生物分离工程实验
生物分离工程实验
实验一絮凝技术预处理发酵液及其滤饼的质量比阻测定（见教材）实验三PEG/（NH4）2SO4 两水相系统的相图（见教材）实验二利用盐析和等电点沉淀法从牛奶中制备酪蛋白1 实验目的掌握盐析和等电点沉淀法的原理和基本操作。
2 实验原理乳蛋白广泛存在于乳制品中，牛奶中主要含有酪蛋白，酪蛋白在pH 4.8是沉淀，乳蛋白素则在pH=3左右才会沉淀。
利用这一性质可以先将降至4.8，或者是在加热至40℃的牛奶中加人硫酸钠，将酪蛋白沉淀出来。
酪蛋白不溶于乙醇，利用乙醇可以除去杂质。
将除掉酪蛋白的溶液pH调至3左右，使乳蛋白素沉淀析出。
可以得到乳蛋白素。
3实验器材烧杯；玻璃试管；离心管；磁力搅拌器；pH计；离心机等。
4试剂和材料⑴试剂与材料脱脂牛乳；无水硫酸钠；HCL；氢氧化钠；滤纸；pH试纸；浓盐酸；乙醇；0.2mol/L pH 4.8醋酸-醋酸钠缓冲液。
⑵缓冲溶液的配制0.2mol/L pH 4.8醋酸-醋酸钠缓冲液（先配A液与B液）：A液：0.2mol/L醋酸钠溶液称NaAC·3H2O 54.44g，定容至2000mL。
B液：0.2mol/L醋酸溶液，取醋酸（含量大于99.8%）12 mL定容至1000mL。
取A液1770mL，B液1230mL混合即得pH4.8的醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL。
5操作步骤1）盐析法制备酪蛋白①将50mL牛乳倒至烧杯中，40℃搅拌；②方法一：在烧杯中缓缓加入10g无水硫酸钠，之后再继续搅拌10min；方法二：在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH 4.8的醋酸缓冲液100mL.用精密pH试纸或酸度计调pH至4.8。
③用细布过滤分别收集沉淀和滤液。
将沉淀放于30mL乙醇中倾倒于布氏漏斗中过滤除去乙醇溶液，抽干。
将沉淀从布氏漏斗中移出，在表面皿中展开除去乙醇，干燥后得到酪蛋白。
准确称量。
2）等电点沉淀法制备乳蛋白素将操作1）所得到的滤液置于烧杯中，一边搅拌，一边利用pH计测量酸度，并用盐酸调整pH至3。
生物物质分离工程实验(10级版本)
生物物质分离工程实验实验须知：1、认真预习理解每个实验的目的、原理、操作关键步骤和注意事项。
2、按时上课，迟到20分钟以上者建议重做实验；上实验课时须带实验指导、记录本和笔等。
3、分组后应固定，不能随意更换，不大声喧闹，遵守实验室规则。
4、实验前由教师讲解实验原理、实验具体操作方法以及如何写实验报告。
5、每次实验结束，每组的实验用具要清洗，并却待老师检查实验结果后，方能离开实验室6、学生每次实验要写出规范实验报告，报告数据必须如实记录。
7、教师根据实验操作情况、打扫卫生情况、实验报告及最后考核给出成绩（总分100份）。
（说明：生物工程专业本课程实验总学时为32个，因此安排11个实验生物技术专业本课程实验总学时为16个，因此安排6个实验，做前6个实验）2012年2月实验一有机溶剂萃取法中pH对表观分配系数的影响（第一次实验）一、实验目的和要求1.通过实验，加深对表观分配系数的理解并掌握其测定方法。
22.以红霉素为实验对象，了解pH在萃取工艺中的重要性。
二、实验原理1•红霉素为大环内酯类抗生素，呈弱碱性，在不同pH条件下，在水溶液和有机溶液中溶解度不同，故能达到不同程度的分配。
表观分配系数是指在一定温度和压力下，当分配达到平衡时溶质在萃取相和萃余相中总浓度之比，可通过实验方法测定。
对于弱电解质，溶液的pH对表观分配系数影响很大。
一元弱碱性物质溶液pH对表观分配系数K的关系式见式（1-6-4）1+10pK-pH式中：K0――热力学分配系数，在一定的温度和压力下是常数pk——化合物电离平衡常数的负对数由上式可知，随溶液pH升高，K值增大，有利于红霉素萃取到有机溶剂中。
反之，K 值减小，可将红霉素从有机相反萃取到水相。
2.利用红霉素在冰醋酸中被浓盐酸水解后，与对二甲氨基苯甲醛形成有色物质，并在486nm波长处有最大吸收值的特性，可测定其化学效价，从而计算出表现分配系数。
三、实验器材与试剂（一）器材精密电子天平，60ml分液漏斗，分光光度计，恒温水浴锅，pH酸度计，移液管，烧杯，量筒，试管，50ml容量瓶，称量瓶和温度计等。
生物分离工程实验
生物分离工程实验强调一下：下周一、二下午（3月31日、4月1日）一点半在生物楼411上实验，预习实验一、带讲义、不许迟到。
共5次课，缺席一次就没有成绩。
生物分离工程实验吴国峰郑春英二零一四年三月实验一凝胶色谱法分离蛋白质一、实验目的1. 掌握凝胶色谱的基本原理；2. 掌握凝胶色谱的基本操作；3. 了解物质在色谱柱中的洗脱行为与分配系数的关系。
二、实验原理本实验将蓝葡聚糖2000（分子质量2000kD ）、细胞色素c （分子质量17kD ）和DNFP-甘氨酸（分子质量0.5kD ）的混合物通过交联葡聚糖凝胶G-50（Sephadex G-50）的色谱柱，以蒸馏水为洗脱溶剂进行洗脱。
蓝葡聚糖2000分子量最大，全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中，而未进入凝胶颗粒内部，因而洗脱速度最快，最先流出柱，其V e =V o 即K d =0。
DNFP-甘氨酸分子量最小，不被排阻而可完全进入凝胶颗粒内部，洗脱速度最慢，最后流出柱，其V e =V i +V o 即K d =1。
细胞色素c 分子量在上述二者之间，其洗脱速度居中。
可以从蓝、红、黄三种不同颜色直接观察到三种物质分离的情况，并通过洗脱体积计算V i 、V o 和各自的K d 。
d K 与e V 、0V 和i V 的关系见下式：d K 0e iV V V -= 式中 K d ——分配系数，表示其被排阻的程度，只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关；V t ——柱体积，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积，在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床；V 0——外水体积，色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积；V i ——内水体积，因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，即分间隙的总和为内水体积，又称定相体积（不包括固体支持物的体积g V ）；V e ——峰洗脱体积，指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积。
通常情况下，0＜K d ＜1，当K d ＞1时，说明凝胶对组分有吸附作用。
生物分离工程实验-实验一
六、注意事项
5、实验过程中一定要记得测定A、B两管的下层水相的体积！ 6、测定吸光值时，注意一定要将溶液装到比色皿高度的2/3左右，不得低
2）原液B （1mg/ml）分别取0.5、1、2、3、4、5ml，用 0.1MKCl的水溶液（pH 7.2）稀释至5ml，配成0.1、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8,、1.0mg/ml的溶液，以稀释液为空白对照， 其他操作同上。
பைடு நூலகம்
五 结果与计算
1、原液A和原液B分别以吸光度值A为纵坐标，牛血清蛋白 量（ mg/ml ）为横坐标作标准曲线图，线性回归，求直线 方程和R2。
2、测吸光度值时，若要进行稀释，则需用相应A原液所用的缓冲液稀释A原 液的水相，用B原液缓冲液稀释B原液的水相。
3、紫外分光光度计：必须使用石英比色皿
4.1、原液A操作中，离心完成后，会形成一种上相油层、中间白色乳浊液层、 下层水相的状态，而且下层水相体积很小，测定该下层溶液光度值时，可以 采用医用针筒抽取出来，并记下其总体积，若针筒长度不够，可以剪去针筒 外端两个突起再吸；然后吸出其水相到干净试管中（注意不要吸入乳浊 液！），并确定其吸出体积， 用0.1MKCl的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释到5ml （计算其稀释倍数），在280nm下测吸光值。
3）KCl ：防止水相乳化，影响萃取物与亲水头部的作用力， 离子浓度越大，萃取率越小。同时影响反胶束的大小。
四、 实验操作
1、萃取：在两只50mL离心管中分别加入10ml原液A和原液B，再分别加 入10ml反胶束相溶液，在旋涡混合器上充分混合5min，达到萃取平衡。
《生化分离工程实验》课件
CHAPTER
04
结果分析与讨论
数据记录与整理
数据记录的准确性
确保实验过程中所有数据都被准确记 录，包括但不限于温度、压力、流量 、重量等。
数据整理的规范性
将实验数据整理成表格或图表，便于 分析和对比。
结果分析
数据对比分析
将实验数据与理论值进行对比，分析 偏差产生的原因。
趋势分析
分析实验数据的变化趋势，预测未来 可能的结果。
根据选择的分离方法，设计合理 的分离流程。
控制分离过程中的温度、pH值 、浓度等参数，确保分离效果。
监测分离过程中的关键指标，如 目标成分的纯度和收率。
产物检测与鉴定
利用生化分析方法（如光谱分析、质谱分析、电泳等）对分离得到的产物进行检测 与鉴定。
比较实验结果与预期目标，评估实验的分离效果。
分析实验误差来源，提出改进措施，优化实验方案。
有机溶剂
用于提取和纯化目标产物 的有机溶剂。
实验器具与设备
发酵罐
用于进行微生物发酵的容器。
离心机
用于分离和纯化目标产物的设备。
层析柱
用于进行色谱分离的柱状设备。
CHAPTER
03
实验方法与步骤
样品处理与制备
样品收集
样品纯化
选择具有代表性的样品，确保样品新 鲜、无污染。
去除样品中的杂质，提高目标生化成 分的纯度。
误差分析
系统误差分析
分析实验过程中由于仪器、设备等因素导致的误差。
随机误差分析
分析实验过程中由于环境、操作等因素导致的误差。
CHAPTER
05
实验结论与总结
实验结论
实验结果分析
对实验过程中收集的数据进行分析，对比实验结果与预期结果的差异，评估实验 的准确性和可靠性。
《生物分离工程实验》课程教学大纲
《生物分离工程实验》课程教学大纲总学时：24 学 分：1.5理论学时：0 实验学时：24面向专业：生物工程 课程代码：B4100112先开课程：物理化学、化工原理等 课程性质：必修课执笔人：谭海刚 审定人：宫春波 孙庆杰第一部分：实验教学部分一、说明1、本门课程实验的性质任务、目的与要求本实验课程是对理论教学课程的验证，训练学生掌握生物分离工程最基本的操作技能， 了解生物分离的基本知识，加深理解课堂讲授的某些生物分离理论，同时，通过实验培养学 生观察思考、分析问题和解决问题的能力，培养学生实事求是、严肃认真的科学态度以及勤 俭节约、爱护公物的良好作风，为今后的学习和工作打下坚实的基础。
2、本门课程实验项目设置情况实验类型序号 实验名称学时必开选开验证基本操作综合性、设计性内容提要1 微生物细胞的破碎及分离4 √ √啤酒酵母的培养；超声波破壁（高压匀浆破壁或酶法破壁）；计算细胞破碎率。
2 牛奶中酪蛋白的制备及其等电点的测定4 √ √牛奶中酪蛋白的制备——离心去脂法和加热法；酪蛋白等电点的测定。
3 用 PEG/ （NH4） 2SO4双水相体系萃取糖化酶6 √ √不同比例双水相体系提取糖化酶；次碘酸盐法测定糖化酶活力。
4 糖化酶的分离纯化——分子筛层析脱盐6 √ √糖化酶的浸出； 硫酸铵盐析；分子筛层析脱盐；测定糖化酶活力。
5 离子交换树脂总交换容量的测定6 √ √用静态法和动态法测定阴、阳离子交换树脂的总交换容量。
6 氨基酸的分离鉴定——纸层析法4 √ √配制扩展剂和显色剂； 点样；展开；显色；计算 R f 值。
7 酵母 RNA的提取及 4 √ √ 浓盐法、稀碱法提取酵母定性和定量鉴定 ——浓盐法和稀碱 法 RNA；紫外分光光度计测定 酵母 RNA的含量。
8 薄层层析法分离鉴定糖分4 √ √配制扩展剂和显色剂； 制板；点样；展开；显色；计算 Rf值9用超滤技术分离和浓缩碱性蛋白酶 （糖化酶）8 √ √以碱性蛋白酶（糖化酶）粗品为料液超滤，同时进行超滤性能各项指标的研究，包括膜的水通量、截留率、超滤速度随透出液体积而变化的规律。
生物分离工程试验
生物分离工程试验实验一、重组木聚糖酶的亲和层析纯化1、实验目的掌握His-tag亲和层析柱纯化蛋白的方法2、实验原理由xynB基因编码的木聚糖酶有很高的热稳定性，在90℃下保温2h，仍然有90%的活性，基于这一点，我们可以先用加热的方法除去酶液中的大部分不耐热的杂蛋白。
蛋白质表面的某些氨基酸残基如：组氨酸的咪唑基团，半胱氨酸的巯基，色氨酸的吲哚基团（后两种与金属离子的作用要小得多），可与金属离子亲和结合。
用螯合剂可以将金属离子（Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+）螯合到母体。
洗脱时，可以通过改变盐的浓度等降低金属离子与蛋白质的亲和力将其洗脱。
经典的如组氨酸标签-镍离子亲和柱子（His-tag）：组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲和配体（也就是填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作用。
洗脱的时候用高浓度的咪唑将蛋白洗下。
组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段。
在xynB 基因编码的C端，我们引物的编码六个组氨酸的CAC 密码子，使得重组酶带上组氨酸标签。
3、实验材料和设备A. 试剂Ni-NTA亲和层析介质5ml1X Charge buffer：50 mmol/L NiSO41X Binding buffer：5mmol/L 咪唑，0.5 mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl，最终pH调到7.91X Wash buffer：60mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl ，最终pH 调到7.91X Elute buffer：1 mol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl ，最终pH调到7.91X Strip buffer：100 mmol/L EDTA，0.5mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl ，最终pH调到7.9以上各成分的浓度为终浓度。
生物物质分离工程
生物物质分离工程生物物质分离工程实验李菊娣编辽宁石油化工大学环境工程系二○○七年三月生物物质的分离、提取实验是以实验操作为主的技能课程，是生物工程专业学生的必修课，是在学习《分析化学》、《生物化学》《微生物学》、《发酵工程》、《生物分离工程》等专业基础课及专业实验课的基础上开设的课程。
目的在于通过本课程的实验训练，使学生对整个生物工程下游生产过程有一个全面的认识和理解，既可培养他们实际操作的技能，又可达到提高他们理论联系实际能力的目的。
通过学习，使学生能够掌握物质分离常用的纯化方法和常见的分离设备，为以后的学习和科研工作打下良好的基础。
实验一、微生物细胞的破碎及分离实验二、青霉素的萃取及萃取率的计算实验三、醋酸丁酯萃取红霉素实验四、牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备实验五、胰凝乳蛋白酶的制备实验六、薄层色谱法鉴定果汁中的糖实验七、离子交换法提取L-精氨酸备注：实验二、三选作其一；实验五、六选作其一。
实验一微生物细胞的破碎及分离一、实验目的与要求实验目的：1、掌握超声波细胞破碎的原理和技术，学习细胞破碎率的评价方法。
2、通过本试验使学生复习以前所学的分离知识及掌握微生物学实验、发酵工程实验技能，同时通过本试验使学生掌握超声波破碎仪的使用。
3、通过按照给定的研究题目，独立的进行试验，并观察试验中的各种现象，分析总结实验得出的各种数据并撰写相应的研究及实验报告等各过程，来培养学动手能力和独立分析问题的能力，并了解学习科学研究的基本过程与要求，提高科学研究的素质，为将来从事科学研究打好基础。
实验要求：1、复习生物物质分离课程所学到的微生物细胞的分离方法，了解影响微生物细胞的破碎因素。
2、独立查阅相关资料，设计实验方案，并对实验所需的各种药品、玻璃仪器及分析设备列出清单，写出详尽的试验过程及需要。
3、三人一组，互相配合，开展实验，动手完成实验，并记录并分析实验中的实验现象、数据，必要时及时修改试验计划。
4、总结试验数据，经教师认定后，撰写实验报告。
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生物分离工程实验
实验一茶多酚标准曲线的测定
仪器：紫外分光光度计，比色皿，天平，容量瓶，移液管，pH计、试管
药品：没食子酸丙酯或茶多酚，酒石酸钾钠，硫酸亚铁，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾。
方法：
A溶液配制
没食子酸丙酯标准溶液配制
准确称取25mg没食子酸丙酯，蒸馏水溶液，移入25mL容量瓶并稀释至刻度，摇匀，配制成1mg/mL的标准溶液
酒石酸亚铁溶液配制
准确称取0.1g硫酸亚铁，和0.5g酒石酸钾钠，混合，蒸馏水溶解后移入100mL容量瓶，稀释至刻度，摇匀。
pH7.5磷酸盐缓冲液配制
磷酸氢二钠：准确称取分析纯磷酸氢二钠2.969g，蒸馏水稀释溶解，移入250mL容量瓶，加水稀释至刻度，摇匀，为a液
磷酸二氢钾：准确称取分析纯磷酸二氢钾，、2.2695g，蒸馏水溶解，移入250mL容量瓶，定容，B。
取A液体85mL，B液体15mL混合均匀，即成。
B．标准曲线绘制
分别吸取0、0.25、0.50、0.75、1.0、1.25mL的没食子酸丙酯标准液于25mL容量瓶中，加入蒸馏水4mL，再加入酒石酸亚铁溶液5mL，用pH7.5的磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，分光光度计在540nm处，1cm比色皿，分别测定吸光度。
空白参比操作同上，不加没食子酸丙酯。
以容量瓶中没食子酸丙酯的绝对含量mg为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，做线性回归。
C 样品测定
取适量样品加入容量瓶，操作同上，没食子酸丙酯含量乘以换算系数1.5，求得茶多酚。
实验二超声法和回流法提取茶多酚的比较
实验仪器：
超声提取器、布氏漏斗、抽滤瓶、真空泵、烧瓶、量筒、分光光度计、比色皿、容量瓶等、实验试剂
茶叶、纯净水、茶多酚（没食子酸丙酯）、硫酸亚铁、酒石酸钾钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾等
操作方法
1、材料准备
称取一定量的茶叶，研钵粉碎。
备用
2、提取
A、超声提取法
称取5g粉碎后茶叶末，放入烧瓶（塑料袋密封），加入100mL水，于超声提取器，50℃提取20min，抽滤，定容至100mL，待测。
B、回流提取法
称取10g粉碎后茶叶末，放入圆底烧瓶，加入100mL水，80℃提取40min，分别在1、3、5、7、10、15、20、30、40min取3mL样品，小漏斗过滤后，待测。
测得茶多酚含量（mg/mL）以茶多酚含量为纵坐标，时间为横坐标绘制曲线。
3. 含量测定
按照标准曲线的方法测定含量。
所需试剂及仪器
试剂：
没食子酸丙酯或者茶多酚，酒石酸钾钠，硫酸亚铁，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，
仪器：
紫外分光光度计，水浴锅，电子天平，pH计，超声提取器，量筒（100mL*1），容量瓶（25mL*8，100mL*4, 250mL*2），比色皿*5，移液管（1.0mL*2, 0.5mL*2, 2mL*2, 5mL*4）
三角瓶250mL*2，小漏斗*2，试管架。