实验十八 血清胆红素测定
血清总胆红素测定
【思考题】 结合胆红素/总胆红素的比值测定意义？
实验原理重氮试剂1血清中结合胆红素偶氮胆红素2非结合胆红素咖啡因苯甲酸钠醋酸钠加速剂重氮试剂分子内部氢键遭到破坏偶氮胆红素紫红色在540nm波长进行比色实验原理试剂与器材校准液
血清总胆红素测定
浙江中医药大学 生命科学学院 生物化学教研室
【实验目的】
掌握：试剂盒测定血清总胆红素的基本原理 熟悉：试剂盒测定血清总胆红素的操作过程
4、叠氮钠能破坏重氮试剂，终止偶氮反应。不宜采用叠氮 钠作防腐剂中的质控血清。
5、标本对照管的吸光度一般很接近，若遇标本量很少时可 不做标本对照管，可参照其他标本对照管的吸光度。
6、每次加完试剂都应充分混均，给予适宜的温度、时间使 其反应。
7、在使用分光光度计测吸光度前，应使其事先预热，以免 影响所测结果。
【实验原理】
血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反 应，产生偶氮胆红素。非结合胆红素在 催速剂咖啡因等的作用下，其分子内部 氢键遭到破坏后才与重氮试剂反应也产 生偶氮胆红素，即在酸性介质中生成偶 氮色素。
【实验原理】
重氮试剂
1)血清中结合胆红素
偶氮胆红素
2)非结合胆红素+咖啡因-苯甲酸钠-醋酸钠 （加速剂） 重氮试剂
分子内部氢键遭到破坏
偶氮胆红素(紫红色) 在540nm波长进行比色
【试剂与器材】
1. 血清总胆红素测定试剂盒 工作试剂R1：盐酸120mmol/L；咖啡因2.1mmol/L
2，5-二氯苯重氮四氟硼酸盐0.31mmol/L；
校准液：TBil（总胆红素）：68 umol/L，
DBil（结合胆红素）：15 umol/L
血清总胆红素=
× 校准物浓度
血清直接胆红素测定实验设计
血清直接胆红素的测定病人准备：要求病人处于安静状态，生活状态处于日常状态，避免过度空腹、饮食、饮酒吸烟标本采集，处理，保存和要求：收集无溶血，无黄疸，无脂浊的新鲜血清或肝素血清，避光保存。
混合，必要时可用过滤器过滤。
实验原理：血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，生成偶氮胆红素。
醋酸钠缓冲液保持反应的pH，反应完全后加入终止试剂（叠氮钠）以破坏重氮试剂，最后加入碱性酒石酸钠溶液，使颜色不稳定的紫红色偶氮胆红素在咖啡因存在下转化为稳定的黄色偶氮胆红素，在600nm波长比色，从标准曲线找直接胆红素含量。
实验仪器设备及试剂：咖啡因试剂碱性酒石酸钠溶液5g/L亚硝酸钠溶液5g/L 对氨基苯磺酸溶液5g/L叠氮钠溶液胆红素标准溶液加样枪分光光度计（或半自动生化仪）实验操作：一。
取两支试管，按表1操作表1 改良J—G发测定血清直接胆红素操作表加入物 (ml) 直接胆红素空白管血清0.2 0.2咖啡因苯甲酸钠试剂— 1.6对甲基苯磺酸—0.4重氮试剂0.4 —混匀，准确1分钟重氮钠0.05 —咖啡因甲苯酸钠试剂 1.55 —室温10分钟碱性酒石酸钠 1.2 1.2混匀，600nm波长比色，以空白管调0，读取各管吸光度。
从标准曲线上查出直接胆红素浓度。
二．标准曲线的制作表2 胆红素标准曲线的制作表加入物 (ml) 对照管 1 2 3 4 5胆红素标准贮存液— 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0稀释血清 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 —相当于胆红素浓度 0 34.2 68.4 103 137 171（u mol/L)混匀（不可产生气泡),按直接胆红素的测定方法操作。
每一浓度做2个平行管，用对照管调零，读取各管吸光度，以各管吸光度的均值为纵坐标，以相应胆红素浓度为横坐标，绘制标准曲线。
参考范围：血清结合胆红素0~6.8umol/L(0~0.4mg/dl）注意事项：1.本法在10 —37℃范围内测定，不受温度变化的影响，两小时内显色非常稳定且灵敏度高，轻度溶血对本法无影响。
胆红素测定的实验报告
一、实验目的1. 了解胆红素测定的原理和方法。
2. 掌握胆红素测定仪器的操作技能。
3. 通过实验，掌握胆红素测定的方法，并对胆红素含量进行定量分析。
二、实验原理胆红素是一种黄色的生物色素，是血红蛋白在体内代谢的产物。
胆红素在血液中含量过高会导致黄疸。
本实验采用紫外-可见分光光度法测定胆红素含量。
该方法基于胆红素在特定波长下有最大吸收的特性，通过测定其吸光度，计算胆红素含量。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：紫外-可见分光光度计、恒温水浴锅、移液器、容量瓶、试管等。
2. 试剂：胆红素标准溶液、盐酸、硫酸铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水乙醇等。
四、实验步骤1. 准备工作（1）将胆红素标准溶液稀释至一定浓度，制成标准系列。
（2）将待测样品用无水乙醇提取胆红素。
（3）用移液器准确移取一定量的胆红素标准溶液和待测样品，分别加入试管中。
（4）向试管中加入适量的盐酸和硫酸铵，混匀。
（5）将试管置于恒温水浴锅中，加热至60℃，保温10分钟。
（6）取出试管，冷却至室温。
2. 吸光度测定（1）打开紫外-可见分光光度计，设定波长为510nm。
（2）将胆红素标准溶液和待测样品分别放入比色皿中。
（3）依次测定胆红素标准溶液和待测样品的吸光度。
3. 数据处理（1）以胆红素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（2）根据待测样品的吸光度，从标准曲线上查得相应的胆红素浓度。
（3）计算待测样品中胆红素含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制根据实验数据，绘制胆红素标准曲线，其线性方程为：y = 0.0036x + 0.0152，相关系数R² = 0.9987。
2. 待测样品胆红素含量测定根据待测样品的吸光度，从标准曲线上查得相应的胆红素浓度为0.8 mg/L。
3. 结果分析本实验通过紫外-可见分光光度法测定了待测样品中的胆红素含量，结果显示待测样品中胆红素含量为0.8 mg/L。
该结果与实际值较为接近，表明实验方法准确可靠。
血清总胆红素测定原理
血清总胆红素测定原理
血清总胆红素测定是一种常用的临床实验室检查方法，主要用于评估肝脏功能和诊断与胆红素代谢相关的疾病。
其原理基于血清中的胆红素可以与二硫苏糖酸钠反应生成带有特征性颜色的离子化合物。
具体实验步骤如下：首先，将样本血清与二硫苏糖酸钠溶液混合，通过化学反应使胆红素与二硫苏糖酸钠结合。
然后，使用比色法通过测量生成离子化合物的颜色强度来确定血清中的胆红素浓度。
常用的检测方法包括分光光度法、比色滴定法和高效液相色谱法等。
在测定中，胆红素与二硫苏糖酸钠发生反应，形成红色或紫色的离子化合物。
生成的离子化合物的颜色强度与样本中的胆红素浓度呈正相关关系。
通过测量离子化合物的光吸收值，并通过与已知浓度的标准溶液比较，可以计算出样本中总胆红素的浓度。
总之，血清总胆红素测定原理是基于胆红素与二硫苏糖酸钠的化学反应，通过测定生成的带有特征性颜色的离子化合物的光吸收值来确定样本中的总胆红素浓度。
这种方法简便、快速，并且具有较高的准确性和灵敏度，在临床诊断中得到了广泛应用。
血清直接胆红素测定
血清立接胆红素测定1.实验原理在PH3左右、有表面活性剂和间接反应胆红素抑制剂的条件下，样品中的直接胆红素容易被矶酸盐氧化成胆绿素，而间接胆红素不能。
在450nm （胆红素吸收峰）处监测反应。
矶酸盐氧化前后吸光度的下降与样品中胆红素的浓度成正比。
由此可计算出样品中直接胆红素浓度。
2.标本：2.1病人准备：无特殊要求。
最好用禁食的标本以减少乳糜血的干扰。
2.2类型：血清、肝素或EDTA血浆，应避光保存。
3.标本存放：15〜25℃保存可稳定2天；2〜8℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定3个月，如冰冻保存，不可反复冻融！。
4.标本运输：常温条件下避光保存运输。
5.标本拒收标准：标本溶血、细菌污染、脂血、非避光保存运输的标本。
6.实验材料6.1试剂：上海欧泰克直接胆红素试剂盒6.L 1试剂组成酒石酸盐缓冲液100mmol/L表面活化剂I 适量磷酸盐缓冲液10 mmol/L矶酸钠盐 4 mmol/L6.1.2试剂准备：试剂为即用式。
6.1.3试剂稳定性与贮存：试剂避光保存于2〜8C,若无污染，可稳定至失效期。
试剂有效期为18个月。
试剂2必需避光保存。
试剂不可冰冻。
6.1.4变质指示：当试剂有浊度时，表明有细菌污染，不能继续使用。
6.1.5注意事项：此试剂为体外诊断用。
警告！腐蚀剂！不要入口。
避免和眼睛，皮肤或衣服接触。
如果接触到，立即用大量的水冲洗受损害的部位15分钟。
接触到眼睛或吞服，立即寻找医疗保护。
6.2校准品：使用罗氏复合校准品对自动分析仪进行校准，参见生化检验校准品和质控品.SOP文件6. 3质控品：参见生化检验校准品和质控品.SOP文件7.仪器：日立7060生化分析仪8.操作步骤8.1项目基本参数：参见生化检验日立7060生化分析仪项目测定参数.SOP文件8.2仪器操作步骤：参见生化检验日立7060生化分析仪操作规程.SOP文件检验结果的判断与分析10.质量控制：在每一批标本中都应把非定值血清水平I与H 质控做为未知标本进行分析，以2s为质控警告限，3s为失控限，绘制质控图，判断是否在控。
胆红素测定方法
胆红素测定方法胆红素是人体内一种重要的生化物质，它是红细胞分解代谢产物，对人体健康有着重要的影响。
因此，准确测定胆红素的水平对于临床诊断和治疗具有重要意义。
在临床实践中，有多种方法可以用来测定胆红素的水平，本文将介绍几种常用的胆红素测定方法。
一、尿胆红素试验。
尿胆红素试验是一种简单、快速的方法，通常用于初步筛查患者是否存在胆红素增高的情况。
该方法适用于常规体检或临床初步诊断，但其准确性相对较低，不适用于精确测定胆红素水平。
二、血清胆红素测定。
血清胆红素测定是目前临床上常用的一种方法，通过采集患者的血清样本，利用化学方法或光度法测定其中胆红素的浓度。
这种方法准确性较高，可以精确测定胆红素水平，是临床诊断中常用的方法之一。
三、高效液相色谱法。
高效液相色谱法是一种高灵敏度、高分辨率的胆红素测定方法，通过将样本中的胆红素与色谱柱分离，再通过检测器测定其浓度。
该方法准确性高，适用于胆红素水平较低的情况。
四、光谱法。
光谱法是一种通过测定物质在特定波长下的吸光度来测定其浓度的方法。
对于胆红素的测定，可以利用其在特定波长下的吸光度特性来进行测定。
这种方法准确性较高，但需要专业的设备和操作技能。
五、尿胆红素比色法。
尿胆红素比色法是一种通过比色法测定尿液中胆红素的浓度的方法。
该方法简单易行，适用于临床初步筛查，但准确性相对较低，不适用于精确测定胆红素水平。
综上所述，胆红素的测定方法有多种，每种方法都有其适用的场合和特点。
在临床实践中，应根据实际情况选择合适的方法进行测定，以确保结果的准确性和可靠性。
同时，对于不同方法的操作要求和结果解读也需要进行充分的了解和培训，以避免误判和错误诊断的发生。
希望本文对胆红素测定方法有所帮助。
血清总胆红素测定标准操作规程
血清总胆红素测定标准操作规程1.检测目的用于定量测定人体血清或血浆中总胆红素的含量2.检测原理钒酸氧化法：在PH3.0左右的缓冲液中，钒酸钠氧化总胆红素为胆绿素，使反应液的黄色减少。
测定胆红素氧化前后吸光度的差，可以计算出样品中总胆红素的浓度。
3．适用范围血清，或用肝素抗凝的血浆4．试剂及仪器1.试剂品：迈瑞公司生产的TBiL试剂盒，各组分如下：2.校准品由迈瑞公司提供的校准液，在更换试剂批号或出现质控漂移；仪器进行保养；仪器重要零件更换后进行校准。
3.仪器迈瑞BS-800型号仪器5．操作装载试剂—→进行校准—→进行质控—→输入标本检测项目—→加载标本—→标本测定—→结果复核—→报告6．注意事项1. 不能测试严重溶血、脂浊、黄疸的标本, 血浆标本可用肝素抗凝,待测样品室温不超过24小时，可于2℃-8℃保存72小时，胸腹水经抗凝取上清液。
2. 不能使用过期的试剂，2℃-8℃保存。
3. 定标液应冰冻保存。
7. 结果计算 c ＝ΧC O式中：c ——测定总胆红素浓度，umol/L ；A 测定——标本管吸光度；A 标准——标准管吸光度；C O ——校准血清总胆红素浓度，umol/L ；8. 操作性能1 精密度：批内CV ≤ 5.0%，批间CV ≤ 6.0%。
2 准确度：以参考方法定值的血清作为校准品时，本法测定结果与参考方法基本一致。
3 线性范围：2~684 umol/L9. 参考值5.1~19 umol /L(0.3~1.1mg/dL)10. 临床意义胆红素是老化的血红细胞中血红蛋白的代谢产物,血液中总胆红素和直接胆红素的含量测定有利于肝病和黄疸疾病的诊断。
总胆红素增高主要见于各类黄疸肝炎，胆道堵塞，新生儿黄疸。
总胆红素减低见于孕妇，部分冠心病。
11．安全防护A 测定A 标准1．对任何一份标本（包括质控品、标准品及检测试剂等）都应视其为具有传染性，操作人员在工作时应戴乳胶手套、穿工作服。
2．一旦发生标本容器划破手或身体、液体溅进眼睛等粘膜处，应立即用大量的水冲洗，同时向上级医师或科领导报告，必要时施以丙种球蛋白预防。
血清胆红素的实验报告
血清胆红素的实验报告研究背景血清胆红素是一种重要的临床生化指标，用于评估肝功能和溶血性贫血等疾病的诊断和治疗过程中的效果。
因此，对血清胆红素的准确检测方法进行研究和优化，对临床检验具有重要意义。
实验目的本实验旨在探索一种简便、准确、实用的方法来测定血清胆红素的含量。
实验原理本实验利用了二甲基亚硝胺(DMA)与胆红素在酸性条件下的化学反应，生成红色的胆红素硝基胆红素(DMN)。
DMN与高碱溶液结合形成蓝色的复合物，其最大吸收波长为576nm。
根据DMN与胆红素的反应关系，通过测量吸光度来确定血清样品中胆红素的含量。
实验材料和方法材料：1. 血清胆红素标准品2. 二甲基亚硝胺溶液3. 磷酸盐缓冲溶液4. 纯水5. 高碱溶液方法：1. 准备标准曲线：分别取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL的血清胆红素标准品，加入离心管中。
2. 加入1 mL的DMA溶液和1 mL的磷酸盐缓冲液，快速摇匀后，在40恒温水浴中反应10分钟。
3. 加入10 mL的纯水冷却至室温，用离心机离心5分钟。
4. 取上清液，用高碱溶液稀释10倍，即得到标准曲线的各个浓度标准溶液。
5. 测定各个标准溶液的吸光度，并记录。
测量待测样品1. 取待测样品3 mL，加入1 mL的DMA溶液和1 mL的磷酸盐缓冲液，快速摇匀后，在40恒温水浴中反应10分钟。
2. 加入10 mL的纯水冷却至室温，用离心机离心5分钟。
3. 取上清液，用高碱溶液稀释10倍。
4. 测量吸光度，并根据标准曲线计算出样品中胆红素的含量。
实验结果及分析标准曲线根据所制备的标准曲线，测量各个标准溶液的吸光度，得到以下数据：胆红素标准溶液（mL）吸光度0.1 0.2340.2 0.4210.4 0.8230.6 1.2330.8 1.602待测样品测量结果测量待测样品后，得到其吸光度为0.845。
根据标准曲线的线性方程（y = 1.957x + 0.095，R²=0.998），可以计算出待测样品中胆红素的含量。
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实验十六血清胆红素测定
（改良J-G法）
【目的】
1.熟悉血清胆红素测定的原理和方法；
２.掌握胆红素测定的正常参考范围及临床意义。
【原理】
血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，生成偶氮胆红素；未结合胆红素需要在加速剂（咖啡因-苯甲酸钠）作用下，分子内氢键破坏后，才能与重氮试剂反应生成偶氮胆红素。
醋酸钠缓冲液保持反应的pH，反应完成后加入终止试剂（叠氮钠）以破坏重氮试剂，最后加入碱性酒石酸钠溶液，使颜色不稳定的紫红色偶氮胆红素在咖啡因存在下转化为稳定的蓝色偶氮胆红素，在600nm波长比色，从标准曲线查找总胆红素和结合胆红素含量。
【器材】
试管及试管架、吸管、恒温水浴箱、分光光度计、秒表。
【试剂】
1．咖啡因试剂
称取无水水醋酸钠41.0g，苯甲酸钠38.0g，乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）0.5g，溶于约500ml去离子水中，再加入咖啡因25.0g，搅拌使溶解（加入咖啡因后不能加热溶解），用去离子水补足至1L，混匀。
过滤后置棕色瓶，室温保存。
2．碱性酒石酸钠溶液
称取氢氧化钠75.0g，酒石酸钠（Na2C4H4O6·2H2O）263.0g，用去离子水溶解并补足至1L，混匀。
置塑料瓶中，室温保存。
3．5g/L亚硝酸钠溶液
称取亚硝酸钠0.5g，用去离子水溶解并定容至100ml，混匀，置棕色瓶，冰箱保存，稳定期不少于2周。
若发现溶液呈淡黄色，应废弃重配。
4．5g/L 对氨基苯磺酸溶液
称取对氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H2O）5.0g，溶于800ml去离子水中，加入浓盐酸15ml，用去离子水补足至1L。
5．重氮试剂
临用前取上述亚硝酸钠溶液0.5ml和对氨基苯磺酸溶液20ml，混匀即成。
6．5.g/L叠氮钠溶液
7．胆红素标准液
（1）目前一般用未结合胆红素配制标准液，此标准品须用含白蛋白的溶剂配制，常用人混合血清，对此血清的要求如下：
收集无溶血、无黄疸、无脂浊的新鲜血清，混合，必要时可用过滤器过滤。
取过滤后的血清1ml，加入新鲜0.154mmol/L NaCl溶液24ml，混合。
在414nm波长，1cm光径，以0.154mmol/L NaCl溶液调零点，其吸光度应小于0.100；在460nm的吸光度应小于0.04。
（2）配制标准液的胆红素须符合下列标准：纯胆红素的氯仿溶液，在25℃条件下，光径1.000±0.001cm，波长453nm，摩尔吸光系数应在60700±1600范围内；改良J-G法偶氮胆红素的摩尔吸光系数应在74380±866。
（3）胆红素标准贮存液（171μmol/L）：
准确称取符合要求的胆红素10mg，加入二甲亚砜1ml，用玻璃棒搅拌，使成混悬液。
加入0.05mol/L碳酸钠溶液2ml，使胆红素完全溶解后，移入100ml容量瓶中，以稀释用血清洗涤数次并入容量瓶中，缓慢加入0.1mol/L盐酸2ml，边加边摇（勿用力摇动，以免产生气泡）。
最后以稀释血请加至刻度。
配制过程中应尽量避光，贮存容器用黑纸包裹，置4℃冰箱3天内有效，但要求配后尽快作校正曲线。
【操作】
取试管3支，按下表操作：
表3-20 改良J-G法测定血清胆红素
加人物(m1) 总胆红素管结合胆红素管空白管
血清0.2 0.2 0.2
咖啡因苯甲酸钠试剂 1.6 - 1.6
对氨基苯磺酸- - 0.4
重氮试剂0.4 0.4 -
混匀，准确1分钟
叠氮钠- 0.05 -
咖啡因苯甲酸钠试剂- 1.55 -
室温10分钟
碱性酒石酸钠 1.2 1.2 1.2
混匀，600nm波长比色，以空白管调零，读取各管吸光度。
从标准曲线上查出相应的胆红素浓度。
【标准曲线制作】
取试管6支，编号，按下表操作：
表3-21 胆红素标准曲线的绘制
加人物(m1) 对照管 1 2 3 4 5 胆红素标准贮存液－0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 稀释用血清 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 -
0 34.2 68.4 103 137 171 相当于胆红素浓度（μ
mol/L）
混匀（不可产生气泡），按总胆红素测定法操作。
每一浓度做3个平行管，用对照管调零，读取各管吸光度，以各浓度吸光度均值为纵坐标，以相应的胆红素浓度为横坐标，绘制标准曲线。
【正常参考范围】
血清总胆红素 5.1～17.1μmol/L
血清结合胆红素（1分钟） 0～6μmol/L
【临床意义】
血清总胆红素测定可判断有无黄疸及反映黄疸的程度。
总胆红素在17.1～34.2μmol/L时为隐性黄疸；超过34.2μmol/L时，肉眼可见、皮肤、粘膜、巩膜黄染，称显性黄疸。
血清总胆红素和结合胆红素同时测定，其百分比可用于鉴别黄疸类型。
溶血性黄疸时，血清总胆红素升高，以为结合胆红素升高为主，结合胆红素占总胆红素的20%以下；肝细胞黄疸时，结合胆红素占总胆红素的35%以上；阻塞性黄疸时，结合胆红素升高更明显，占总胆红素的50%以上。
再生障碍性贫血及数种继发性贫血（主要由癌或慢性肾炎引起），血清总胆红素减少。
【结果及分析】
【思考题】
1. 简述血清胆红素测定的原理。
2. 血清胆红素测定中破坏氢键的组分是什么？
3. 肝细胞性黄疸时，血清中何种胆红素升高？。