第四章DNA的复制
生物医学概论生化第4章基因信息的传递和表达
5 3
串联重复序列 反向重复序列
3 5
· · · TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA
58
66
166
174
201
209
237
245
E. coli复制起始点 oriC
目录
引发体和引物
Dna B、 Dna C Dna A 5 3
引物 酶
进行解链，进行的是单点起始双向复制。
复制中的放射自显影图象
目录
3. 半不连续复制
3
前导链 (leading strand)
5 3
解链方向
后随链 (lagging strand)
5
目录
顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的， 这股链称为前导链(leading strand) 。
另一股链因为复制的方 A C T G G
T C C A T G A C G G T G A C C
C C A C T G G
G G T G A C C
AT GC GC TA AT CG TA GC CG CG AT CG TA GC GC
+
AT GC GC TA AT CG TA GC CG CG AT CG TA GC GC
氢键，使DNA双链解开成为两条单链。
单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding
protein, SSB) ——在复制中维持模板处于单链状
态并保护单链的完整。
目录
复制起始点附近区域的DNA双链解开成为两条单链。
SSB
解链方向 解螺旋酶
目录
DNA拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态、理顺DNA链
第四章 DNA的复制-
• DNA的解链过程，首先在拓扑异构酶I的作 用下解开负超螺旋，并与解链酶共同作 用，在复制起点处解开双链，一旦局部解 开双链，就必须有SSB蛋白来稳定解开的 单链，接着由引发酶等组成的引发体迅速 作用于两条单链DNA。 • 不论是前导链还是滞后链，都需要一段 RNA引物以开始子链DNA合成。
• 冈崎片段与半不连续复制 由于DNA双螺旋的两条是反向平行的，因此在复制 叉附近解开的DNA链一条是5’-3’方向，另一条是 3’-5’方向，决定了前导链的复制是连续的，而滞 后链的复制是不连续的。因此称为DNA的半不连续 复制。 冈崎片段 在DNA不连续复制过程中，沿着后随 链的模板链合成的新DNA片段。随后共价连接成完 整的单链。其长度在真核与原核生物当中存在差 别，真核冈崎片段长度约为100～200核苷酸残 基，而原核为1000～2000核苷酸残基。
末端长度可变
A typical telomere has a simple repeating structure with a G-T-rich strand that extends beyond the C-A-rich strand. The G-tail is generated by a limited degradation of the C-A-rich strand.
The rolling circle replicates DNA
Phage λ
A rolling circle appears as a circular molecule with a linear tail by electron microscopy.
某种蛋白质介入而在真正的末端启动复制
真核细胞中DNA的复制调控
• 真核细胞中DNA复制有3个水平的调控 （1）细胞生活周期水平的调控 即决定细胞停 留在G1期还是S期，许多外部因素和细胞因子 参与限制点的调控。 （2）染色体水平的调控 决定不同染色体或同一 染色体不同部位的复制子按一定的顺序在S期 起始复制 （3）复制子水平调控 决定复制的起始与否
分子生物学：DNA复制
(CsCl gradient centrifuge)
N15
DNA
N14
Semi-Conservation Replication
Source:M. Meselson and F. W. Stahl, Sciences 44:675, 1958.
半半保保留留复复制制-小结
DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为 模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代 细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则 完全重新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。 这种复制方式称为半保留复制。
RNA引物的形成
DNA链合成及延长
复制的终止
• RNApol (RNA polymerase)
[Rif S ]
完成对先导链引物的合成
实现DNA复制的转录激活起始
起
• dnaG (primase) [Rif R]
始
完成对后随链引物的合成
较先导链的启动落后一个Okazaki片断
• 完成10±NtRNA引物合成后.
遗传物质的基本属性：基因的自我复制 基因的突变 控制性状的表达
DNA复制
亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下， 分别以每 条 单链DNA分子为模板，聚合与 自身碱基可以互补配对的游离的dNTP,合 成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代 DNA分子的过程。 主 要 包 括 引 发 、 延 伸 、 终止三个阶段。
复制发动温度敏感突变型（慢停突变） 42℃不能发动DNA复制、但可完成DNA延伸
37 ℃, 5 ci / mM H3-T , 6min
37 ℃, 52 ci / mM H3-T , 6min
宁波大学基因工程考研题库-精
第一章绪论1.分子生物学要研究的主要内容是（）（）（）参考答案是：基因工程；基因表达调控研究；结构分子生物学第二章DNA结构一、填空题(6分)1.天然存在的DNA分子形式为右手（）型螺旋参考答案是：B2.Cot曲线方程为：（）参考答案是：C/C0=1/（1+K2C0t）3.DNA复性必须满足两个条件：（）（）参考答案是：盐浓度必须高；温度必须适当高4.DNA 携带有两类不同的遗传信息，即（）信息和（）信息。
参考答案是：基因编码；基因选择性表达二、判断题(12分)1.拓扑异构酶I解旋需要ATP酶。
参考答案是：不正确2.假基因通常与它们相似的基因位于相同的染色体上。
参考答案是：不正确3.水蜥的基因组比人的基因组大。
参考答案是：正确4.一段长度100bp的DNA，具有4100种可能的序列组合形式。
参考答案是：正确5.单个核苷酸通过磷酸二酯键连接到DNA骨架上。
参考答案是：正确6.在高盐和低温条件下由DNA单链杂交形成的双螺旋表现出几乎完全的互补性，这一过程可看作是一个复性（退火）反应。
参考答案是：不正确7.生物的遗传密码只存在于细胞核中参考答案是：不正确8.Top I解旋需要ATP参考答案是：不正确9.琼脂糖凝胶电泳—EBr电泳法分离纯化超螺旋DNA原理是根据EBr可以较多地插入到超螺旋DNA 中，因而迁移速度较快参考答案是：不正确10.高等真核生物的大部分DNA是不编码蛋白质的参考答案是：正确11.Cot1/2与基因组复杂性有关参考答案是：正确12.Cot1/2与基因组大小有关参考答案是：正确三、单选题(4分)1.DNA变性是由于（D）A 磷酸二酯键断裂；B 多核苷酸解离；C 碱基的甲基化修饰；D 互补碱基之间氢键断裂；E 糖苷键断裂；2.1953年，Watson 和Crick提出（A）A 多核苷酸DNA链通过氢键连接成一个双螺旋；B DNA的复制是半保留的，常常形成亲本-子代双螺旋杂合链；C 三个连续的核苷酸代表一个遗传密码；D 遗传物质通常是DNA而非RNA。
分子生物学 ch4DNA复制
第四章 DNA的复制一、名词解释:1、半保留复制：DNA复制过程中，每个子代DNA分子的一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种方式称为半保留复制2、半不连续复制：DNA复制时，一条链是连续的，另一条链是不连续的，因此称为半不连续复制3、Klenow片段：E.coli DNA pol I是单一肽链的蛋白质，用枯草杆菌蛋白酶水解得到一个N端的小片段和C端大片段。
大片段含有5’→ 3’聚合活性和3’→ 5’外切活性，称为Klenow片段4、复制起始点（ori）：DNA复制起始点是特定的，表现为序列特异性，并有特异性蛋白和酶与之结合，这一特异性序列称为复制起始点5、冈崎片段：DNA滞后链的复制中产生的短片段6、回环模型：DNA双螺旋同时进行复制，在复制叉处滞后链模板形成一个环，以适应双链同时进行复制，这种复制模型称为回环模型7、复制子repicon：DNA分子上一个独立的复制单位8、复制体replisome：有解旋酶、引发酶和DNA pol III全酶组成的复合体，在DNA合成时，沿复制叉方向移动9、自主复制区ARS：酵母的复制起始点称为自主复制区。
10、端粒（telemere）：真核生物染色体DNA的两端是一种重复序列的特殊结构称为端粒11、引发体（primosome）：大肠杆菌DNA复制中，由DnaB解螺旋酶和DnaG引物酶构成复制体的一个基本单位称为引发体二、填空题1.在原核生物和真核生物DNA合成中负责填补空缺的酶分别是DNA聚合酶I和DNA聚合酶ε。
2.染色体中参与复制的活性区呈Y型结构，称为复制叉。
3.在DNA复制和修复过程中修补DNA螺旋上缺口的酶称为DNA连接酶。
4.在DNA复制过程中，连续合成的子链称前导链，另一条非连续合成的子链称为滞后链。
5.原核生物和真核生物中主要负责复制的酶分别是DNA聚合酶III和DNA聚合酶δ。
6.DNA后随链合成的起始要一段短的RNA引物，它是由DNA引发酶以核糖核苷酸为底物合成的，在真核生物中相同功能的酶是DNA聚合酶α。
DNA操作技术
个切割位点。如Bgl II只有6个，BamHI只
有5个，而SalI只有2个，意味着λDNA中
GC含量少于50%。
这种方法只能粗略的估计，只有实验能子（溶液）
酶
缓冲液（一般pH值7.4, 含Mg2+, NaCl, 还原剂如dithiothreitol稳定酶阻止 活）
1.1 核酸酶
作用：降解 磷酸二酯键 分为： 外切酶 内切酶
1.1 核酸酶
Bal 31(来自于细菌Alteromonas espejiana) 单链特异的核酸内切酶活性，
双链特异的内切酶活性。 依赖于Ca2+ 用途： 构建限制酶图谱 产生末端缺失突变 DNA超螺旋线性化
1.1 核酸酶
E. coli外切酶III
识别GATC。也有一些酶识别兼并序
列，如HinfI来自于Haemophilus influenzae品系Rf，识别GANTC，N
代表A, G, T, C。
2.4 限制性内切酶产物
钝端（平端） 粘性末端
粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末 端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成 氢键，所以称为粘性末端。
1.1 核酸酶
RNase H（E. coli）
–降解RNA:DNA杂交分子中 的RNA。
1.2 连接酶
广泛存在于各种生物中，连接3‘端羟基 和5’端磷酸形成磷酸二酯键。在DNA复 制、修复、以及 体外重组
过程中起
重要作用。
1.2 连接酶
T4-DNA连接酶 –连接粘性末端、平端 –修复双链DNA或RNA-DNA杂交
2.2 限制性内切酶分类
限制性核酸内切酶可分为三大类：
– I类 –II类* –III类
分子生物学教学教案
分子生物学教学教案教案内容：一、教学内容：本节课的教学内容选自人教版《分子生物学》教材，第四章“DNA复制”。
具体内容包括：DNA复制的过程、DNA复制机制、复制起点和复制的酶等。
二、教学目标：1. 让学生了解DNA复制的过程及机制，掌握复制起点和复制的酶的作用。
2. 培养学生运用分子生物学知识解决实际问题的能力。
3. 激发学生对分子生物学的兴趣，培养学生的创新思维。
三、教学难点与重点：难点：DNA复制的过程及机制、复制起点和复制的酶的作用。
重点：DNA复制的过程、复制机制和复制酶的作用。
四、教具与学具准备：教具：多媒体教学设备、黑板、粉笔。
学具：教材、笔记本、彩色笔。
五、教学过程：1. 实践情景引入：以“克隆羊多莉的诞生”为例，引导学生思考DNA复制在生物繁殖中的重要性。
2. 知识点讲解：（1）介绍DNA复制的过程：解旋、合成子链、形成子代DNA分子。
（2）讲解DNA复制机制：半保留复制、双向复制。
（3）阐述复制起点的作用：启动复制、确定复制方向。
（4）介绍复制的酶：DNA聚合酶、解旋酶、连接酶等。
3. 例题讲解：分析DNA复制过程中可能遇到的问题，如复制错误、修复等。
4. 随堂练习：（1）简述DNA复制的过程。
（2）解释DNA复制机制的作用。
（3）列举至少三种复制的酶及其作用。
5. 知识拓展：介绍DNA复制在医学、生物科技领域的应用，如基因治疗、克隆技术等。
六、板书设计：板书DNA复制板书内容：1. 复制过程：解旋、合成子链、形成子代DNA分子2. 复制机制：半保留复制、双向复制3. 复制起点：启动复制、确定复制方向4. 复制酶：DNA聚合酶、解旋酶、连接酶等七、作业设计：1. 简述DNA复制的过程。
答案：DNA复制是指在细胞分裂过程中，DNA分子通过解旋、合成子链、形成子代DNA分子的过程。
2. 解释DNA复制机制的作用。
答案：DNA复制机制的作用是确保遗传信息的准确传递，保证子代细胞的基因组与亲代细胞一致。
第四章基因克隆的载体、噬菌体载体
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
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实验证据（1958 Meselson 和Stahl）
Matthew Messelson
Franklin Stahl
DNA半保留复制的生物学意义：
DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳 定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。
4.1.2 双向复制
基本概念： DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。 ori(或o）、富含A、T的区段。
单链DNA结合蛋白
单链DNA结合蛋白（single stranded DNA binding
protein，SSB） 的作用是在复制中维持模板处于单 链状态并保护单链的完整。
模板的DNA总要处于单链状态，而DNA分子只要
符合碱基配对，又总会有形成双链的倾向，以使分 子达到稳定状态和免受胞内广泛存在的核酸酶降解。
组蛋白样蛋白（HU）、旋转酶
解链酶六体分 别与单链DNA 相结合(需DnaC 帮助)，进一步
解开DNA双链
SSB维持单链稳定
双链解开过程
引发体的形成
Dna B、 Dna C Dna A 5 3 DNA拓扑异构酶 SSB 5 3
含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引发酶和DNA 复制起始区域的复合结构称为引发体。
DnaB蛋白
解螺旋酶，利用ATP供能，作用于氢键，使
DNA双链解开成为两条单链。
Dna C
Dna B
解链方向
DnaC蛋白
Dna C蛋白的作用是将具有解链酶活性的
Dna B蛋白运送到复制模板，并协同Dna B 蛋白的作用。
DnaA蛋白复合物 DnaB、DnaC
DnaG（引物酶）
解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、
性质 3’ 5’外切活性 5' 3’外切活性 5' 3’聚合活性 聚合酶Ⅰ + + + 中 聚合酶Ⅱ + + 很低 聚合酶Ⅲ + + 很高
新生链合成
主要是对DNA损伤的 修复；以及在DNA复 制时切除RNA引物并 填补其留下的空隙。
修复紫外 光引起的 DNA损伤
-
+
DNA 复制的主要 聚合酶，还具有 3’-5’外切酶的 校对功能，提高 DNA复制的保真性
基因信息的传递
* DNA通过复制，将基因信息代代相传
* DNA通过基因表达，决定了蛋白质的结构和功能 * RNA参与DNA遗传信息的表达
* RNA也可作为某些病毒遗传信息的载体
DNA
转录和翻译 复制
决定蛋白质的功能 生命活动的执行者
将基因信息代代相传 生命延续的物质基础
本篇主要内容
复制（replication） 基因表达
ori
ori
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’
3’
3’
5’
复制子
复制方向和速度：
单起点、双向等速
多起点、双向等速
4.1.3 复制的半不连续性
DNA双螺旋的两条链是反平行的，而DNA合成的方向只能是
5’→3’ 。
在DNA复制时，1条链的合成方向和复制叉的前进方向相同，
可以连续复制，叫作前导链（leading strand）；而另一条链的 合成方向和复制叉的前进方向正好相反，不能连续复制，只能
C. 复制接近终止点(termination, ter)
型： 环状DNA分子的双向复制方式
真核生物的双向复制
真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制
子的复制。
习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个
复制子(replicon) 。复制子是独立完成复制的功 能单位。
5’ 3’
ori
ori
4.3 DNA的复制过程
4.3.1 原核生物DNA的复制
复制的起始
复制的延伸 复制的终止
复制的起始
DNA解链 引发体的形成并合成引物
超螺旋的转型
在多种蛋白质参与下,DNA解开成单链
大约20个DnaA
蛋白在ATP的
作用下与oriC
处的4个9bp保
守序列相结合
在HU蛋白和ATP的共同 作用下，Dna复制起始复 合物使3个13bp直接重复 序列变性，形成开链
1、遵守严格的碱基配对规律；
2、DNA聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能；
3、复制出错时，DNA聚合酶的即时校读功能。
4.2 DNA复制的酶学
4.2.1 复制的化学反应
复制的反应体系
底物：四种脱氧核苷三磷酸dNTP：
dATP 、dTTP、 dGTP、 dCTP
聚合酶：依赖DNA的DNA聚合酶，DNA-pol； 模板：指解开成单链的DNA母链； 引物：提供3’－OH末端，使dNTP可以依次聚合； 其他酶和蛋白质因子。
连接磷酸二酯键。
DNA分子一边解链，一边复制，拓扑酶是在复制
全过程中都是有作用的。
•作用机制
拓扑异 构酶Ⅰ
上海生化所1998年分子遗传学试题：
拓扑异构酶 切断DNA双链中一股链，使DNA 解链旋转不致打结；适当时候封 闭切口，DNA变为松弛状态。 反应不需ATP。
拓扑异 构酶Ⅱ
切断DNA分子两股链，断端通过 切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端， DNA 分子进入负超螺旋状态。
代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新
合成的，这种复制方式称半保留复制。
A G A A C T T
T C T T G A A
母代DNA
A G A A C T T
T C T T G A A
A G A A C T T
T C T T G A A
子代DNA
中国科学院上海生化与细胞所2002年招收硕士 研究生分子遗传学入学考试： 请设计一个实验来证明DNA复制是以半保留方 式进行的（8分）。
引物的合成
DnaB蛋白活化引物合成酶，引发RNA引物的合成。 引物长度约为几个至10个核苷酸。
基因组DNA复制时，先导链的引物是DNA，后随 链的引物是RNA (-) 2002年上海生化与细胞所
引物的合成
Dna B、 Dna C Dna A
5
3 3
DNA拓扑异构酶
5
引发体的蛋白质部分在DNA链上可以移动，并
在复制起始时需要多种酶和蛋白因子，共同起
解开、理顺DNA链，维持DNA在一段时间内 处于单链状态的作用。
原核生物复制起始的相关蛋白质
蛋白质（基因） DnaA (dnaA) DnaB (dnaB) DnaC (dnaC) DnaG (dnaG) SSB 拓扑异构酶 (gyrA, B) 引物酶 单链DNA 结合蛋白 解螺旋酶 通用名 功能 辨认起始点 解开DNA双链 运送和协同DnaB 催化RNA引物生成 稳定已解开的单链 理顺DNA链
3´ T C G AA G T C C T A G C G A C 5´
• 3 5外切酶活性 能辨认错配的碱基对，并将其水解。 • 5 3外切酶活性 能切除RNA引物和突变的 DNA片段。
原核生物的DNA聚合酶
DNA-pol I
DNA-pol II
DNA-pol Ⅲ
原核生物中的DNA聚合酶(大肠杆菌）
缠绕、连环等现象。
DNA拓扑异构酶 （DNA topoisomerase）
Unwound Parental Duplex
OverWound region
DNA拓扑异构酶 （DNA topoisomerase）
DNA拓扑异构酶，改变DNA分子构象，理顺DNA
链，使复制能顺利进行。
分类：拓扑酶Ⅰ和拓扑酶Ⅱ 作用特点：对DNA分子的作用是既能水解，又能
引发酶
DNA聚合酶不能从头合成DNA链，只能延长已有的
DNA或RNA引物链。
引发酶（primase）在复制起始时催化引物（primer）
合成，提供3-OH末端，使DNA-pol能够催化dNTP聚合。
引发酶属DNA指导的RNA 聚合酶，但不同于催化转录
过程的RNA聚合酶。在E.coli，引发酶是dnaG基因的产 物DnaG。
复制叉
复制叉
基本概念：
双向复制
复制时，DNA从起始点（origin）向两个方向解链，
形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制 （bidirectional replication）。
复制中的放射自显影图象
原核生物的双向复制
ori
ter
A
B
C
A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉
E. Coli 基因图
与复制起始及解链相关的酶类及蛋白
DnaA蛋白
DnaB蛋白（解螺旋酶） DnaC蛋白
DnaA蛋白
DnaA蛋白是由相同亚基组成的四聚体。
复制起始时， DnaA蛋白辨认并结合E.coli上复
制起始点oriC，10~20个DnaA蛋白相互靠近形 成DNA蛋白质复合体结构，促使oriC局部解链。
超螺旋的转型，即把正超螺旋变为负螺旋。
实验证明，负超螺旋比正超螺旋有更好的模板作用。
复制起始的过程
1．DnaA蛋白辨认结合oriC的重复序列，并与DNA形成复
合物，引起解链；
2．DnaB在DnaC的辅助下结合于初步打开的双链，并用
其解螺旋酶活性开链；
3．拓扑酶通过切断、旋转和再连结的作用，实现DNA超
4.1.3 半不连续复制
（semi-discontinuous replication）
4.1.4 复制的高度保真性
（high fidelity）
子链继承母链遗传信息的几种可能方式
4.1.1 DNA的半保留复制
（semi-conservative replication）