最新3第三讲限制性酶切方式及连接汇总
限制性核酸内切酶切割原理方法结果分析及应用
5.DNA 酶 切 位 点 没 有 甲 基 化
( 如 Dpn1) 6.DNA 位点上存在其它修饰 7.DNA 不存在该酶识别顺序
验证
二 . 如果 DNA 切割不完全？ 1. 内切酶活性下降 2. 内切酶稀释方法不正确 3.DNA 不纯，反应条件不佳 4. 内 切 酶 识 别 的 DNA 位 点 上 的 碱 基 被 甲 基 化 或 存 在其它修饰 5. 部分 DNA 溶液粘在管壁上 6. 内切酶溶液粘度大，取样不准 7. 酶切后 DNA 粘性末端退火 8. 由于反应溶液、温度使内切酶变性 9. 过度稀释使酶活性降低
应用二
利用pBR322作为载体重组人体的抑生长激素也是一 个经常提到的应用例子。其过程和水稻叶绿体基因重组 大同小异，只是除了在质粒载体上插入抑生长激素基因 外，还将含有lac操纵子起始部分的片段（包括启动子， 操作区，核糖体集合位点和β-半乳糖苷酶的主要部分） 插在抑生长激素基因的旁边。由于有了lac操作子的控 制，重组基因产生的蛋白质的调节就变得比较容易了
限制性核酸内切酶切割原理、
方法、结果分析及应用
PPT制作：杜雨濛、张佳佳、陈靓
课堂内容回顾：
1、定义： 1、定义：限制性核酸内切酶是可以识别特 定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的 两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一 类酶，简称限制酶。 2、分类：
（根据酶的基因、蛋 白质结果、依赖的辅 助因子及DNA裂解的 特异性，将限制性内 切酶分为三种类型）
解决方法 1. 用 5-10 倍量过量消化 2. 用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶 3. 同上 4. 同上
5. 反应前离心数秒
6. 将内切酶稀释，增大取样体积 7. 电泳前将样品置 65 ℃保温 5-10 分钟，取出 后置冰浴骤冷 8. 使用标准反应缓冲液及温度 9. 适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏 10. 使用最佳反应体系
限制性酶切与连接
成都医学院-生化与分子生物实验
1. 限制性内切酶的类型
根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活 性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
第一类（I型）限制性内切酶能识别专一核苷酸顺序，在识别 位点很远的地方任意切割DNA链，切割核苷酸顺序没有专一 性，随机。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中 用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如 EcoB、EcoK等。
它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行 切割，产生特异的ＤＮＡ片段；
Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识 别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序；
Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端 突出、３’端突出和平末端。
限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能在体外有目 的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推动了分子生 物学的兴旺和发展。
第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别 顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核 苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产 生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应 用于基因克隆。
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1. 限制性内切酶的类型
第二类（Ⅱ型）限制性内切酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内 切酶.
随着生物技术的发展和科学研究的深入，不断出现具有不 同功能的新载体，如可以容纳几百万碱基的酵母人工染色体
如何构建所需要的载体？
酶切 连接等技术
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DNA的限制性酶切实验原理
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常用的电泳缓冲液
常用的6X载样缓冲液 Ⅰ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液 Ⅱ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液
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4℃ 保存备用.
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三 材料、设备及试剂
质粒 ：pUC118、pEGFP 设备 ：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式
４．酶解温度与时间：
大多数限制酶反应温度为３７℃，如EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有如BclⅠ需在５０℃下进行反应， 反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来定，原则 是酶：ＤＮＡ=２－３：１ ２小时即可，充分酶解。
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溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下 发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物， 其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估 计样品DNA浓度。
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琼脂糖电泳的优点
（1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由 电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。
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二、琼脂糖凝胶电泳实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具 有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓 度。
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场 作用下向正极泳动。
限制性内切酶酶切位点汇总
限制性内切酶酶切位点汇总限制性内切酶（Restriction Endonuclease）是一类存在于细菌体内的酶，它能够识别特定的酶切位点，并在该位点上切割DNA链。
限制性内切酶起源于细菌，原本作为细菌对抗噬菌体感染的防御机制，但现在被广泛应用于分子生物学和基因工程领域。
限制性内切酶的分类和命名依据它们发现的第一个类型的噬菌体。
如EcoRI是从大肠杆菌中分离出的内切酶，与T4噬菌体相关；HindIII是与T4噬菌体有关的内切酶等。
酶名中的缩写首字母通常是酶切位点的首字母，比如EcoRI是指E.coli的RY粘性末端的切点。
现在限制性内切酶已被发现有超过3000多个类型。
下面是一些常见的限制性内切酶的切割位点汇总：1. EcoRI：切割位点为G↓AATTC（↓表示切割位点），产生的切割后的两个DNA片段是G-AATTC和CTTAA-G。
2. HindIII：切割位点为A↓AGCTT，产生的切割后的两个DNA片段是A-AGCTT和TTCGA-A。
3. SmaI：切割位点为CCC↓GGG，产生的切割后的两个DNA片段是CCC-GGG和GGG-CCC。
4. BamHI：切割位点为G↓GATCC，产生的切割后的两个DNA片段是G-GATCC和CCTAG-G。
5. XhoI：切割位点为C↓TCGAG，产生的切割后的两个DNA片段是C-TCGAG和GAGCT-C。
6. NotI：切割位点为GC×GGCCGC，产生的切割后的两个DNA片段是GC-GGCCGC和CGC-GC。
7. EcoRV：切割位点为GAT↓ATC，产生的切割后的两个DNA片段是GAT-ATC和TAC-TAG。
8. KpnI：切割位点为GGTAC↓C，产生的切割后的两个DNA片段是GGTAC-C和CCATG-G。
9. SalI：切割位点为G↓TCGAC，产生的切割后的两个DNA片段是G-TCGAC和CAGCT-G。
10. PstI：切割位点为CTGCA↓G，产生的切割后的两个DNA片段是CTGC-AG和GACG-T。
第3章 核酸分子的酶切、连接和修饰
6）Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价阳离子存在。
7)不同的限制酶出现的星号活力的阈值也不一样，常易发 生星号活力的酶有：EcoR I、Hind III、Kpn I、Pst I、Sca I、 Sal I、Hinf I等。
酶 Apa I Bcl I Mae II Taq I 最适温度oC 30 50 50 65 酶 Apy I BstE II Mae III 最适温度oC 30 60 55 酶 Ban I Mae I Sma I 最适温度oC 50 45 25
影响限制性核酸内切酶反应的因素 （六）限制性核酸内切酶的反应缓冲液 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH 值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特 异性，即所谓的“星活性” （star activity）现象。 EcoRI*代表EcoRI的星号活力。 星活性的特点: 限制酶识别序列特异性降低 例如：EcoRI（高pH值或低盐离子强度）
影响限制性核酸内切酶反应的因素
（五）酶切反应的温度与时间
多数标准反应温度是37℃，如SmaI为25℃或30℃， SfiI为50℃ 。
反应温度过度或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失
活。 酶解时间可通过加大酶量而缩短，反之酶量较少时， 可通过延长酶解时间以达到完全酶解DNA的目的。
影响限制性核酸内切酶活性的因素 不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC， 少数要求40-65 oC。
抑制星号活性的方法
1)尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样 可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。 2)尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的 乙醇）的污染。
酶切、连接与转化
Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都是有特异性， 但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定条件 下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异 性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改 变后的活性通常称的二活性，而将这种因条件的改 变会出现第二活性的酶右上角角一个星号表示，因 此第二活性又称星号活性。概括起来，诱导星号的 因素有以下几种： 1,高甘油含量(>5%,v/v);2,限制性内切酶用量过 高(100u/ug DNA)；3,低离子强度 (<25mmol/L);4,高ph(8.0以上)；5,含有机溶剂， 如DMSD,乙醇等，6,有非Mg2+的二价阳离子存 在(如Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+等）
限制性酶切 (修饰 DNA 末端) 连接载体与插入片段 转化 (将重组质粒导入宿主细胞) 分析重组子
谢谢
限制性内切酶的特点
1. 2. 3. 4. 高度特异性 商业化生产 反应需要Mg2+ 不同的内切酶可能产生相同的末端
4. 影响核酸限制性内切酶活性的因素
（1）DNA 纯度 （2）DNA甲基化的程度 （3）酶切消化反应温度 （4）DNA的分子结构 （5）限制性内切酶的缓冲液
5、限制性内切酶的星号活性
3’ 突出末端
p -GGG-3’ OH-CCC-5’
平末端
+
粘性末端: DNA片段经限制性内切酶切割后, 在切割 位点处所产生突出的5’-或3’-单链末端.
识别序列
识别 4-8 bp 的回文序列. 常用的酶识别 6 bp 发生的概 率为 46=4096 bp/每次. (44=256 bp; 48=65536 bp) 5’ GAATTC 3’ 如 EcoRI 识别序列: 3’ CTTAAG 5’
二、DNA限制性内切酶酶切及连接重组
▪ 3 设备：移液器，台式高速离心机，PCR 仪
三、实验步骤
1、在0.2mlEP管中配置下列的体系：
10×buffer
0.2ml EP管 2 μL
T4DNA连接酶 酶切后的P311片段
0.5μL 9.5 μL
酶切后的pUC18质粒
▪ 3 设备：移液器，台式高速离心机，凝胶 电泳系统，凝胶成像系统，恒温培养箱
三、实验步骤
1、分别去两支0.2mlEP管做上记号：如① ②
2、两个EP管中分别配置下列的体系：
①EP管
②EP管
ddH2O
6μL ddH2O
6μL
10×buffer 2 μL 10×buffer 2 μL
Eco RⅠ Bam HⅠ
5、影响酶切的因素（1）底物DNA的纯度和浓度； （2）反应体系：适宜的缓冲液和反应体积 （3）反应时间和温度
四、实验结果
酶切后的 pUC18质粒
DNA
3.2 DNA的连接重组
▪ 一、实验原理
图3-1 DNA连接酶连接作用的分子机理
图示 DNA连接酶连接作用的分子机理
一、实验原理
▪ 连接的DNA分子具备的条件：具有相同 粘性末端（同种酶切的片段）的DNA分子比 较容易连接在一起，因为相同的粘性末端容易 通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构。
实验三 DNA的限制性内切酶 酶切及连接重组
3.1 DNA限制性内切酶酶切
一、实验原理
生物体内能识别并切割特异的双链DNA 序列的一种内切核酸酶。由于这种切割作用 是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切 酶(简称限制酶)。
一、实验原理
【免费下载】限制酶的多种切割方法
限制酶的多种切割方法 一、错位切割含目的基因的DNA片段和运载体──形成黏性末端 1. 单酶切 （1）同一种限制酶分别切割含目的基因DNA片段与运载体。
这是最简单的一种方法，含目的基因的DNA片段与运载体在同种限制酶作用下形成相同的黏性末端，这两个黏性末端间能通过碱基间的配对而连接，进而形成重组DNA分子。
（2）用同裂酶去切割含目的基因DNA片段与运载体。
有一些来源不同的限制酶识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这类酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。
同裂酶产生同样的切割，形成相同的黏性末端。
2009年江苏生物高考第34题就出现了同裂酶（BamHⅠ与BstⅠ），其中的差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。
（3）用同尾酶切割含目的基因DNA片段与运载体。
有一些来源不同、识别的核苷酸顺序和切割位置各不相同，但能产生相同的黏性末端，这类酶被称为同尾酶。
常用的限制酶BamHⅠ、BglⅡ、BclⅠ和Sau3A就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC四个核苷酸组成的黏性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其黏性末端之间的碱基互补作用而彼此连接起来。
【例1】（2005年天津理综）：限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。
在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。
①请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。
②请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。
③在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？ 解析：这两种酶属于同尾酶，能产生相同的黏性末端，因此能够连接起来。
③由于两者产生的黏性末端相同（都是GATC），黏性末端之间能发生碱基互补配对而连接。
（4）单酶切的优点与缺点。
单酶切优点就是操作简单。
它的缺点主要有两个：①酶切后的质粒与目的基因在DNA连接酶作用下易自身环化：用单酶切切割后的目的基因和质粒的两侧各有一个黏性末端，而且是相同的末端，因此这两个末端会发生碱基互补配对而使目的基因和质粒分别发生首尾相连，都形成环状DNA分子，其中质粒又恢复成没有切割前的样子。
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目的基因
限制性内切酶
载体
限制性内切酶
重组体
T4 DNA ligase
载体自连
目的基因 自连
2.2 DNA片段之间的连接 具互补黏性末端之间的连接 具平末端之间的连接
具互补黏性末端片段之间的连接
5‘GGACTG-0H 3’CCTGACTTAA-P
E.coR I 切割
P-AATTCTGCAA-3’ 0H-GACGTT-5’ E.coR I切割
双酶切可以在不同的反应系统中进行。
A 需要较低盐浓度的酶先切割，然后升高盐浓 度，另一个酶切割；
B 最适反应温度较低的酶先切割，然后升高温 度，另一个酶切割；
C 第一个酶切割后，经凝胶电泳回收DNA， 再选用合适反应系统，进行第二个酶的切割。
D 双酶切在同一个反应系统中。
1 限制酶切的方式
1.3 部分酶切 指限制酶对其在DNA分子上的全部识别序
AGATCT TCTAGA
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+AATTC G
A TCTAG
T4 DNA ligase
GAATTC CTTAAG
AGATCT TCTAGA
重组体
具平末端DNA片段之间的连接
5‘CAAGCTCA3’ 3’GTTCGAGT5’
AluI
5’GTAGCTTA3’ 3’CATCGAAT5’
AluI
P-CTCA-3’ 5’CAAG-OH
P-CTTA3’ 5’GTAG-OH
OH-GAGT5’ 3’GTTC-P OH-GAAT-5’ 3’CATC-P
T4 DNA ligase 5’CA AGCT TA-3’
3’GT TCGA AT-5’
AluI AGCT
HindⅢ A的末端是用同一种 酶切割后产生的，连接后的DNA分子仍 保留那种酶的识别序列，有的会出现另一 种新的限制酶识别序列。
DNA ligase 5‘GGACTGAATTCTGCAA-3’ 3’CCTGACTTAAGACGTT-5’
E.coR I 识别序列
结论：
待连接的两个DNA片段的末端如果是 用同一个酶切割的，连接后仍保留原限制 酶的识别序列。
同
一 限
GGATCC CCTAGG
Bam HⅠ切割反应
制
酶
G CCTAG
GGATCC CCTAGG
目的基因自连
不同限制酶切位点的连接
Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点
G A A T T C
A G A T C T
C T T A A G
T C T A G A
AATTC G
EcoRⅠ+ Bg lⅡ
双酶切
A TCTAG
AATTC G
GATCT A
GAATTC CTTAAG
总体积：20µL
酶切步骤： ⑴加样； ⑵摇匀，短时离心； ⑶反应1—3h； ⑷反应终止。
65℃水浴10—15min
1限制酶切的方式
1.2 双酶切 用不同的限制酶切割同一DNA分子的方法。
环状DNA分子完全酶切的结果，产生DNA 片段数是两种限制酶识别序列数之和。
线性DNA分子完全酶切的结果，产生DNA 片段数是两种限制酶识别序列数加1.
3第三讲限制性酶切方式及连接
1限制酶切的方式
1.1 单酶切 若DNA样品是环状DNA分子，产生与识
别序列（n）相同的DNA片段数。 若DNA样品是L—DNA片段，完全酶切产
生n+1个DNA片段。
1限制酶切的方式
1.1 单酶切
酶切体系：
反应体系
13µL ddH2O 2µL 10×buffer 4µL 底物DNA 1µL 限制酶
列进行不完全的切割。
用途：当某种限制酶的多个识别序列之中 有一个识别序列恰好在回收待用的DNA片段 上，若完全酶切，将此DNA片段从中切断。 为了解决这个问题，就需要用到部分酶切， 以满足实验的需要。
2 限制酶切后的连接
2.1 DNA ligase:
能催化dsDNA片段紧靠在一起的3‘羟基 末端与5’磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键， 使两末端连接的一种核酸酶。
思考题： 1 限制酶切的方式 2 限制酶切后的连接
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GATCC G
切
位
目的基因用 Bam HⅠ切割
G
载体DNA用Bam HⅠ切割
GATCC
点
+ CCTAG
G
连
G CCTAG
GATCC G
接
T4 DNA ligase
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
载体自连
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
重组体
GGATCC CCTAGG