第五章 发育生物学研究技术2
(发育生物学)03-05第三-五章
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成熟的卵细胞在代谢上是极为钝化的，只有受精的 刺激才能唤醒代谢的活跃进行，这一活化过程分为：
阻碍多精入卵的机制：
1. 快封闭反应: 卵膜中存在离子通道，卵膜的快速阻碍
多精入卵作用是通过改变自身膜电位形成 的。精子进入卵细胞触发细胞膜静息电位 迅速去极化，引起膜外精子与卵细胞识别 和融合的障碍。
如人为维持原有的膜电位，可诱导多精 受精现象发生；如改变正常的初始膜电位， 则会阻止卵细胞的受精。
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海胆精子顶体突起与 卵子微绒毛的接触
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海胆精子顶体突起上Bindin的定位
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海胆卵子表面的Bindin受体 29
哺乳动物的精卵识别
哺乳动物精卵的特异性识别发生在卵细胞的透明 带（zona pellucida）部分。 小鼠 透明带中含有ZP3 糖蛋白 ，它与ZP1、ZP2 以网状的骨架结构存在于透明带中。 ZP3能结合精 子，并引发顶体反应。
小鼠透明带丝状串 珠样结构示意图
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金色仓鼠精子入卵过程 ：A，精卵融合的扫描电镜照片 B，精子与 透明带的结合 C，精子头部穿过透明带。
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D，精子与卵子质膜的融合 E，精子顶 体与带有微绒毛的卵子质膜融合的示 意图
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二. 受精的唯一性
当精卵细胞膜融合时，为确保受精的唯一 性，其它精子的进入通过两种机制来阻止。
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海胆受精膜的形成及多余精子的移除 57
哺乳动物不形成受精膜，但皮质颗粒中释放的酶 对透明带中的精子受体分子进行修饰，使之丧失 与精子结合的能力，因此，称为透明带反应。
(半乳糖基转移酶 (GalTase)—可与ZP3分子上的N-乙酰 葡糖胺结合 ，使精子G蛋白激活并诱导顶体反应。卵激活 时皮质颗粒释放出来的N-乙酰葡糖酶能对ZP3上的 GalTase结合位点进行修饰，由此阻断透明带外围的精子 与受精卵结合。）
生命科学中的发育生物学研究
生命科学中的发育生物学研究发育生物学是生物学领域中一个重要的研究方向，主要关注生物体从受精卵到成熟个体的整个发育过程。
它涉及到细胞分化、组织发育、器官形成等一系列关键过程，对于理解生命的起源、多样性以及疾病的发生机制都具有重要意义。
本文将对生命科学中的发育生物学研究进行介绍。
一、发育生物学的基本概念发育生物学研究的对象是生物体在不同发育阶段的形态、结构和功能的变化。
它涉及到细胞分裂、细胞分化、组织器官发育、个体生长等一系列复杂的过程。
发育生物学在解释生物形态多样性、探索生物进化、揭示基因功能以及研究疾病发生机制等方面具有重要意义。
二、发育生物学的研究方法发育生物学采用了多种研究方法，包括原位杂交、基因敲除、基因编辑等。
原位杂交是通过检测特定基因在生物体中的表达区域，了解其在发育过程中的作用和定位。
基因敲除则是通过人为干预，使特定基因在生物体中失去功能，从而观察其对发育的影响。
而基因编辑则是利用CRISPR/Cas9等技术，精确修改生物体的基因序列，以研究基因对发育的调控机制。
三、发育生物学的重要研究领域1. 胚胎发育：胚胎是生物体发育的关键阶段，其形成与发展过程复杂而精细。
胚胎发育研究可以揭示胚芽分化、器官形成和组织建立的机制，为疾病治疗和组织工程提供理论基础。
2. 干细胞生物学：干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，被认为是再生医学和组织工程的理想来源。
发育生物学通过研究干细胞的起源、发育和分化机制，为干细胞在治疗疾病和再生组织方面的应用提供支持。
3. 器官形成：在发育过程中，各类器官的形成是由特定信号通路和基因调控网络控制的。
通过研究器官形成的分子机制，可以深入理解生物体各个器官的发育和功能。
4. 分子调控机制：发育生物学关注基因调控网络、信号转导通路以及非编码RNA在发育中的作用。
研究这些分子调控机制有助于揭示生物发育的分子基础，以及相关疾病的发生机制。
五、发育生物学的应用前景发育生物学的研究成果对于医药和农业领域具有广泛应用前景。
发育生物学——发育生物学研究技术
细胞培养的方法和步骤
细胞适应： 将细胞从 原来的培 养条件逐 渐过渡到 新的培养 条件
细胞接种： 将细胞按 照一定的 密度和方 式接种到 培养皿或 培养瓶中
细胞培养： 在适宜的 温度、湿 度、气体 等条件下 进行细胞 培养
细胞传代： 当细胞密度 达到一定程 度时，需要 进行细胞传 代，以维持 细胞的生长 和繁殖
细胞冷冻： 将细胞保 存在低温 条件下， 以延长细 胞的生存 时间
细胞复苏： 将冷冻保 存的细胞 唤醒，恢 复其生长 和繁殖能 力
细胞培养的优缺点和应用范围
● 优点：体外培养可模拟体内环境，研究细胞生长、发育和分化规律；可对细胞进行无菌操作，保证细胞生存 环境；可对细胞进行传代培养，实现细胞系的建立和保存。
总结与展望
研究技术的总结与评价
各种研究技术的优缺点比较 不同技术在不同研究领域的应用比较 未来研究技术的发展方向预测 针对不同研究目的选择合适的技术手段
研究技术的未来发展趋势和应用前景
基因编辑技术：CRISPR-Cas9等 基因编辑技术将为发育生物学研究 提供更精确、更高效的工具。
生物信息学：利用大数据和人工智能 技术，对发育生物学数据进行挖掘和 分析，揭示基因表达调控和细胞分化 等过程的规律和机制。
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发育生物学
目录•绪论•细胞分化与胚胎发育•组织器官的发生与再生•生殖细胞的发生与成熟•发育异常的遗传与进化•发育生物学的研究方法与技术绪论发育生物学的定义与研究对象定义发育生物学是研究生物从受精卵到成熟个体的发育过程中，基因表达调控、细胞增殖与分化、组织器官形成与功能等方面的科学。
研究对象包括胚胎发育、生殖细胞发生、生长、衰老等生物发育过程中的各种现象和问题。
发育生物学的研究历史与现状研究历史从19世纪末到20世纪初，发育生物学开始形成，经历了描述性胚胎学、实验胚胎学、分子胚胎学等发展阶段。
研究现状近年来，随着基因组学、转录组学、蛋白质组学等高通量技术的发展，发育生物学研究进入了系统生物学时代，揭示了许多发育过程中的分子机制和调控网络。
揭示生命本质发育生物学研究有助于揭示生命的本质和发育规律，增进对生命现象的认识和理解。
指导医学实践发育生物学研究对于预防和治疗先天性缺陷、不孕不育、肿瘤等疾病具有重要的指导意义。
推动生物工程发展发育生物学研究为生物工程提供了理论和技术支持，促进了组织工程、再生医学等领域的发展。
探索生物进化机制发育生物学研究有助于探索生物进化的机制和规律，为生物进化理论提供实验依据。
发育生物学的研究意义与价值细胞分化与胚胎发育细胞分化的分子机制01基因表达的调控通过转录因子和表观遗传修饰等方式，调控基因的表达，从而实现细胞类型的特异性。
02信号转导通路的作用细胞外信号通过膜受体和细胞内信号转导通路，影响细胞的分化和命运决定。
03细胞间相互作用通过细胞间通讯和细胞黏附等方式，细胞之间相互影响，协同完成分化过程。
胚胎发育的过程与调控卵裂与囊胚形成01受精卵经过多次卵裂形成囊胚，建立胚胎的基本结构。
原肠胚形成与器官发生02囊胚进一步发育形成原肠胚，各种器官原基逐渐出现并发育成熟。
胚胎生长与分化03随着胚胎的发育，细胞不断增殖和分化，形成各种组织和器官。
胚胎干细胞的研究与应用胚胎干细胞的来源与特性01胚胎干细胞具有自我更新和多向分化潜能，可来源于早期胚胎或原始生殖细胞。
生物学中的发育生物学研究
生物学中的发育生物学研究发育生物学是研究生物体从受精开始到形成成熟个体的一系列发育过程的科学。
它是生物学中一个重要的分支领域，涉及到从单细胞到多细胞，从胚胎到成体的发展和生长过程。
发育生物学研究的内容广泛，涵盖了细胞分化、组织发生、器官生成等多个层面。
一、胚胎发育过程胚胎发育是发育生物学研究的核心内容之一。
从受精卵开始，胚胎通过一系列细胞分裂和细胞分化过程，逐渐形成不同组织和器官。
这个过程中涉及到基因调控、信号通路等多种机制。
例如，在哺乳动物中，胚胎的发育过程可以分为受精、分裂、多细胞期、胚胎芽期和胚胎期等不同阶段。
每个阶段都有不同的发育特点和生物学事件。
二、细胞分化与组织发生细胞分化是指胚胎中的细胞从一种状态转变为另一种状态，即从未分化的状态分化成特定类型的细胞。
这个过程是发育生物学研究中非常重要的一个方面。
细胞分化的过程中存在许多关键的调控因子和信号通路，比如转录因子和细胞外信号分子。
组织发生是细胞分化的结果，是由不同类型细胞组合而成的功能性结构，如心脏、肝脏、肺等。
组织发生的过程涉及到细胞迁移、细胞互作以及基质环境等多种因素。
三、器官发生与再生器官发生是指不同类型组织和细胞相互协调合作，形成复杂的器官结构的过程。
在发育生物学研究中，器官发生是一个非常重要的议题。
通过研究器官发生的机制，可以深入了解细胞分化和组织发生的过程。
另外，再生是一种特殊的器官发生过程，指受损的组织和器官通过细胞增殖和分化等方面的机制，重新形成完整结构。
例如，蜥蜴的尾巴可以再生，此过程中细胞分化重组有着重要的作用。
四、遗传与发育遗传是发育生物学研究中一个关键的概念。
在细胞分裂和细胞分化的过程中，遗传物质的传递起着重要的作用。
遗传信息通过基因和表观遗传学的方式传递给下一代。
同时，遗传物质的异常也可能导致发育过程的异常。
例如，染色体畸变、突变和遗传病等都会对胚胎发育产生影响。
总结生物学中的发育生物学研究探索了生物个体从受精开始到形成成熟的一系列发育过程。
发育生物学的研究方法与应用
发育生物学的研究方法与应用发育生物学是研究动植物个体的发育过程及其机制的一门学科。
发育生物学涉及分子生物学、细胞生物学、生物化学、遗传学等多个学科，是近年来发展非常迅速的生物学分支。
本文将介绍发育生物学的研究方法及其应用。
1. 分子生物学技术在发育生物学中的应用在发育生物学研究中，不同生物种类的发育机制、细胞分化、器官发生等问题都需要用到基因工程技术。
基因工程技术是一种强有力的研究发育生物学的手段。
例如，我们常常利用反转录酶聚合酶链式反应（RT-PCR）来检测发育过程中各个时期基因表达的情况。
通过将RNA转化成DNA反转录，再用PCR扩增相应的DNA片段，可以检测基因的转录水平。
基因敲除和基因过度表达也是发育生物学研究中重要的手段。
敲除和过度表达可以检测基因在发育过程中的功能和作用机制。
在基因敲除中，我们通过诱导RNA干扰或基因突变等方式消除某个基因的表达来观察其缺失对发育的影响。
在基因过度表达中，我们通过将目标基因过度表达来观察其对发育的作用。
这些技术可以用于探究基因在调控发育过程中的作用机制。
2. 细胞生物学技术在发育生物学中的应用在发育生物学中，细胞生物学技术也发挥着重要的作用。
例如，免疫组化技术可以对细胞组织进行蛋白质特异性染色，观察不同期间的特定蛋白质的表达情况和分布。
荧光显微镜技术可以清晰地显示细胞内特定器官或者分子的位置和状态。
此外，光学追踪技术可以跟踪细胞的迁移和分裂，帮助研究细胞的增殖和分化过程。
近年来，单细胞技术的发展也为研究发育生物学提供了很多新的手段。
单细胞转录组学技术可以在单个细胞水平上大规模分析RNA水平的变化，并探究各个时期细胞分化的基因表达方案。
同时，分离出的单细胞还可以进行细胞增殖和分化的研究，极大地促进了发育生物学理论的深入探讨。
3. 生物化学技术在发育生物学中的应用在发育生物学中，生物化学技术也是非常重要的手段。
发育生物学通过探究分子水平的变化来分析发育过程中的机制和分子调控途径。
发育生物学课件PPT课件
随着基因组学、蛋白质组学和生物信息学等技术的发展，发育生物学的研究更加深入和全面。
02
发育生物学基础知识
细胞分化
细胞分化是发育生物学中的基本过程，指同一来源的细胞逐渐产生形态、结构和功能上的差异。细胞分化是胚胎发育和器官形成的基础。
实验数据是研究的基础，数据分析的目的是从数据中提取有意义的信息，包括描述性统计、推论性统计和可视化分析等。
实验设计与数据分析
数据分析
实验设计
分子生物学技术
基因表达分析
利用分子生物学技术检测基因在不同发育阶段的表达情况，包括基因转录和蛋白质翻译水平。
蛋白质组学技术
通过蛋白质组学技术分析发育过程中蛋白质的表达、修饰和功能，揭示蛋白质与发育过程的关系。
内分泌调节
营养与环境因素
遗传因素
生长与成熟的调节
母体的营养状况、环境因素等也会影响胎儿的生长和发育。
基因等遗传因素对胎儿的生长和发育也有重要影响。
激素等内分泌因素对胎儿的生长和发育起着重要的调节作用。
04
发育异常与疾病
遗传性疾病的发育起源
总结词：遗传性疾病的发育起源是指某些遗传性疾病在胚胎发育过程中出现异常，导致器官或系统的功能缺陷。
生物信息学方法
06
未来展望与研究方向
CRISPR-Cas9等基因编辑技术为治疗遗传性疾病和癌症等疾病提供了新的可能，未来有望通过编辑人类基因来治疗各种疾病。
基因编辑技术
利用基因编辑技术，可以纠正导致疾病的基因突变，或者增强人体对疾病的抵抗力，提高治疗效果和生存率。
疾病治疗
基因编辑与人类疾病治疗
VS
利用遗传工程技术对特定基因进行敲除或敲入，研究其在发育过程中的作用。
发育生物学(生物科学)(二)2024
发育生物学(生物科学)（二）引言概述:发育生物学是研究生命起源、发展、生命周期和形态发生规律的学科。
本文是《发育生物学(生物科学)》系列的第二部分，将着重介绍发育过程中的分化、细胞信号传导、器官发育、模式形成和遗传背景等五个方面的内容。
正文:I. 分化1. 细胞分化：从多能性到单能性2. 分化调控：基因表达与细胞命运的关系3. 分化过程中的细胞特化：器官起源和细胞身份的决定4. 细胞分裂与分化的关系5. 发育过程中的细胞可塑性和转分化II. 细胞信号传导1. 细胞信号传导的基本过程：激活、信号转导和反应2. 信号分子及其相互作用：内源性和外源性信号调控3. 信号通路与细胞命运决定的关系4. 细胞信号传导在胚胎发育中的作用5. 异常信号传导对发育过程的影响III. 器官发育1. 器官起源和分化的相关机制2. 器官形态建立的分子机制3. 器官发育的区域特异性和模式形成4. 细胞极性对器官发育的影响5. 细胞命运和微环境对器官发育的调控IV. 模式形成1. 发育模式形成的基本原理2. 遗传和环境对模式形成的影响3. 模式形成的不同机制：分子梯度、相邻细胞相互作用等4. 模式形成对组织形态的影响5. 模式形成的应用：组织工程和再生医学V. 遗传背景1. 遗传变异对发育过程的影响2. 遗传背景与发育的关系：表型与基因型的相互作用3. 遗传突变对发育生物学研究的意义4. 遗传背景与个体发育和进化的关系5. 遗传背景对发育相关疾病的影响和研究进展总结:本文通过分化、细胞信号传导、器官发育、模式形成和遗传背景五个大点，全面探讨了发育生物学的相关内容。
了解发育生物学对于理解生命起源和发展规律的重要性，对于进一步的生物科学研究和应用具有重要意义。
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启动子活性检测法 表达载体的构建：Promoter/enhancers
GFP pA
显微注射及细胞标记技术 目的：将外源DNA、RNA或标记物等导入早期
胚胎细胞中，如运用细胞标记技术对胚胎早期卵 裂球分化命运图谱的研究。在小鼠和果蝇中常用 于转基因分析。
细胞标记物分类：
早期：活体染料如尼罗蓝或中性红，不能标记胚胎内部组织 现在：细胞外-亲脂性荧光染料如DiI/Dio，不适于组织切片
• 原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼
脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同 的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA） 及其含量。
•
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操作过程
mRNA提取
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分子生物学技术
目的：检测目的基因或蛋白质在某一发育 时期或特定组织中的表达 分类：
• Polymerase chain reaction (PCR): DNA amplification • Real-time quantitative PCR: RNA 定量
细胞内-荧光标记葡聚糖和HRP，需显微注射，通过荧光 显微镜或组织化学方法进行定位。
示踪基因：GFP和LacZ基因
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染料细胞标记
大规模诱变筛选
突变后的表型改变：
• 致死性
• 功能丧失：最常见。突变后的蛋白质比野生 型活性差；某一蛋白质完全失活的突变为无效 突变 (null mutation) • 功能获得：如某些受体突变后活化
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突变基因的克隆
从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因
化学诱变法
斑马鱼上ENU化学突变研究的成就(1996)
德国 Tubingen 美国 Harvard 初选突变体总数 保存的突变体总数 已确认的不同基因数 4264 1163 372 2383 695 220
大规模诱变筛选
通过射线或化学 诱变剂处理父本 个体，在其生殖 系细胞中产生随 机突变，然后与 wild-type母本个 体杂交，F1个体 中可能携带有基 因突变。F1与野 生型，F2 (50% 杂合突变体)群体 内杂交，F3 (25%)可出现纯 合突变个体，发 育异常
显微镜技术
目的：观察胚胎个体
分类：
•
光学(optical)显微镜:
•
•
体视显微镜: 组织分离用
荧光显微镜：
显微镜技术
激光共聚焦显微镜 (laser confocal)：荧光标记，对 胚胎或细胞中的特定蛋白质或mRNA的分布进行定性 或定量研究；图像采集的效果很好；细胞或组织的三 维重塑 (reconstructing)
或功能获得 (gain of function) 实验，研究胚胎个
体所产生的表型而分析目的基因的功能。
基因修饰
1. 基因敲除;
2. 条件基因敲除;
3. 转基因;
Constructing knockout mice
获得携带有特定基因 突变个体的技术，研 究基因在发育中功能 的重要方法。 1) 构建用于基因重 组的突变基因结构 2) 重组基因导入胚 胎干细胞 (ES) 3) 注射ES入胚胎中 以获得杂合性小鼠 4) 小鼠杂交获得纯 合体小鼠并进行表型 分析。
突变体获得后，克隆引起该突变的基因
• 插入定其插入点及被阻断
的基因。 • 化学诱变或射线突变：定位克隆 (positional cloning)—根据目的基因在染色体上的位置进行基因分 离的。通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来 确定突变基因的染色体位置。常用的分子标记包括单核 苷酸多态性 (SNPs)。
组织切片技术
目的：观察胚胎的内部组织学结构
分类：
• 石蜡组织切片：石蜡包埋，切片机切片 • 冷冻切片：低温包埋剂包埋，低温切片机切片，对样 品中核酸的保存较好，但切片的质量差。 •振动切片技术：切新鲜的或经过固定的动、植物标本 。但震动切片一般较厚，不太适用于精细结构的观察。
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物易于检测的基因(报道基因)与待研究的表达调控序列 串联，通过转基因技术导入胚胎体内，分析报道基因产 物的表达来研究目的片断的转录调节活性。
常用报道基因分类：
• 绿色荧光蛋白 (GFP): 分布可用荧光显微镜观察 • lacZ基因: 编码 β-半乳糖苷酶, 用特异底物显色研究其产物分布 • 荧光素酶 (luciferase): 常用体外基因表达活性分析，近年开始 体内研究
Dectection: autoradiography, fluorescence microscope, enzyme-substrate reaction
原位探测基因表达
原位探测基因表达
Distribution of mRNA for the growth factor Vg-1 in the amphibian(两栖动物） egg. In situ hybridization with a radioactive probe. (yellow signals)
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Southern Blot 操作步骤：
DNA 琼脂糖电泳 印迹转移
洗膜
预杂交
杂交（变性探针）
放射自显影或显色
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（二）Northern Blot
• RT-PCR/Northern blotting: mRNA expression
• Western blotting: protein expression • 免疫共沉淀 (Co-IP): protein-protein interaction
Southern Blotting Analysis
DNA插入诱变法
GFP：绿色荧光蛋白
由含 GFP 基因的反转录病毒插入引起突变
正常胚胎 突变胚胎
X 基因
GFP 基因
完整的 X 基因使胚胎正常发育
X 基因被 GFP 基因破坏后胚胎异常发育
DNA插入诱变法
反转录病毒插入引起的突变的鉴定
病毒注射 F0 WT
F1
F2
插入诱变筛选
利用转座子(transposon)或病 毒载体做诱变剂。果蝇中为P-因 子，可以随即插入基因组中，并 可以在基因组中移动，包括特殊 序列和转座酶，后代生殖细胞中 ，转座酶就会诱导P-因子在基因 中随即转座造成基因突变。
荧光细胞标记
细胞移植
DNA/蛋白芯片
目的：高通量筛选不同胚胎细胞或组织中基因/
蛋白表达图谱，获得不同时期或组织差异表达的 基因或蛋白。
分类：
• DNA chip
• Protein chip
• microRNA chip
•mRNA chip
•甲基化芯片
应用DNA microarrays 研究基因表达
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一 核酸杂交技术
• （一）Southern Blot • 原理：
将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖 凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移 到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记 物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针 互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针 洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检 的片段及其相对大小。 用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有 点突变、扩增重排等。
Developmental Biology - Spring 学技术
发育生物学基本任务之一：
研究基因在胚胎发育中的作用
• 正向遗传学技术：大规模随机诱变，产生发育 异常的突变个体，然后再寻找突变的基因。 1. 大规模诱变筛选; 2. 插入诱变筛选;
3. 突变基因的克隆;
子利用等；
X－射线或 r－射线照射
自发突变 (spontaneous mutation)
Recessive mutation (纯合体状态) /Dominant (杂合体状态) /semidominant(半显性状态）
自发突变 (spontaneouse mutation)
semi-dominant mutation (半显性突变)
When and where particular genes are active Intact embryos or sections of embryos
In situ hybrid: probesradioactive isotope, fluorescence tag or an enzyme
甲醛变性电泳 洗膜
印迹转移
预杂交
杂交（变性探针）
放射自显影或化学发光
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Developmental Biology - Spring 2007
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报道基因 (reporter gene) 技术