第三节 核酸的理化性质

•增色效应
（hyperchromic effect）
•减色效应 （hypochromic effect）
Fig. 4-34 The absorption spectra of DNA. 1. Native DNA 2. Denatured DNA 3. Free neuclotides
五、核酸的变性、复性与杂交
b: DNase Ⅱ，产物为3´- 核苷酸或以其为尾的寡核苷酸
三、核酸的酸碱性质
• 核苷酸含有磷酸基团和碱基，是两性电解质。 在pI处，核苷酸以兼性离子存在。 • DNA和RNA分子也是两性电解质。 多核苷酸中，磷酸基pK1´=1.5，因其酸性较强， 所以核酸表现为酸性。
四、核酸的紫外吸收
嘌呤碱、嘧啶碱存在共轭双键，所以碱基、
•复性的速度与变性DNA的浓度、片段大小及顺序的 复杂性有关。 DNA的浓度越大，片段越小，复性越快。 基因组越小、顺序越简单, 复性越快。 •复性的速度可用C0t1/2 表示。 Cot1/2 : 复性一半时的C0t值。 Co: 变性DNA复性时的初始浓度(mol/L) t: 时间（秒）
Fig. 4-39 These Cot curves show the rates of reassociation of denatured DNA from various sources.
根据作用方式：
核酸内切酶 核酸外切酶
核糖核酸酶 如：牛胰核糖核酸酶（ RNaseⅠ） 根据底物： 核糖核酸酶T1
脱氧核糖核酸酶 如：牛胰脱氧核糖核酸酶（DNaseⅠ） 牛脾脱氧核糖核酸酶（DNase Ⅱ） 限制性核酸内切酶
Fig. 4-31 An example of nuclease specificity: The specificity of RNA hydrolysis by bovine pancreatic Rnase （RNaseⅠ）. RNaseⅠ：产物为3´- 嘧啶核苷酸或以其为尾的寡核苷酸
第三节 核酸的理化性质
一、核酸的一般性质
1. 状态：
• 核苷酸为无色晶体或粉末, • DNA为白色纤维状固体， • RNA为白色粉末。
2. 分子大小：
• 核苷酸分子量： 1bp 618D. • DNA和RNA皆是高分子量物质。
3. 粘度：
• DNA分子粘度要比RNA大得多。
粘度大小：线性分子 > 不规则线团 > 球形分子
• 变性DNA粘度下降。
4. 溶解性：
• DNA、RNA微溶于水，不溶于一般有机溶剂。 • 核酸钠盐比游离酸易溶于水。
5. 特殊颜色反应
（1）地衣酚法定性、定量鉴定RNA: D-核糖 + 浓盐酸 + 地衣酚
FeCl3 100º C, 20-30´
绿色物质
（670nm比色）
（2）二苯胺法定性、定量鉴定DNA:
（一）变性（denaturation）
定义： 高温、酸、碱及某些变性剂（如尿素等）能
破坏核酸中的氢键，使有规律的双螺旋结构变成
单链的、无规律的线团，此作用称DNA的变性。 •变性不涉及共价键的断裂。
•变性后， 核酸紫外吸收值增加，粘度、比旋下
降，生物活性部分或全部丧失。
Fig. 4-35 Stages in the reversible denaturation and renaturation of DNA.
带有DNA片段的凝胶
碱液浸泡
凝胶上DNA变性
Fig. 4-41 Illustration of Southern blotting.
Fig. 4-42 Illustration of Northern blotting.
（二）复性（renaturation）
• 定义：
在一定条件下，变性DNA两条彼此分开的单链重 新缔合成双螺旋结构，这个过程称为复性。
•退火（annealing）
热变性DNA在缓慢冷却时，可以复性，此过程 称为退火。
Fig. 4-38 Steps in the thermal denaturation and renaturation of DNA.
Fig. 4-32 Nuclease specificity: Cleavage in polynucleotide chains: a cleavage yields 5’-phosphate products, whereas b cleavage gives 3’-phosphate products. a: DNaseⅠ，产物为5´- 核苷酸或以其为尾的寡核苷酸
DNA RNA
DNA RNA
Southern 印迹法（Southern blotting）
DNA 限制性内切酶 限制片段 变性的单链DNA转移 并牢固 结合在硝酸纤维素薄膜上 放射性标记探针杂交 DNA-DNA(或RNA)杂 交分子 放射自显影 显示出杂交分子的位置 中和, 转移, 烘烤
琼脂糖凝胶电泳
核苷、核苷酸、核酸在240-290nm处有强烈的 紫外吸收，最大吸收峰在260nm处。
Fig. 4-33 The absorption spectra of the common nucleotides and their molar absorption coefficients at 260 nm and pH 7.0.
牛脾磷酸 二酯酶
Fig. 4-30 Snake venom phosphodiesterase and spleen phosphodiesterase are exonucleases that degrade polynucleotides from opposite ends.
• 核酸酶（nuclease）（特异性地水解核酸）
D-2-脱氧核糖 + 酸 + 二苯胺 冰醋酸，少量浓硫酸
加热
蓝色物质
（595nm比色）
（3）核酸的溴化乙锭（EB）染色
EB是一种荧光染料，可插入核酸相邻碱基对之 间。在紫外灯下，结合EB的核酸呈橙红色荧光。 灵敏度为10ng。
GoldView (GV)是 溴化乙锭（EB）的新型替代品， 灵敏度与EB 相当，但无致癌作用。
Fig. 4-29 Hydrolysis of RNA under alkaline conditions.
3. 酶水解：
• 磷酸二酯酶 (phosphodiesterase)
（非特异性水解磷酸二酯键）
蛇毒磷酸二酯酶：产物为5- 核苷酸 牛脾磷酸二酯酶： 产物为3- 核苷酸
蛇毒磷酸 二酯酶
（三）杂交（hybridization）
定义： 相同或不同来源的两条单链DNA分子， 或单链DNA与RNA分子，如果在某些区域
具互补序列，则复性时根据碱基互补原则，
可形成DNA-DNA或DNA-RNA杂交分子。
Fig. 4 -40 Principle of hybridization test.

熔点（熔解温度，Tm）：
DNA双螺旋结构失去一半时的温度。一般在8295℃之间。
Tm与以下因素有关：
DNA的均一性 均质DNA 例：poly(A-T)
异质DNA
(G+C)% = (Tm- 69.3) 2.44
G-C含量
介质的离子强度
离子强度越大，Tm越大。
Fig. 4-38 Relationship between Tm and %G+C.
核酸杂交可在液相或固相进行。 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相 载体上，而后利用相应的探测反应来检测 样品的一种方法。
分子杂交（印迹法）的类型
Southern 待测 样品 探针 DNA Northern RNA Western （免疫印迹） Eastern
蛋白质 蛋白质 （单向电泳分离） （双向电泳 或IEF分离） 抗体 抗体
Fig. 4-36 Eletron micrograph of partially denatured DNA.
1. 热变性
DNA的稀盐溶液加 热到80-100º C，即可发 生热变性。变性在一个 较窄的温度范围内“爆 发式”发生。
Fig. 4-37 The denaturation or melting curve of two DNA specimens.
应用：
（1）定性定量鉴定各种核苷酸 （2）核酸纯度鉴定
纯DNA: A260 / A280 > 1.8 纯RNA: A260 / A280 = 2.0
（3）核酸定量鉴定
A260 =1, 相当于 50g / ml 双螺旋DNA 40g / ml 单链DNA（RNA） 20g / ml 寡核苷酸
（4）核酸变性程度的鉴定
6. 旋光性:
核酸分子是高度不对称的，具旋光性。
DNA的比旋值 []D = + 150°（右旋） 核酸变性，比旋值下降。
二、核酸的水解
1. 酸水解:
糖苷键和磷酸酯键皆可以被水解。 稀盐酸可 水解嘌呤糖苷键; 水解嘧啶糖苷键需要高温和强 酸条件（甲酸等）。
2. 碱水解
RNA可被碱水解为核苷酸。DNA不具2′-OH, 不 能形成碱水解的中间物，所以DNA抗碱。