躯干神经嵴干细胞体外分离培养及其增殖_分化的实验研究
人诱导性多能干细胞向神经干细胞分化的实验研究的开题报告
人诱导性多能干细胞向神经干细胞分化的实验研究
的开题报告
一、研究背景
随着干细胞技术的不断发展，多能干细胞在组织工程、再生医学等领域的应用越来越广泛。
尤其是神经干细胞的研究，对于神经退行性疾病的治疗有着重要的意义。
目前，诱导性多能干细胞向神经干细胞的分化方法已经有很多种，但是分化效率和稳定性还存在一定的问题。
二、研究目的
本研究旨在探究人诱导性多能干细胞向神经干细胞分化的机制，优化分化方法，提高分化效率和稳定性。
三、研究方法
1. 诱导多能干细胞形成三胚层体外培养；
2. 使用特定的细胞因子和小分子化合物诱导诱导性多能干细胞向神经干细胞分化；
3. 对分化效率和稳定性进行评估。
四、研究意义
本研究对神经退行性疾病的治疗有着重要的意义。
同时，通过探究人诱导性多能干细胞向神经干细胞分化的机制，可以为组织工程、再生医学等领域的发展提供理论基础和技术支持。
五、研究进展
目前，已完成多能干细胞形成三胚层体外培养的实验，并初步确定了诱导神经干细胞分化化合物和因子的组合。
下一步将进行分化效率和稳定性的评估实验。
六、研究展望
本研究未来将继续探究人诱导性多能干细胞向神经干细胞分化的机制，进一步优化诱导分化方法，提高分化效率和稳定性。
同时，也将研究分化后神经干细胞的功能和应用。
生物医学研究的体外和体内模型技术进展及其应用
生物医学研究的体外和体内模型技术进展及其应用随着生物医学研究的深入，对于疾病的研究不能仅仅依靠临床数据和动物实验。
由于人体复杂的生理结构和环境，以及道德、法律和安全等限制，单一实验手段已经无法满足研究需要。
因此，体外和体内模型技术成为了现代生物医学研究的重要手段，得到了广泛关注和应用。
一、体外模型技术体外模型，也称为细胞系、细胞培养模型或体外实验，指的是直接人为将动植物组织或细胞分离、培养和鉴定，以模拟疾病的发生和病理生理变化。
相对于体内模型技术，体外模型技术具有优越的灵敏度、可重复性和便携性。
1. 原代细胞培养技术原代细胞培养毫无疑问是最早发展的体外模型技术之一，包括从组织中分离的原代细胞和从血液样品中分离的外周血单个核细胞。
此外，通过对干细胞、胚胎干细胞等特殊细胞进行培养，不仅可以推动干细胞与组织再生领域的开展，还可以帮助研究人类早期胚胎发育和诊断遗传性疾病。
2. 三维细胞培养技术与传统平板式培养技术不同，三维培养技术可以模拟更加真实的生物环境，对于某些生物医学研究领域具有独特的优势。
例如，人类肝细胞和心肌细胞，平时因为生长环境的不同，难以在二维培养环境模拟其生存环境，使用三维培养技术可以解决这个问题。
此外，三维培养技术也可以实现人体细胞与细胞之间的组织工程修复。
3. 利用基因工程技术构建体外疾病模型基因工程技术的广泛应用，使得构建许多体外神经退行性疾病模型成为可能。
研究人员通过对细胞进行特定基因的转化和敲除，模拟疾病的发生和病理生理变化过程，从而可以研究疾病发生机制与治疗方法等问题。
此外，利用不同的基因修饰策略，还可以构建多种类型的疾病模型。
二、体内模型技术相对于体外模型技术，体内模型技术更加完整地模仿了真实场景。
与此同时，体内模型技术在很多情况下具有更高的预测能力。
但由于种种原因，体内模型技术的研究成本和难度也更高。
1. 动物模型动物模型是体内模型技术最传统和常见的方法，对于很多疾病的研究和药物安全性测试都得到了广泛应用。
2018年神经胞体外培养方法及应用-2019年医学文档
①葡萄糖 为神经元能量代谢主要来源 33mm
②CO2 NaHCO3缓冲系统重要 HEPESO2 耗量更高 ③K+ 神经元生理活动的重要离子，K+ 是神经元存活所必需的，K+ 24.5mM 能 提高神经元存活，促分化
神经元无血清限定培养液
人工合成的培养基虽然具备了细胞生 长的基本营养物质和无机盐类，但仍无 法满足不同类型细胞的特殊需要。大多 数神经元在基础培养液中即使能够存活 也为期不长，更难以分裂。因此可根据 神经元的特性，给基础培养中再添加某 些特殊物质。
6年，Nakai首创了神经组织的分离培 养方法 材料来源：胚胎动物神经组织 神经元增殖发生于胚胎期 形态学分化和化学分化程度低，体外存活
神经元的体外培养液
天然合成成分 血清 血浆 胚胎撮液 人工培养基 无血清培养基 化学限定性培养基 常用的：DMEM + 添加剂 F12
选择添加剂的基本过程
限定连续细胞系的体外生长条件。 试定该细胞系来源的细胞的培养 液条件。
Bottenstein实验室经过长期研究 发现如下添加剂比较好
人转铁蛋白、牛胰岛素、硒酸钠、孕 酮、腐胺加入到F12与DMEM 1:1混液中， 可以代替血清添加物，用来培养大鼠 CNS的成神经细胞瘤细胞。删去其中任 何一种添加物都可导致成神经细胞瘤细 胞生长状况锐减。该实验室共列出了三 种神经元限定性培养添加物的配方，代 号分别为N1、N2、N3。
悬滴培养方法 单盖玻方法 双盖玻方法 1925 改良双盖玻方法 培养物： CNS灰质、白质、外周神经节或 神经小段 ↓ ↓
医学研究中的神经干细胞与神经再生治疗
医学研究中的神经干细胞与神经再生治疗神经干细胞与神经再生治疗在医学研究中的应用近年来，神经干细胞与神经再生治疗在医学领域中引起了广泛的关注。
神经干细胞具有自我更新和多潜能分化的能力，被认为是治疗神经系统疾病和损伤的潜在策略。
本文将探讨神经干细胞的特性以及其在神经再生治疗中的应用。
一、神经干细胞的特性神经干细胞是一类具有自我更新和多潜能分化能力的细胞，具有以下几个主要特点：1. 自我更新能力：神经干细胞能够自我更新，不断产生新的神经干细胞，维持其数量的稳定。
2. 多潜能分化能力：神经干细胞具有分化为多种神经系统细胞类型的潜能，包括神经元、神经胶质细胞等。
3. 细胞标志物：神经干细胞表达特定的标志物，如Nestin、Sox2等，用于鉴定和分离这类细胞。
二、神经干细胞在神经再生治疗中的应用神经干细胞在神经再生治疗中具有广阔的应用前景，以下是几个主要方面的介绍：1. 中枢神经系统疾病治疗：神经干细胞可以应用于治疗中枢神经系统疾病，如帕金森病和脑卒中等。
通过向受损区域注射神经干细胞，它们能够分化为神经元，帮助恢复病患的功能。
2. 外周神经损伤治疗：在外周神经损伤治疗领域，神经干细胞可用于修复受损神经的再生。
它们可以分化为神经胶质细胞，形成支持细胞环境，促进受损神经的再生和功能恢复。
3. 神经退行性疾病治疗：神经退行性疾病如阿尔茨海默病和肌萎缩性侧索硬化症等，目前无法根治。
神经干细胞治疗被视为一种新的探索方向。
通过引入具有特定功能和表达抗氧化物等特性的神经干细胞，可延缓或减轻疾病进展，并提供一定的治疗效果。
4. 细胞移植和再生医学：神经干细胞可作为细胞移植和再生医学的关键工具。
它们可以被注射到损伤区域，与已有组织进行结合，促进组织再生和损伤修复。
5. 药物筛选平台：神经干细胞在药物筛选中具有重要作用，可帮助评估和筛选潜在的神经系统药物。
通过与神经干细胞相互作用，研究人员可以获得药物的效应和毒性等相关信息。
三、研究挑战和展望尽管神经干细胞在神经再生治疗中显示出巨大的潜力，但在实际应用中仍存在一些挑战：1. 细胞来源选择：选择合适的细胞来源至关重要，包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞等。
神经干细胞提取与培养方法的比较研究
网络出版时间：２０１８－４－１２９：１３ 网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．Ｒ．２０１８０４１１．１０３３．０５４．ｈｔｍｌ◇实验方法学◇神经干细胞提取与培养方法的比较研究吴 增１，李 媛１，靳晓飞２，周晓红２，高维娟２（１．承德医学院病理生理学教研室，河北承德 ０６７０００；２．河北中医学院河北省心脑血管病中医药防治重点实验室，河北石家庄 ０５０２００）收稿日期：２０１７－１２－２４，修回日期：２０１８－０１－２０基金项目：河北省政府资助临床医学优秀人才培养和基础课题研究项目（［２０１７］４６号 ２）；河北省中医药管理局科研计划项目（Ｎｏ２０１５００７）；河北省教育厅科研计划资助项目（ＮｏＺＤ２０１６１０１）；河北省博士学位点科研能力建设项目（Ｎｏ１７９６７７１１４Ｄ）；河北省硕士研究生创新资助项目（ＮｏＣＸＺＺＳＳ２０１７１３６）作者简介：吴 增（１９８９－），男，硕士生，研究方向：缺血性脑血管病的发生机制及中医药防治，Ｅ ｍａｉｌ：１５０３０７８６０８０＠１６３．ｃｏｍ；高维娟（１９６６－），女，博士，教授，博士生导师，研究方向：缺血性脑血管病的发生机制及中医药防治，通讯作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｇｗｊ６０８８＠１６３．ｃｏｍｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０１８．０５．０２７文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０１８）０５－０７２９－０６中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ３２２．８１；Ｒ３２９．２４；Ｒ９７７．６摘要：目的 探讨神经干细胞（ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＮＳＣｓ）提取、培养的最佳方法，为ＮＳＣｓ的基础研究提供技术参考。
方法 对ＮＳＣｓ的不同提取、培养方法进行比较：提取胎鼠与乳鼠的大脑皮质、采用不同类型培养基、不同接种密度、不同培养方法、不同换液方法、不同传代方法，观察ＮＳＣｓ的成球率和ＮＳＣｓ未分化状态的稳定性。
神经干细胞体外培养技术
神经干细胞体外培养与鉴定一前言神经干细胞(Neural stem cells, NSC S)是神经系统内能产生神经元和胶质细胞的未分化原始细胞【1-2】。
文献报道，NSC具有无限增殖、自我更新和多向分化能力，在适宜的环境条件下，能分化形成各种靶组织细胞【3-5】。
此外，NSC 还可用作为是细胞移植治疗的有效载体，被广泛用于神经疾病细胞或载体治疗。
根据目前的研究结果，其主要作用包括下列三方面：①NSC分化成宿主细胞来替代丢失细胞的作用；②分泌多种细胞因子发挥生物学功能；③桥接作用【6-8】。
基于NSC的上述特性，从而奠定了NSC在细胞替代治疗中有广泛应用前景，而如何获取NSC则是科学研究和临床实践中首先面临的关键问题。
本实验拟建立绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）转基因小鼠NSCs原代和传代培养技术，为后面的实验提供方法支持。
二实验所需仪器、试剂及其配制（一）实验仪器光学显微镜（Olympus,Japan）倒置荧光显微镜（LEICA DMIRB）冰冻切片机（Leica CM1900，Germany）光明DZKW型电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器厂）XK96-A快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）HT-200 电子天平（成都普瑞逊电子有限公司川制）FA1004型精密电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)MP 8001单臂脑立体定位仪(深圳市瑞沃德科技有限公司)10μl微量进样器（Pressure-Lok，PRECISION SAMPLINGCORP，BATON ROUGE，LOUISIANA，Made in USA）0.5ml、1ml Eppendorff管（Ependorff）手术器械：眼科剪、解剖剪、显微剪、显微有齿镊及无齿镊、蚊式钳、刀柄刀片等。
（二）试剂1. DMEM/F12，Hank's液（Hyclone），N2（Gibico），bFGF（Invitrogen）。
SOX9和ETS-1蛋白在人毛囊隆突区迁出细胞中的表达及意义
• 234•中华实用诊断与治疗杂志2021年3月第35卷第3期J Chin Pract Diagn Ther,Mar. 2021，Vol. 35，No_ 3•论著•SOX9和ETS-1蛋白在人毛囊隆突区迁出细胞中的表达及意义辛伍艳，张江安，于建斌，何江曼，袁梦瑾，孙莉婷，孙钰桢郑州大学第一附属医院皮肤科，河南郑州450052摘要：目的观察SOX9和ETS-1蛋白在人毛囊隆突区迁出细胞中的表达及定位，探讨其在白癜风毛囊周围复色机制中 的意义。
方法取6份正常头皮组织，显微镜下分离出单个毛囊并体外培养人毛囊神经嵴干细胞，镜下观察毛囊隆突区干细胞迁出和生长情况，免疫荧光染色法检测SOX9、E T S-l蛋白表达情况。
结果体外培养的人单个毛囊的隆突区可迁出神经嵴干细胞，迁出神经嵴干细胞传代的长满时间和长满密度分别为[(3. 17 ±1. 17) d]、[(2. 79 ±0. 48) X 10s个/m L];SO X9和ETS^l蛋白在人毛囊隆突区迁出神经嵴干细胞均呈阳性表达，且均定位于细胞核。
结论人毛囊隆突区存在神经嵴干细胞，SOX9、ETS~l可能是其标志物。
关键词：白癜风；毛囊；隆突；神经嵴干细胞；SOX9蛋白；ETS-1蛋白Expressions and significances of SOX9 and ETS-1 proteinsin the emigrating cells of human hair follicles bulgeXIN Wu-yan, ZHANG Jiang-an, YU Jian-bin, HE Jiang-man, YUAN Meng-jin, SUN Li-ting, SUN Yu-zhen Department o f Dermatology the First A ffilia ted Hospital o f Zhengzhou University ^Zhengzhou, Hetuni 450052，China Corresponding author：ZHANG Jiang-an, E-mail：**************Abstract: Objective To observe the expressions and localizations of SOX9 and ETS-1 proteins in human hair follicles bulge emigrating cells and to investigate their mechanisms on repigmentation around leucoderma hair follicles. Methods The single hair follicle was isolated from 6specimens of normal scalp tissue»and neural crest stem cells were cultured in vitro.The cells emigration and growth in the hair follicles bulge were observed under microscope. The expressions of SOX9 and ETS-1 proteins were detected by immunofluorescence staining. Results The stem cells were emigrated from the single human hair follicle bulge cultured in vitro, and the overgrowth time and overgrowth density of the emigrating stem cells were (3. 17士 1. 17) d and (2. 79 + 0. 48) X 106cells/mL, respectively. The SOX9 and ETS-1 proteins were positively expressed in the stem cells that emigrated from the human hair follicles bulge»and they were all located in the nucleus. Conclusion Neural crest stem cells exist in the human hair follicles bulge, and SOX9 and ETS-1 might be the markers.Keywords：leucoderma；hair follicles；bulge；neural crest stem cells；SOX9 protein；ETS-1 protein白癜风是一种常见且较难治愈的皮肤病，其治疗 目的是白斑复色。
神经干细胞研究进展
神经干细胞研究进展一、引言神经干细胞(neural stem cell，NSC)是指存在于神经系统中，具有分化为神经神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能，从而能够产生大量脑细胞组织，并能进行自我更新，并足以提供大量脑组织细胞的细胞群[1]。
狭义的神经干细胞是指成体神经干细胞，指的是分布于胚胎及成人中枢及周围神经系统的干细胞。
简单的说，就是在成年哺乳动物的大脑中分离出来的具有分化潜能和自我更新能力的母细胞，它可以分化各类神经细胞，包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
我们所讲的神经干细胞指的就是成体中存在于脑中的中枢神经干细胞，其实在外周也有一些“神经干细胞”称为“神经嵴干细胞”，可以分化成外周神经细胞、神经内分泌细胞和施旺细胞，还可横向分化成色素细胞和平滑肌细胞[2]。
神经干细胞具有以下特征：（1）有增殖能力；（2）由于自我维持和自我更新能力，对称分裂后形成的两个子细胞为干细胞，不对称分裂后形成的两个自细胞中的一个为干细胞，另一个为祖细胞，祖细胞在特定条件下可以分化为多种神经细胞；（3）具有多向分化潜能，在不同因子下，可以分化为不同类型的神经细胞，损伤或疾病可以刺激神经干细胞分化,自我更新能力和多向分化潜能是神经干细胞的两个基本特征[3]。
需要注意的是，在脑脊髓等所有神经组织中，不同的神经干细胞类型产生的子代细胞种类不同，分布也不同。
神经干细胞的治疗机理是：（1）患病部位组织损伤后释放各种趋化因子，可以吸引神经干细胞聚集到损伤部位，并在局部微环境的作用下分化为不同种类的细胞，修复及补充损伤的神经细胞。
由于缺血、缺氧导致的血管内皮细胞、胶质细胞的损伤，使局部通透性增加，另外在多种黏附分子的作用下，神经干细胞可以透过血脑屏障，高浓度的聚集在损伤部位；（2）神经干细胞可以分泌多种神经营养因子，促进损伤细胞的修复；（3）神经干细胞可以增强神经突触之间的联系，建立新的神经环路[4]。
二、研究现状1.新研究阐明大脑干细胞的身份[5]人神经系统具有复杂的结构，它将来自大脑的电信号发送到身体的其他部位，使我们能够移动和思考。
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收稿日期:2008 11 06基金项目:山东省自然科学基金资助课题(Y2007C031),山东省自然科学基金资助课题(Y2007C003)。
作者简介:卢静(1982-),女,硕士研究生,主要从事周围神经再生研究。
通讯作者:李振华(1951-),女,教授,主要从事周围神经再生研究。
E mail:zhenhuali@文章编号:1671-7554(2009)04-0046-04躯干神经嵴干细胞体外分离培养及其增殖、分化的实验研究卢静1,孙晋浩1,张静1,丛丽1,綦晓霞1,庄园2,杨洁1,李振华1(山东大学医学院1.解剖学教研室; 2.组织与胚胎教研室,济南250012)摘要:目的 体外分离培养鉴定躯干神经嵴干细胞,探讨其生物学特性,为研究周围神经再生修复提供新的细胞来源。
方法 取大鼠胚胎躯干部神经管,组织块法培养获取躯干神经嵴干细胞,通过形态学及免疫细胞化学观察其细胞生长、增殖、分化等特性。
结果 原代培养的躯干神经嵴干细胞呈梭形,其特异性标记物nesti n 和p75表达阳性,并有较高的增殖活性。
传代培养后,在含血清培养基中,其分化细胞呈GFAP 、MAP 2、 S MA 阳性。
结论 成功地培养了躯干神经嵴干细胞,细胞表现出多潜能干细胞特性,为研究周围神经组织工程种子细胞来源提供实验依据。
关键词:神经嵴;干细胞;细胞培养;细胞分化中图分类号:R322.8 文献标志码:ACulture,proliferation,and differentiation of trunk neural creststem cells in early e mbryos of rats:an in vitro experimentLU Jing 1,SUN Jin hao 1,ZHANG Jing 1,C ONG Li 1,QI Xiao xia 1,Z HUANG Yuan 2,YANG Jie 1,LI Zhen hua1(1.Department of Anatomy; 2.Department of Histology and Embryology,School of Medicine,Shandong University ,Jinan 250012,China)Abstract :Objective To establi sh a method for in vi tro cul ture of trunk neural crest stem cells and to explore their biological properties,so as to find a new treatment for peripheral nervous system diseases.Methods A neural tube towards the caudal mos t 10somites obtained from fetal rats at E10.5was isolated and explanted in a plate coated with fibronectin for 2days.Truncal neural crest stem cells were collected after being trypsinased.Their growth proliferation and differentiation were observed by an inverted p hase con trast microscope and im munocytochemical technique.Results Primary culture of truncal neural crest stem cells with fibroblast like appearance demonstrated characteristics of neural stem cells,such as clonali ty and pluripotency.Immu nocytochemical staining showed that the cells expressed nestin and p75.Truncal neural crest stem cells could differentiate into neurons,Schwann cells and smooth muscle like cells in the serum containing medium.C onclusion Trunk neural crest stem cells were successfully cultured in vi tro ,which provides an experimental basis for further research of tissue engineering of candi date cells.Key w ords :Neural crest;Stem cell;Cell culture;Cell differentiation神经嵴是脊椎动物胚胎早期从神经管背外侧迁移出来的位于神经管和外胚层之间的两条纵向细胞带[1]。
神经嵴细胞能够进行自我更新,并可分化为神经元、神经胶质细胞、平滑肌样细胞等多种类型的细胞,也称为神经嵴干细胞(neural crest ste m cell,NCSC)。
自躯干部神经管区域迁移出来的神经嵴干第47卷 第4期Vol.47 No.4山 东 大 学 学 报 (医 学 版)J OURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY(HEALTH SCIENCES)2009年4月 Apr.2009细胞,即躯干神经嵴干细胞,可分化为组成周围神经系统的绝大部分神经元和胶质细胞,是周围神经系统的原基[2]。
躯干神经嵴干细胞的取材培养不仅可以研究细胞分化机制,也可为周围神经系统的再生和功能重建提供合适的细胞来源。
本实验从孕10.5d大鼠取材,应用神经管植块建立了躯干神经嵴干细胞的体外培养方法,并对其增殖、分化等生物学特性进行研究,从而为研究周围神经再生修复中供体细胞提供实验依据。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物 雌性Wistar大鼠,体质量250~ 280g,由山东大学实验动物中心提供,孕鼠的获得:按雌雄2 1数量比于晚10时合笼,次日晨7点查见阴栓者,定为受孕0.5d(embryonic day,E0.5d),获取E10.5d孕鼠。
1.1.2 实验试剂 DMEM F12、B27、I TS、E GF、bFGF 均购自GIB CO公司;胶原酶、纤维粘连蛋白(fi bronectin,FN)购自SI GMA公司;胎牛血清为Hyclone 公司产品;大鼠抗小鼠神经巢蛋白(nestin)单克隆抗体购自MILIPORE公司;抗低亲和力神经生长因子受体(lo w affinity nerve gro wth factor receptor,LNG FR)抗体p75购自Santa Cruz公司;兔抗人胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、小鼠抗 平滑肌肌动蛋白( smooth muscle actin, SMA)、兔抗微管相关蛋白(microtubule accociated protein2, MAP 2)单抗均为武汉博士德公司产品;FI TC标记抗兔IgG、TRI TC标记抗兔IgG、TRI TC标记抗小鼠IgG 均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。
1.2 实验方法1.2.1 躯干神经嵴干细胞的取材、培养 将孕鼠用水合氯醛(300g mL)麻醉,75%酒精消毒。
无菌条件下取出孕10.5d(E10.5d)大鼠胚胎,放入D Hank!s 液清洗。
取出胎鼠,在解剖镜下切取胎鼠躯干部神经管,即近尾侧端10个体节长的神经管。
37∀培养箱内用0.75mg mL胶原酶消化2min。
用冷的含10%胎牛血清的D MEM F12冲洗组织条以抑制胶原酶活性。
轻轻分离组织,至神经管清楚暴露及体节和脊索脱离。
将取材的神经管种植于预先用纤维粘连蛋白包被的培养皿内,在接种前用含血清的培养液漂洗培养皿。
放入培养箱中使组织块贴壁30min。
然后,加入5mL含血清培养基。
继续培养2d后,在倒置显微镜下,从培养皿中挑去神经管植块,留下细胞。
在37∀条件下,0.125%胰蛋白酶溶液消化培养皿中的细胞3min。
用含10%胎牛血清的D ME M F12终止胰酶的活性。
吹打后,1000r min 离心5min。
用1mL无血清培养液将细胞沉淀重新悬浮,种植于培养板中,常规培养。
1.2.2 躯干神经嵴干细胞的鉴定 将原代培养的细胞接种到24孔板中,孔中预先置入用多聚赖氨酸包被的盖玻片。
加少量含血清的培养液,约3h 后神经嵴干细胞贴壁即进行p75和nestin免疫细胞化学双重染色。
1.2.3 躯干神经嵴干细胞的分化 将传代培养2d 的细胞接种到24孔板中,孔内预先置入用0.01%多聚赖氨酸包被的盖玻片。
加少量含10%血清的D ME M F12(1 1)培养基,次日进行MAP 2、GFAP、 SMA细胞免疫化学染色,观察神经嵴干细胞分化。
1.2.4 细胞免疫化学检测 分别对原代培养的细胞及传代后以含血清培养基培养的细胞进行染色。
染色步骤如下:取出待染细胞的盖玻片,PBS漂洗3次,每次5min,4%多聚甲醛室温固定30min,PBS洗3次,0.5%Triton X 100孵育15min,PB S洗3次,每次3min,正常马血清封闭非特异性反应,不洗,一抗分别为抗nestin IgG(1 200)、抗p75IgG(1 30)、抗GFAP IgG(1 500)、抗MAP 2IgG(1:200)、抗 SMA IgG(1:200)。
4∀过夜,次日加入标记有TRI TC荧光素或FI TC荧光素的二抗(1 200),37∀孵育2h,PBS 震荡冲洗3次,每次5min,除去PB S,甘油-碳酸盐缓冲液封片。
阴性对照用PBS代替一抗。
荧光显微镜观察。
1.2.5 神经嵴干细胞克隆形成分析 根据Andrea Trentin的神经嵴干细胞克隆培养方法[3],将原代培养的细胞以低密度(20~50个细胞 35mm培养皿)种植于培养皿中,加入无血清培养液。
在倒置显微镜下选定单个细胞,在培养皿底画圈标记,在圈内的细胞将是由同一个神经嵴干细胞形成的克隆培养。
每2天换液1次。
将3d和5d后所形成的克隆再次消化分散培养。
方法同上述。