神经干细胞的培养鉴定及分化
成年大鼠毛囊神经嵴干细胞的培养、鉴定及初步诱导分化
到 阳性 细 胞 。 ３ 讨 论
１２ 毛 囊 Ｎ Ｓ ． Ｃ Ｃ的 鉴定一ｐ ５ Ｎｅｔ ７ 、 ｓｉ 疫 荧光 细胞 化 学 ｎ免
Ｆ ２１： ， Ｎ２ ２ Ｂ ７ ２ ｇ ｍｌ ＧＦ，０ｎ ／ Ｆ １ １ １ ， ２ ，０ｎ ／ Ｅ ２ ｇ ｍｌ — ｂ
免疫荧光 细胞化 学 染 色结 果 显示 毛囊 ＮＣ Ｃ呈 ｐ ５ Ｓ ７ （ 神经嵴干细胞标 志物） 免疫荧光染 色 阳性 （ 图 Ｅ） 毛囊 附 ， 隆突部及 游出细胞 均呈 Ｎｅｔ （ 经 干细胞 标志 物 ） ｓｉ 神 ｎ 阳性
（ 图Ｆ 。 附 ）
２３ 诱 导 分 化 结 果 及 鉴 定 ．
ＧＦ ，７ 、５ Ｃ ２ ５ Ｏ２ ） ３ ℃ ９ Ｏ ／ 静置培 养 。６ｄ后剔 除 毛囊 ，
０ ２ 胰酶消化传代培养 ， ．５ 培养 液 同前 ， 每隔 ２ｄ换 一半
培养液 。
传代 细 胞 经 １ Ｆ Ｓ诱 导 １ 后 可 检 测 到 少 量 Ｏ Ｂ ４ｄ
２ １ 原代和传代培养的细胞观察 ．
毛囊 隆突贴块 培养 ２ｄ 后可见 Ｏ １ 个 细胞从 隆突部 ～ ５ 爬 出 ， ３ｄ后约 １ ０个 细胞 ， ２ ４ｄ后 细 胞 明显 增多 ， ６ｄ后 细 胞进一步增 多 ， 可增 至 成百 上 千个 。随着 游 出 细胞 的 增 多， 毛囊 隆突部逐渐缩小 （ 附图 Ａ，Ｂ ， ） 细胞 以隆突部 为 中 心向外周伸 展 ， 刚从 隆突 部 游 出或 刚分 裂 出 的细 胞为 圆 形， 很快便伸 出突起 呈梭形 或三 角形 ， 镜下 观察 常可见 细 胞的分裂象 ， 哑铃形 或形 状变 长 即将成 为哑 铃形 （ 图 呈 附 Ｃ 。传代培养的 细胞周 边光晕 较强 ， 胞形 态更 为多 样 ， ） 细 以椭 圆形和三角形 居 多 ， 也有梭 形 和多 角形 的 ， 常可 见细 胞 的分裂象 （ 附图 Ｄ 。 ）
神经干细胞的增殖与分化对缺血性脑卒中的作用及中医理论探讨
神经干细胞的增殖和分化对缺血性脑卒中的作用及中医理论探讨缺血性脑卒中和神经干细胞介绍缺血性脑卒中是一种常见而危险的疾病，主要是由于大脑血液供应不足而引起的神经细胞死亡。
这个过程伴随着局部神经细胞损伤，导致失能和死亡，甚至导致瘫痪和死亡。
而神经干细胞是体内可以不断自我更新和再生的细胞，用于维持中枢神经系统正常的发育、生长和维护。
而神经干细胞也是一种研究广泛的细胞类型，可应用于治疗和预防各种神经系统疾病，例如缺血性脑卒中。
神经干细胞在缺血性脑卒中治疗中的作用神经干细胞在缺血性脑卒中治疗中的作用是通过增殖和分化来修复受损神经组织。
研究表明，神经干细胞可以迁移至受损的神经组织，并分化成成熟的神经元和神经胶质细胞，从而促进神经组织的修复。
此外，神经干细胞可以释放多种神经营养因子，有助于刺激神经细胞的再生、修复和保护。
中医理论对神经干细胞的研究中医在神经干细胞研究上提供了有价值的理论和方案。
中医认为，缺血性脑卒中的病因与脾虚失运，肝风内动，痰浊阻滞有关。
而通过中药治疗多能通过激活体内自身的神经干细胞，在适当的时机和方式下刺激神经干细胞增殖，从而促进神经组织的修复和再生。
中医中也有一些神经营养方剂，如人参、黄芪、龟板、鹿茸等，具有明显的神经营养作用，可提高神经干细胞生长的活性和神经元分化的潜力。
中药对神经干细胞增殖和分化的作用中药在神经干细胞治疗中具有多种作用，如增强神经干细胞增殖和促进神经元分化、刺激神经干细胞生成和增殖、降低神经细胞凋亡和止血，提高神经干细胞生存率，加速神经细胞分化成熟速度等。
中药的这些作用对缺血性脑卒中患者的神经组织恢复和修复具有非常显著的效果。
中医药对缺血性脑卒中临床应用的探讨中医药在缺血性脑卒中临床应用上已经得到广泛的认可和应用。
从预防、治疗、康复和疾病管理等多个方面，中医药均为缺血性脑卒中的患者提供了全面的管理和治疗方案。
中医药中也有多个针对缺血性脑卒中的具体方剂，如保心茶、丹中心从、复脉口服液等，都取得了显著的临床疗效。
大鼠胎脑神经干细胞的培养分化及鉴定的实验研究
胚胎神经干细胞 的体外培养体 系， ５ 的胎牛血清诱 导神经 干细胞分 化 ， 免疫荧 光染色技 术进行 对神经 用 ％ 用 千 细胞及诱 导分化 细胞 的鉴定 。结果 原代培 养 的神 经干细 胞折光性 强 ， 养第 ２ 培 ｄ开始 形成 细胞集 落 ， 第 ３ 形 成大的神经球。３～ ｄ ５代传代 的细胞 生长稳定 。经胎 牛血清诱导后第 ３ ｄ开始 ， 神经球开始 向周边发 出突 起， 悬浮 的细胞开始贴壁生长 。原代及传代培养的神经球表达 Ｎ ｓｎ阳性 ， 化细胞分别 表达 Ｎ Ｅ Ｇ Ａ ｅｔ ｉ 分 Ｓ 、 Ｆ Ｐ和 Ｇ Ｌ Ａ Ｃ阳性。结论 应用无血清培养技术可在体外培养 、 扩增 出神经 干细胞 。５ ％的胎牛血清可以诱 导神经干
Ｅｘｐ ｒｍ ｅ ａ ｔ ｄｙ ｏ ｕｌｉ ａ ｉｎ ， ｄ ｆｅ ｅ ｉ ｔｏ ｎｄ ｉ ｎｔｆｃ ｔｏ ｎ ｆ ｔ ｌｒ ｔ ｅ ｒ ｌ ｅ ｉ ｎｔ ｌｓ ｕ ｆ ｃ ｔｖ ｔｏ ｉｆ ｒ ｎｔａ ｉ ｎ ａ ｄｅ ｉ ａ ｉ ｎ ｉ ｅ ａ ａ ｓ ｎ ｕ ａ ｉ
ｓ ｍ ｅ ｓ Ｉ ｉｎｘ Ｗ ＮＧＸ ａ ｎ ， Ｈ Ｎ ｏｇｊｎ ｅ ａ． ｅａｔ ｅｔｆＮ ｕｏｕｇ ｒ ， ｅ ｔ ｃｌ ＵＪａ —ｉ Ａ ｉｏ ｇ Ｚ Ａ ＧＲ ｎ － ， ｔ １Ｄ ｐ ｒ ｎ ｅｒ ｒｅ ｔ ｅ ｌＬ ｎ， ｕ ｍ ｏ ｓ ｙｈ
豫 Ｈ ｓｉ ｌ Ｐ ． ａｊ ７ １０ ． ｈｎ ｏ ｔ Ｂ ｏ ２ ０ ４ Ｃ ｉａ ｐａ ｏ ｆ ｉ
ｆｅ ｄ ｕ ， ５ ｒ ｅ ｍｅ ｉ ｍ ％
ｏ ｈｅ ｗｏ ｂ ｖｎ ｓ ｒ ｍ ｗａ ｕｓ ｄ ｏ ｄｆｅ ｅ ｔａｉｎ．Ｉ ｆ ｔ ｍｂ ｏ ｉｅ ｅ ｕ ｓ ｅ ｆ ｒ ｉ ｒ ｎ ｉｔｏ ｆ ｍｍｕ ｅ ｌｕ ｒ ｓ ｅ ｃ ｎ ｆ ｏ ｅ ｃ ｎ ｅ
神经干细胞体外培养技术
神经干细胞体外培养与鉴定一前言神经干细胞(Neural stem cells, NSC S)是神经系统内能产生神经元和胶质细胞的未分化原始细胞【1-2】。
文献报道，NSC具有无限增殖、自我更新和多向分化能力，在适宜的环境条件下，能分化形成各种靶组织细胞【3-5】。
此外，NSC 还可用作为是细胞移植治疗的有效载体，被广泛用于神经疾病细胞或载体治疗。
根据目前的研究结果，其主要作用包括下列三方面：①NSC分化成宿主细胞来替代丢失细胞的作用；②分泌多种细胞因子发挥生物学功能；③桥接作用【6-8】。
基于NSC的上述特性，从而奠定了NSC在细胞替代治疗中有广泛应用前景，而如何获取NSC则是科学研究和临床实践中首先面临的关键问题。
本实验拟建立绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）转基因小鼠NSCs原代和传代培养技术，为后面的实验提供方法支持。
二实验所需仪器、试剂及其配制（一）实验仪器光学显微镜（Olympus,Japan）倒置荧光显微镜（LEICA DMIRB）冰冻切片机（Leica CM1900，Germany）光明DZKW型电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器厂）XK96-A快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）HT-200 电子天平（成都普瑞逊电子有限公司川制）FA1004型精密电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)MP 8001单臂脑立体定位仪(深圳市瑞沃德科技有限公司)10μl微量进样器（Pressure-Lok，PRECISION SAMPLINGCORP，BATON ROUGE，LOUISIANA，Made in USA）0.5ml、1ml Eppendorff管（Ependorff）手术器械：眼科剪、解剖剪、显微剪、显微有齿镊及无齿镊、蚊式钳、刀柄刀片等。
（二）试剂1. DMEM/F12，Hank's液（Hyclone），N2（Gibico），bFGF（Invitrogen）。
神经干细胞的发育与功能研究
神经干细胞的发育与功能研究神经干细胞是一种能够自我复制并且能够分化为多种神经元类型的细胞。
目前，神经干细胞的发育和功能研究成为了神经科学领域的一个热点话题。
这篇文章将从神经干细胞的发育和功能两个方面来探讨这个话题。
一、神经干细胞的发育1. 神经干细胞的来源和定位神经干细胞的发育始于胚胎期间的神经板。
在这个时期，神经干细胞被固定在胚胎神经管的周围。
此后，神经管扩张，神经干细胞进一步分化为脑室周围的不同类型的神经元。
在成年人的脑部，神经干细胞主要存在于神经干细胞区域（subventricular zone, SVZ）和海马区（hippocampal region）。
2. 神经干细胞的分化神经干细胞能够分化为多种细胞类型，包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
神经元是最有研究价值的细胞类型。
神经元的形成需要多种转录因子和成长因子的参与。
神经干细胞通常经历神经前体细胞的阶段，这个阶段中细胞的发育被调控并受到调控因子的影响。
此外，神经干细胞还可以通过紧密衔接的细胞间通讯，从周围神经元和胶质细胞中获取分化所需的环境因素。
3. 神经干细胞自我更新神经干细胞的一个重要特点是自我更新，并且可以长时间不分化。
许多研究表明，自我更新的神经干细胞可以长期存在于成年人脑组织中，并且能够产生新的神经元和胶质细胞。
这些发现表明，神经干细胞在维持成年人脑功能上具有重要的作用。
二、神经干细胞的功能1. 神经干细胞的损伤修复作用近年来的研究表明，神经干细胞在损伤修复中扮演着重要的角色。
在脑部损伤的情况下，神经干细胞会集中在受损区域，并且开始分化为缺损的细胞类型。
这个过程被称为神经发生（neurogenesis）。
研究表明，神经发生可以为移植细胞、脑出血、脑部肿瘤、脊髓损伤和阿尔茨海默病等各种疾病的治疗提供新的治疗策略。
2. 神经干细胞的调节作用除了神经发生以外，神经干细胞还可以通过影响周围细胞的发育和功能来发挥调节作用。
例如，神经干细胞可以通过分泌成长因子调节周围神经元的生长和形成。
胚胎大鼠神经干细胞的分离培养及鉴定研究
ｔ ｄ ｐ ｓｔｖ １ ｔ ｈ ｘ ｅ ｔｏ ｎ ｌｍ ｍａ ｉ ｎ Ｔｈ ｏ ｅ ｓ ｖ ｒ ｅ ｒ ａ ｌ ｒ ， ｈ ｒ ｉ ｈ ｒｔ ｅ １ｖ ｌｏ ｅ ｏ ｉｉ ｅｙ ｗｉ ｔ ｅ ｅ ｔ ｎ ｆｉ ｆａ ｈ ｔ ． ｅ ｍ ｒ ｅ ｅ ｅ ｈ ａ ｔ ｆ ｉ ｅ ｔ ｅ ｍｏ ｅ ｈ ｇ ｅ ｈ ｅ ｅ ｆ ｏ ｕ
孔 令 胜 张 军 臣 张 冉 赵 万 巨 邵 彤 杨 全 祥
（ 宁 医 学 院 附属 医院 ） 济
提 法
要 目的 建 立胎 鼠神经 干细胞体 外培 养方 法并 鉴定神 经 干 细胞 ， 观察神 经干 细胞 生 长特 点。方
采 用含碱性 成 纤维细胞 生长 因子和表 皮生长 因子 的无血 清培养基 对 大鼠胚 胎 间脑组 织细胞 悬液进 行培 分 离培 养 出了大量具 有不 断增殖 的能力 、 达神 经巢蛋 白的神 经干 细胞 ， 能经过诱 导分化 为神 经元 和神 表 并
探 索神 经系统疾 病新 的治疗方 法 。我们 采用无 血清 培养 、 细胞克 隆技术 及 免 疫 细胞 化 学分 离 并 鉴定 单 神经干 细胞 ， 为进 一步研究 Ｃ ＮＳ疾病 的发病 机制和 治疗手段 提供理 论和物 质基础 。
１ 材 料 与 方 法
实验 动物 ： 孕 １ ｄ的 Ｓ ｒｇ ｅＤ ｗ ｅ （ Ｄ） 受 ４ ｐ ａ ｕ ａ ｌｙ Ｓ 胚 胎大 鼠由我校实 验动物 中心提 供 。 主 要 试 剂 ： ＭＥ Ｆ ２（ ： ）培 养 基 （ — Ｄ Ｍ／ ｔ １ １ Ｈｙ
第 ３ ｚ卷第 ２期
Ｖｏ ． ２， ． Ｉ ３ Ｎｏ ２
济 宁 医 学 院 学 报
Ｊ ＯＵＲＮＡＬ ０Ｆ ＪＮＩ ＤＩ Ｉ ＮＧ ＭＥ ＣＡＬ Ｃ Ｌ Ｇ ０Ｌ Ｅ Ｅ
神经干细胞的分化和应用
神经干细胞的分化和应用神经干细胞是一类能够自我更新并且有分化为神经元和神经胶质细胞的细胞。
这种细胞在神经系统的发育、维持和再生中发挥着极其重要的作用。
本文将介绍神经干细胞的分化和应用。
一、神经干细胞的分化神经干细胞的分化可以分为两个方向：一个是向神经元分化，另一个是向神经胶质细胞分化。
1.1 神经干细胞向神经元分化的过程在神经干细胞向神经元分化的过程中，细胞首先经历原始神经前体细胞（NPP）的分化过程，然后再定向分化为特定类型的神经元。
这个过程的关键在于NPP的分化和神经元的定向分化。
NPP的分化是由于某些基因的特异转录，而这个过程需要与其他转录因子和细胞外基质相互作用。
神经元的定向分化则需要受到合适的环境刺激，并且有合适的细胞因子和信号通路参与。
1.2 神经干细胞向神经胶质细胞分化的过程神经干细胞向神经胶质细胞分化的过程可能比向神经元分化的过程更为复杂。
这是因为神经胶质细胞种类繁多，包括了星形胶质细胞、少突胶质细胞、大星形胶质细胞、微胶质细胞等多种类型，每种类型的细胞都有不同的功能和形态特征。
神经干细胞向神经胶质细胞分化的调节机制仍然需要进一步研究。
但是，一些研究表明神经干细胞的分化受到细胞因子和转录因子的调节，同样需要合适的环境刺激和信号通路。
二、神经干细胞的应用神经干细胞可以应用于多种疾病的治疗，例如：2.1 神经退行性疾病的治疗神经干细胞可以通过移植的方式为神经系统提供新的神经元和胶质细胞，帮助受损的神经系统或者退化的神经元恢复功能。
这项治疗方法已经在多个疾病中得到了应用，例如帕金森病、阿尔茨海默病等。
2.2 脊髓损伤的治疗神经干细胞可以应用于脊髓损伤的治疗。
在脊髓受损后，神经干细胞可以通过重塑脊髓的神经回路，促进感觉和运动细胞联结的再生。
2.3 眼科疾病的治疗神经干细胞移植可以促进视网膜和玻璃体的再生和修复，并提高视力。
这种治疗方法可以应用于多种视网膜疾病，例如压迫性视神经病变、黄斑变性等。
神经干细胞的分化及其机制研究
神经干细胞的分化及其机制研究神经干细胞是一类能够进行自我更新和分化成神经系统各种细胞的多功能细胞。
作为中枢神经系统中最重要的细胞组成部分，神经干细胞在许多神经系统疾病的治疗和维护神经系统正常功能方面具有广阔的应用前景。
而神经干细胞分化和调控机制的研究则是神经干细胞应用所必需的。
一、神经干细胞的特征与来源神经干细胞具有自我更新和可分化成其它类型细胞的多功能。
在分化过程中，神经干细胞可以分化成神经元、神经胶质细胞和少数的间基质细胞。
神经干细胞来源有多种途径，包括内源性神经干细胞和外源性成体细胞重新编程诱导的神经干细胞。
内源性神经干细胞分为胚胎神经干细胞和成体神经干细胞。
胚胎神经干细胞存在于胚胎神经系统中，可自我更新并具有多向分化潜能。
但它们繁殖迅速，不够稳定，因此在临床应用方面存在限制。
成体神经干细胞分布于成人神经系统组织中，主要存在于脑室周围、海马和嗅球等部位，并能长期自我更新和分化。
因此，成体神经干细胞在临床前和临床研究中受到广泛关注。
二、神经干细胞的分化机制神经干细胞的分化是一个复杂的过程，受许多内外因素的共同影响。
其中，转录因子和细胞外丝裂素等对神经干细胞分化发挥重要作用。
转录因子包括NeuroD、Ngn、bHLH、Nkx等，它们同步调节神经干细胞的分化为神经元、神经胶质细胞等。
还有Wnt、Notch、BMP、Shh等细胞外丝裂素也是调控神经干细胞分化的关键因素。
例如，Wnt家族中的Wnt3a、Wnt7a等可以促进神经干细胞分化为神经元，而BMP-2、BMP-4等则能够促进神经干细胞分化为胶质细胞。
同时，Notch信号通路在神经系统发育中起重要作用。
在神经干细胞分化为神经元时，Ngn蛋白通过调节Notch信号的激活，有助于促进神经元的分化。
除此之外，环境因素如细胞外基质、细胞因子等也都可以影响神经干细胞的分化。
环境因素对神经干细胞分化具有重要的生理学意义，在神经干细胞的体内体外放大和应用过程中也需要考虑环境因素的影响。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
朱琼，女，1990年生，重庆市人，汉族，2009年第三军医大学毕业，在读硕士，主要从事神经干细胞治疗阿尔茨海默病的作用及机制研究。
通讯作者：徐亚丽，博士，副主任医师，副教授，解放军第三军医大学第二附属医院超声科，重庆市 400037Zhu Qiong, Studying for master’s degree,Department of Ultrasound, Second Affiliate Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 400037, ChinaCorresponding author: Xu Ya-li, ., Associate chief physician, Department of Ultrasound, SecondAffiliate Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 400037, China神经干细胞的培养鉴定及分化朱 琼1，皋月娟2，高顺记1，陈 重1，刘 政1，徐亚丽1(1解放军第三军医大学第二附属医院超声科，重庆市 400037；2解放军第三○二医院超声科，北京市 100039)引用本文：朱琼，皋月娟，高顺记，陈重，刘政，徐亚丽. 神经干细胞的培养鉴定及分化[J].中国组织工程研究，2017，21(17):2708-2713.DOI: ORCID: 0000-0002-1810-5009(朱琼) 文章快速阅读：不仅能分化为多种类型的神经细胞替代缺失神经组织，同时能产生多种细胞因子，如脑源性神经营养因子、神经生长因子及胶质源性神经营养因子等，并促进突触发生，调节其可塑性，且能重建部分环路和功能，是神经元替代治疗的理想靶细胞。
细胞分化：指同一来源的细胞逐渐由全能到多能，最后到单能，从而产生形态功能不同的细胞群的过程，其本质是基因组在时间和空间上的选择性表达。
如神经干细胞能分化为多种类型神经细胞：星形胶质细胞、小胶质细胞及神经元。
同时该过程受局部微环境调节，多种理化因素都能诱导全能细胞产生分化，如血清诱导神经干细胞分化。
摘要背景：神经干细胞在神经损伤修复和退行性疾病中有广泛的应用前景，体外培养鉴定及促神经元诱导分化是后续研究的基础。
目的：采用悬浮神经球培养法分离培养神经干细胞并对其鉴定，了解生物学特性。
方法：采用悬浮神经球培养法从C57BL/6胎鼠大脑半球分离培养神经干细胞，观察形态特征及超微结构，CCK-8法绘制生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期，免疫荧光法检测特异性标志蛋白Nestin 的表达；用体积分数为1%和10%的血清诱导分化后，免疫荧光法检测GFAP 、βⅢ-tubulin 和MBP 的表达。
结果与结论：①体外培养得到悬浮生长的神经球，生长曲线和细胞周期表明细胞增殖力强；②透射电镜观察到神经干细胞核浆比高，呈未分化状态；③Nestin 免疫荧光阳性；④不同体积分数的血清诱导后均可分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞，体积分数为1%血清能诱导分化得到更多的神经元细胞；⑤结果表明，采用悬浮神经球培养法成功分离培养得到了神经干细胞，低体积分数血清有利于神经干细胞向神经元分化。
关键词：干细胞；分化；神经干细胞；培养；鉴定；血清；诱导分化；国家自然科学基金 主题词：神经干细胞；细胞, 培养的；血清；细胞分化；组织工程 基金资助：Cultivation, identification and differentiation of neural stem cellsZhu Qiong 1, Hao Yue-juan 2, Gao Shun-ji 1, Chen Zhong 1, Liu Zheng 1, Xu Ya-li 1 (1Department of Ultrasound, SecondAffiliate Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 400037, China; 2Department of Ultrasound,the 302ndHospital of PLA, Beijing 100039, China)AbstractBACKGROUND: Neural stem cell transplantation is an emerging therapeutic option in the recovery of neural lesions and neurodegenerative diseases. Neural stem cell culture and differentiation lay a foundation for the further study.OBJECTIVE: To improve the techniques for the isolation, cultivation, differentiation and identification of neuralstem cells, and to explore the biological characteristics of cells.METHODS: The neural stem cells from C57BL/6 fetal rats were isolated and cultured in vitro using neurophere culture method followed by morphological and ultrastucture examination. The growth curve and cell cycle of passage 3 cells were drawn and analyzed. Nestin expression was tested by immunofluorescence. Neural stem cells induced in 1% and 10% fetal bovine serum were identified using anti-GFAP, anti-βIII -tubulin and anti-MBP by immunofluorescence.RESULTS AND CONCLUSION: The neurospheres exhibited strong cell proliferation ability. Under transmission electron microscope, there was a high nuclear/cytoplasmic ratio in the neural stem cells, indicating a low differentiation degree. Immunofluorescence analysis revealed that neural stem cells were positive for Nestin.The induced cells were positive for GFAP, βIII-tubulin, and MBP, indicating these cells were induced to differentiate into astrocytes, neurons and oligodendrocytes, and there were more neurons in 1% fetal bovine serum than those in 10% fetal bovine serum. In conclusion, we could successfully isolate neural stem cells in C57BL/6 mice, and low concentration of fetal bovine serum contributes to more neurons differentiated from neural stem cells.Subject headings: Neural Stem Cells; Cells, Cultured; Serum; Cell Differentiation; Tissue Engineering Funding: the National Natural Science Foundation of ChinaCite this article: Zhu Q, Hao YJ, Gao SJ, Chen Z, Liu Z, Xu YL.Cultivation, identification and differentiation of neural stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(17):2708-2713.0 引言 Introduction神经干细胞是神经系统内具有自我复制更新和多向分化潜能的细胞[1-2]。
许多神经系统疾病都与神经干细胞数量及功能紊乱有关[3]，因此神经干细胞在神经损伤修复和退行性疾病中有广泛的应用前景[4-6]，如肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默症、脑卒中等[7-9]。
神经干细胞散在分布于成年哺乳动物的大脑内，主要是海马齿状回颗粒下层和侧脑室的室管膜下区[10]，且具有自我更新能力，能分化为胶质细胞和神经元[11-12]，同时体内的神经干细胞具有向损伤区迁移的能力，但迁移数量和再生能力有限[13-14]，所以神经干细胞的体外扩增培养、移植及定向分化是目前研究的热点。
研究表明，将人源性的神经干细胞移植到大鼠体内，能有效改善认知功能，为神经退行性疾病提供了新的治疗方法[15]。
实验采用悬浮神经球培养法分离培养孕12-14 d C57BL/6胎鼠大脑半球神经干细胞，观察神经干细胞的形态及生物学特征，并采用不同浓度血清诱导神经干细胞分化，为应用细胞移植治疗神经系统疾病提供理论依据。
1 材料和方法 Materials and methods设计细胞观察性实验。
时间及地点于2015年6至12月在第三军医大学第二附属医院中心实验室完成。
材料1.3.1 实验动物孕12-14 d C57BL/6小鼠，体质量25- 35 g，由第三军医大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK(渝)2005-0007。
实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。
1.3.2 主要试剂和仪器 DMEM/F12、B27、Accutase、胎牛血清(Gibco公司)；表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子(Peprotech公司)；Anti-Nestin、Anti-Myelin Basic Protein(Millipore公司)；Anti-GFAP(Santa公司)；Anti-βⅢ-tubulin(Abcam公司)；二抗(中杉金桥)；流式细胞周期试剂盒(碧云天)。