法
１．１ 样品采集 采用江苏某酒厂两种香型的 ２ 个生产用窖池， 取样
时 间 是 ２００６ 年 ９ 月～１１ 月 ， 分 析 样 品 为 窖 池 中 心 酒 醅。２ 个窖池均是 ９ 月 ２２ 日开始入池发酵， 发酵周期分 别为 ６０ ｄ 和 ３０ ｄ。样品密封后冷冻保藏备用。
Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒ ｉａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ Ｆｅｒ ｍｅｎｔｅｄ Ｇｒ ａｉｎｓ ｏｆ Ｓｔｒ ｏｎｇ Ａｒ ｏｍａ Ｓｔｙｌｅ ａｎｄ Ｒｏａｓｔｅｄ Ｓｅｓａｍｅ Ａｒ ｏｍａ Ｓｔｙｌｅ Ｌｉｑｕｏｒ
ＷＡＮＧ Ｈａｉ－ｙａｎ１， ＺＨＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｊｕｎ２， ＸＵ Ｙａｎ１ ａｎｄ ＺＨＡＯ Ｌｉ－ｐｉｎｇ２
我国对白酒的研究历史久远， 但对大曲、窖泥、酒醅
等微生物群落结构的研究主要集中于传统的分离、培养 和初步鉴定［１～４］。目前认为， 利用现有手段， 自然界中可 培养的微生物仅仅占到微生物总数的 ０．１ ％～１０ ％； 而 且分离培养方法会改变原始菌群的微生态构成， 无法分 析微生物之间以及微生物与环境之间的相互关系 。 ［５～６］ 近年来， ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ （变性 ／ 温度梯度凝胶电泳）［７～８］、 ＥＲＩＣ （肠杆菌基因间保守重复序列）－ ＰＣＲ［９］和实时荧光 定量 ＰＣＲ［１０］等基因指纹图谱技术， 被广泛运用于分析复 杂环境样品微生物群落结构的研究中。其中， ＤＧＧＥ 具 有检测极限低、易操作、可重复性强等特点， 并可切胶回 收其条带进行序列分析， 从而可以鉴定细菌组成， 研究 种群结构。
白酒以多菌系固态发酵工艺赋予其独特的风格特 征， 浓香型和芝麻香型白酒的生产均依赖于酒醅在密闭 窖池中的多微共酵， 形成复杂的白酒成分， 尽管这些微 量成分只占总量的 ２ ％～３ ％， 也正是这些微量成分决 定了白酒风味与口感。由此可见， 微生物的代谢活动对 白酒的品质影响重大。同时， 在发酵过程中， 随着营养物 质的消耗和代谢产物的积累， 窖池中微环境发生了改 变， 例如 ｐＨ 下降、乙醇含量提高等， 又转而导致酒醅中 微生物的种类和数量发生相应的变化。所以， 酒醅中微 生物的菌群结构既体现了窖池中的微环境， 又影响了发 酵后期风味物质的形成， 最终将会影响白酒品质。
王海燕， 张晓君， 徐 岩， 赵立平·浓香型和芝麻香型白酒酒醅中微生物菌群的研究
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浓香型和芝麻香型白酒在生产工艺上存在异同之 后， 参考 ｐＧＥＭ－ Ｔ Ｅａｓｙ 说明书及参考文献［１５］， 与载体
处， 不同的生产技术将会影响窖池发酵时酒醅中的微生 ｐＧＥＭ－ Ｔ ｅａｓｙ 连接， 转化大肠杆菌。阳性克隆用碱裂解
摘 要： 对白酒窖池发酵的全程跟踪取样， 借助于 ＰＣＲ－ 变性梯度凝胶电泳（ ＤＧＧＥ） 和 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因 文 库 两 种 方法， 对比研究了江苏地区浓香型和芝麻香型白酒酒醅在发酵过程中的微生物菌群结构。ＤＧＧＥ 图谱分析显示， 随 着发酵时间的延长， 酒醅中的微生物多样性不断降低 ； 发 酵 结 束 时 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｖｏｒａｎｓ 成 为 最 主 要 香型和芝麻香型酒醅中的微生物种属存在巨 大 差 异 ， 仅 有 Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ 和 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ４ 个 属 的 微 生 物 在 两 个 文 库 中 均 能 检 测 到 ， 发 现 并 鉴 定出在白酒曲药和酒醅的研究中尚未报道的细菌属。 关键词： 微生３； ＴＳ２６１．４； Ｑ９３－ ３； Ｑ７８ 文献标识码： Ａ 文章编号： １００１－ ９２８６（ ２００８） ０２－ ００８６－ ０４
（１． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ， Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｘｉ， Ｊｉａｎｇｓｕ ２１４１２２； ２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｊｉａｏ Ｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２４０ ，Ｃｈｉｎａ）
２ 结果与分析
１． ２ 药品
２．１ 浓 香 型 与 芝 麻 香 型 酒 醅 细 菌 的 ＤＧＧＥ 指 纹 图 谱
ｄＮＴＰ， Ｘ－ ｇａｌ 和 ＩＰＴＧ 购 自 上 海 博 采 生 物 技 术 公 （ 图 １）