凝胶层析法分离蛋白质 HUI

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装柱注意事项： （1）装柱前加入1cm洗脱液，检查柱子 （2）凝胶装柱要一次完成。 （3）柱中的凝胶一定要浸没在洗脱液中。 （4）装凝胶的烧杯不能清洗。（看似脏的 东西都是凝胶）。
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三、加样与洗脱
先打开下口开关， 先打开下口开关，放出凝胶柱面上的溶 或吸取， 液（或吸取，但溶液面一定不能低于凝胶表 ），然后加样 本实验样品为： 然后加样。 面），然后加样。本实验样品为：血红蛋白 (2ml)和溴酚蓝 和溴酚蓝(1ml) 混匀，用移液管取 混匀， 和溴酚蓝 0.75ml滴加在液面下（不能冲起凝胶柱，也 滴加在液面下（ 滴加在液面下 不能冲起凝胶柱， 不能沿管壁流下），控制流速， ），控制流速 不能沿管壁流下），控制流速，使样品慢慢 渗入凝胶内，当样品液面接近柱面时， 渗入凝胶内，当样品液面接近柱面时，关闭 下口，完成上样。再加一层洗脱液（ ～ 下口，完成上样。再加一层洗脱液（3～ 5cm），连上洗脱装置，即可进行洗脱。 ），连上洗脱装置 ），连上洗脱装置，即可进行洗脱。 （注意调整洗脱装置使滴入洗脱液滴速率与 流出液滴速率一致。） 流出液滴速率一致。）
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二、装柱
A, 将层析柱垂直固定在铁架台上，关闭出口，向 将层析柱垂直固定在铁架台上，关闭出口， 柱内加入洗脱液约1cm 1cm高 若不漏则证明柱完好。 柱内加入洗脱液约1cm高，若不漏则证明柱完好。 B,将溶胀好的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面的水 将溶胀好的凝胶放在烧杯中， 将溶胀好的凝胶放在烧杯中 层与凝胶体积相等；用玻璃棒搅匀凝胶液， 层与凝胶体积相等；用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻 璃棒灌入柱内，此时柱下口一边排水， 璃棒灌入柱内，此时柱下口一边排水，上口一边 加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降， 加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐 步形成凝胶柱； 步形成凝胶柱； C,当到达所需凝胶高度时，立即关闭下口，使凝 当到达所需凝胶高度时， 当到达所需凝胶高度时 立即关闭下口， 胶完全沉降； 胶完全沉降； D,凝胶柱上始终覆盖一层溶液，凝胶柱用洗脱液 凝胶柱上始终覆盖一层溶液， 凝胶柱上始终覆盖一层溶液 流过
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四、收集
用试管收集洗脱液。 用试管收集洗脱液。
五、凝胶柱的
回收 处理
凝胶用过后，反复用蒸馏水通过柱 凝胶用过后， 倍床体积） （2~3倍床体积）即可。 倍床体积 即可。 注意：需回收！！！ 注意：需回收！！！
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注意事项
始终保持柱内液面高于凝胶表面， 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则 水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干， 水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干， 使凝胶混入大量气泡， 使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流 导致分离效果变差。 凝胶的处理
Sephadex G-25干粉置于蒸馏水中室 干粉置于蒸馏水中室 干粉 温下溶胀3h，沸水浴加热1h， 温下溶胀 ，沸水浴加热 ，再用蒸馏水 洗涤几次， 洗涤几次，将不易沉降的细小颗粒随水倾 以免在装柱后产生阻塞现象， 倒（以免在装柱后产生阻塞现象，降低流 ）。洗涤后将凝胶浸泡在洗脱液中待用 洗涤后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。 速）。洗涤后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。
凝胶层析法分离血红蛋白 和溴酚蓝
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【 目的 】
掌握凝胶层析的基本原理 学习利用凝胶层析法分离生物大分子和小分子 的实验技能
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【 原理 】 凝胶层析也称凝胶过滤、分子筛层析、 凝胶层析也称凝胶过滤、分子筛层析、 也称凝胶过滤 排阻层析, 排阻层析,是利用具有网状结构的凝胶的分 子筛作用，根据被分离物质的分子大小的不 子筛作用，根据被分离物质的分子大小的不 来进行分离的技术。 同来进行分离的技术。
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思考题
一、为什么溴酚蓝能与血红蛋白在层析柱中能 够很好的分开？ 二、生化实验中常用的凝胶有哪些？各有何特 征？
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单个凝胶珠本身象 “筛子”。不同类型凝 筛子” 胶的筛孔的大小不同。 胶的筛孔的大小不同。
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带网孔的 葡聚糖珠 小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶层析过程示意图
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凝胶 珠
凝胶基质
小分子 大分子
凝胶层析过程示意图
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总结： 总结：
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排 相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排 的物质由于直径大于凝胶网孔 阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程 在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动， 较短，移动速度快；所以首先流出。 较短，移动速度快；所以首先流出。 首先流出 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔， 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全 的物质由于直径小于凝胶网孔 渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因为流程 渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中， 进入凝胶颗粒的网孔 较长，移动速率慢；所以最后流出。 较长，移动速率慢；所以最后流出。 最后流出 中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透， 中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的 部分渗透 程度取决于它们分子的大小， 程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二 者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。 者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。 分子大的组分先流出 这样样品经过凝胶层析后， 这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的 顺序依次流出，从而达到了分离的目的。 顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
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【 实验器材 】 层析柱 洗脱装置 试管等普通玻璃器皿
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【 实验试剂 】
待分离样品： 。鸡血红蛋白：取新鲜抗凝全血5ml， 待分离样品：1。鸡血红蛋白：取新鲜抗凝全血 ， 离心10min，弃血浆，用三倍于血球体积的 于2000r/min离心 离心 ，弃血浆， 0.9﹪Nacl溶液洗血球（颠倒混匀）。离心弃去上清液， ﹪ 溶液洗血球（ ）。离心弃去上清液 溶液洗血球 颠倒混匀）。离心弃去上清液， 重复1～ 次 至上清液清亮为止。于血球中加入10倍体 重复 ～2次，至上清液清亮为止。于血球中加入 倍体 积的蒸馏水，混匀，使血球破碎，过滤， 积的蒸馏水，混匀，使血球破碎，过滤，即得血红蛋白 溶液。 。 溶液。2。 1mg/ml溴酚蓝溶液 溴酚蓝溶液 葡聚糖凝胶 Sephadex G-25 洗脱液： 洗脱液：0.2mol/L NaCl缓冲液 缓冲液