mDH5a 感受态制备
个人总结 DH5α感受态的制备和转化
1.感受态的制备（1）挑取E.coli DH5α受体菌单菌落于50 ml 2×YT培养基的250ml锥形瓶中，250rpm，37℃震荡培养2.5小时左右（测其OD600在0.5-0.6最好）；（2）倒入，灭菌冰上预冷的50ml离心管中，盖严；（3）冰浴20-30分钟，使菌液冷却到0℃（要是有事，此步可暂停，冰浴久一点）；（4）4℃，4000rpm（3500rpm最好，4000会使离心管变形，而且菌体离的过紧）离心10min 收集菌体；（5）弃上清，倒置1min；（6）加10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2悬浮菌体（先加2ml悬浮，再加8ml。
直接加够10ml不容易吹散悬浮）；（7）冰浴25分钟；（8）4℃，4000rpm离心10min；（9）弃上清，加入1.5ml预冷的0.1mol/L的CaCl2小心悬浮；（10）分装（EP在预冷前先做好标记）100 μL或者200μL一管。
可以-70℃保存备用，也可以放置于冰上后在冰箱4℃保存一两天再用，转化效果不会有大的影响。
注意：加入CaCl2后细胞比较脆弱，操作一定要轻柔，不能弹不能摔。
整个操作都要在冰上，手不要直接接触管底。
2.转化可用新做的感受态进行转化，也可用-70℃保存的进行转化（1）分装的100或者200μL感受态细胞+重组质粒，冰浴30min；（2）42℃静置90s（可用干浴器）；（3）冰浴2-3min；（4）加入800μL37℃预热的2×YT培养基，37℃，200rpm震荡培养45min（中间不要暂停，培养时45度角倾斜）；（5）3000rpm离心3-4min，倒掉上清，残余的大概100μL左右进行悬浮后涂板；（6）37℃倒置培养过夜，第二天查看板上菌落生长情况。
注意：要是转化质粒，转0.5μL或者1μL就行了，质粒的转化效率很高。
涂板的时候不用离心，直接吸取50μL涂板。
转化连接产物的时候由于连接效率不一定高，所以要离心之后弃上清剩余100μL再悬浮后全部涂板。
制备DH5α的感受态细胞并进行转化
制备DH5α的感受态细胞并进行转化一．制备DH5α的感受态
（1）将DH5 菌液在无抗的LB平板上划线，37℃过夜培养
（2）从平板上挑单菌落，接种于5mlLB液体培养试管中，37℃过夜培养（3）按照1:100的比例吸取菌液接种于250ml摇瓶中（含100mlLB培养基）中，37℃，200rpm振荡培养2.5小时。
在600nm下测其OD值达到0.4-0.6之间即可（菌的对数生长期）
（4）将菌液转入50ml预先预冷的灭菌离心管中，冰浴30min，4℃，5000rpm，离心10min
（5）弃上清液，加入20ml预先预冷的0.1MCacl2，先加入5ml吹打混匀，再加入 15ml混匀，4℃，5000rpm，离心10min
（6）弃上清液，将预冷的50%甘油400uL和0.1MCacl2 600uL加入1ml 离心管中并混合均匀，使其甘油的最终浓度为20%。
将其吹打混匀后，以100uL/管（放在冰上）分装于1.5mlEP管中，标注后冻存于-80℃冰箱中。
二．DH5α的感受态的转化
（１）取80-100uL感受态细胞于1ml离心管中，并将其放在冰中，再加入10uL预冷的连接产物，混匀。
(轻轻手弹混匀即可，不要吹打出气泡)
（２）离心管0℃，冰浴30min
（３）将离心管放入４２℃水浴锅中，热激45ｓ，迅速将离心管放回冰中5min
（４）向离心管中加入，500uL不含抗生素的SOC media，37℃静止培养1h
（５）离心管6000r,30s,吸取100uL上清液，弃其余上清液，用100uL上清液吹打混匀菌体沉淀。
（６）将菌液加入相应质粒抗生素抗性（加AMP）的平板上，用灭菌的玻璃珠涂布，待菌液被琼脂吸收后，37℃倒置过夜。
大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备【实验目的】法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。
掌握用 CaCl2【实验原理】常态细胞不能摄入外部溶液中的DNA分子，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌，首先必须制备感受态大肠杆菌细胞。
受体细胞经一定方法处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能够允许外源DNA载体分子通过的感受态细胞。
【材料和试剂】溶液、75%的甘油（以上试DH 5α菌株、液体LB培养基、0.1mol/L的CaCl2剂均需高压灭菌）【仪器设备】振荡培养箱、低温离心机、分光光度计、冰盒、不同型号的枪头及微量移液器等【实验步骤】1、将 1ml新鲜的16h过夜培养物，转到 100ml LB培养基中。
于 37℃振荡摇=0.314。
匀 3h（旋转摇床200～300r/min），测量 OD600nm2、在无菌条件下，将1.5ml细菌培养液转移到冰预冷的Eppendorf管中，在冰上放置10min。
3、于 4℃用 4000r/min 离心10min。
4、弃去上清液，将 Eppendorf管倒置 1min，使残留培养液流尽。
溶液重悬细胞，合并两管，冰浴10min。
5、各加 150μL冰预冷的 0.1mM CaCl26、于4℃用 4000r/min离心 10min。
7、弃上清，将 Eppendorf管倒置 1min，使残留的痕量培养液流尽。
溶液重悬细胞，再加入 25μL预冷的8、先加入 800μL冰预冷的0.1M CaCl275% 的甘油，之后于 -80℃贮存备用。
【注意事项】1、制备过程均需在低温（4℃）下进行，应尽量避免处理的细胞升温或于室温放置过久，否则会严重影响感受态细胞制备的效果。
2、操作过程需保证无菌状态，若不慎污染，则后续操作将无法正常进行。
dh5a感受态细胞的制备
dh5a感受态细胞的制备简介感受态细胞是一类作为实验室工具广泛应用于基因工程和分子生物学研究的细胞系。
dh5a是其中一种常用的感受态细胞系，本文将介绍dh5a感受态细胞制备的步骤和相关实验技术。
1. 前期准备工作在进行dh5a感受态细胞的制备实验之前，我们需要准备以下材料和设备：•dh5a感受态细胞的培养基•dh5a感受态细胞的平板培养基•大肠杆菌感染物（包含目标DNA）•取消感染物（用于抑制非感兴趣的背景细胞的生长）此外，还需要以下设备和试剂：•培养箱•离心机•培养皿（包括平板和液体培养皿）•微量移液器和相关移液器头2. 制备dh5a感受态细胞步骤步骤1：准备感受态细胞培养基1.将dh5a感受态细胞培养基取出并放置在室温下静置，使其达到室温。
2.使用无菌技巧，打开培养基瓶盖并使用无菌移液器将适量培养基转移到培养皿中。
步骤2：感染dh5a感受态细胞1.取出dh5a感受态细胞的平板培养基，并在培养箱中孵育过夜（一般为37℃，孵育时间可根据实验要求略有调整）。
2.取出符合要求的感染物冻存管，使用微量移液器分配适量dh5a感受态细胞平板培养基到液体培养皿中。
3.加入相应的抗生素，以抑制非感兴趣的背景细胞的生长。
4.使用微量移液器将取出的感染物缓慢滴加到液体培养皿中。
5.轻轻摇晃液体培养皿，使感染物和细胞均匀混合。
6.将液体培养皿放回培养箱，进行孵育（37℃，孵育时间根据实验要求略有调整）。
步骤3：培养感染细胞1.孵育一段时间后，取出感染皿检查细胞的生长情况。
感染细胞的数量应明显增加。
2.打开培养箱门，用无菌移液器采集感染细胞。
3.将感染细胞转移到含有抗生素的培养基中，以便筛选转化的感受态细胞。
4.将细胞分裂到平板培养基上。
5.在液体培养基中孵育过夜后，将平板培养基转移到培养箱中进行孵育。
3. 结论通过以上步骤，我们成功制备了dh5a感受态细胞。
在实验室研究中，dh5a感受态细胞常被用于DNA克隆、转化和基因表达等实验。
大肠杆菌感受态的制作(农杆菌也行)
大肠杆菌DH5α感受态的制备：
采用《分子克隆实验指南》上所述的氯化钙二次重悬法（萨姆布鲁克等，2002）。
（1）吸取40µl E.coil菌液，接种于20 ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜至OD600 = 0.5左右。
（2）吸取200 µl菌液转于另一新鲜的20 ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养约2.5～4 h至OD600 = 0.6左右，停止培养。
（3）培养液转入离心管中，冰浴10 min，4℃下5000 rpm离心6 min。
（4）弃上清液，用8 ml冰预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液轻轻悬浮菌体至均匀，冰上放置30 min。
4℃下5000 rpm离心6 min。
（5）弃上清液，用2 ml冰预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液轻轻悬浮菌体至均匀，冰上放置片刻后即制成感受态细胞悬液。
（6）感受态细胞悬液可在冰上放置，2～7小时内直接用于转化实验，也可加入15%高压灭菌过的甘油，混匀后，以每管100 µl分装于1.5 ml离心管中，置-80℃条件下保存备用。
感受态细胞的制备(DH5α大肠杆菌)
感受态细胞的制备（DH5α大肠杆菌）一、准备工作1、实验器械4℃离心机（50ml离心管），37℃恒温箱，37℃摇床，紫外通风橱（提前一天预约）；0.22μm的滤器2个，10ml注射器2个；冰盒；高压灭菌的1.5mlEP管30个，与离心机配套的50ml离心管6个（高压灭菌），高压灭菌的500ml锥形瓶2个，高压灭菌的100ml 玻璃瓶2个，高压灭菌的1ml枪头和200μl枪头各一盒。
2、试剂配制① LB平板② TYM培养基：分别称取胰蛋白胨4g，NaCl 1.46g，酵母提取物1g，MgSO4 0.62g，至于250ml烧杯中，加入120mlDDW，摇晃，使其全部溶解，用浓NaOH调节PH值为7.5，最后定容至200ml，转入至500ml锥形瓶，高压灭菌，4℃保存。
③ TfBⅠ：分别称取乙酸钾0.294g，MnCl2 0.99g，KCl 0.146g，CaCl2 0.111g，置于200ml 烧杯中，加入15ml甘油和85mlDDW，摇晃，使其全部溶解。
然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。
④ TfBⅡ（每次现用现配）：分别称取MOPS 0.046g，CaCl2 0.167g，KCl 0.015g，置于50ml烧杯中，加入3ml甘油和17mlDDW, 摇晃，使其全部溶解。
然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。
二、实验步骤1、将DH5α甘油菌从-80℃冰箱中拿出来放在冰上，用枪头吸蘸取或取少部分菌液加到无抗生素的LB平板边缘，在火上稍微烧一下枪头，在平板侧壁上冷却枪头，同时使其顶端变圆变钝。
划线接种，倒置放入37℃恒温箱过夜。
注：①尽量在菌液融化前挑取，反复冻融对菌体有损伤。
②吸取菌液后，尽可能快把甘油菌放回-80℃冰箱。
2、次日早上，观察是否长出单个菌落，菌落大小合适时，将平板放入4℃保存。
工程菌DH5α感受态细胞的制备及质粒pUC18转化的研究论文
毕业论文题目：工程菌DH5α感受态细胞的制备及质粒pUC18转化的研究（教务处制表）工程菌DH5α感受态细胞的制备及质粒pUC18转化的研究摘要：工程菌DH5α是实验室经常用到的一种宿主菌,同时质粒pUC18也是一种常用的优良表达载体，两者常被用于基因克隆和原核表达研究的工具。
本实验采用老师保存的实验室菌种，通过质粒提取试剂盒（碱裂解法）提取质粒pUC18和氯化钙法将工程菌DH5α制备成感受态细胞，然后将质粒转化入感受态的工程菌DH5α细胞中。
结果表明：提取的质粒通过琼脂糖凝胶电泳显示为pUC18，而经pUC18转化的工程菌DH5α具有抗氨苄青霉素的能力，并由于E.coli DH5a在使用pUC18质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补，最后接种于加入氨苄青霉素、呈色底物X-gal和诱导物IPTG的LB培养基上，经蓝白斑筛选，筛选阳性克隆。
关键词：工程菌DH5α；碱裂解法；质粒pUC18；蓝白斑筛选Theresearch for the preparation of the engineering culture DH5αcells and the transformation of the plasmid pUC18Abstract:Theengineering strain DH5αis often used as one of the host bacteria in laboratory , and plasmid pUC18 is also a kind of the commonly excellent expression vector, both are often used to the study of gene cloning and prokaryotic expression as the tool.The laboratory cultures are preserved by the teacher in this study,the plasmid pUC18areextracted by plasmid extraction kit (caustic pyrolysis) and the engineering bacterium DH5αareprepared as competent cells by calcium chloride method , and then translates plasmid into the feeling state of engineering bacterium DH5α cells.The resul t s showed that the extract of plasmid is pUC18 by agarose gel electrophoresis,so that the engineering bacterium DH5α that including the plasmid pUC18 has the ability of resistance to ampicillin, and as a result,when pUC18 plasmid vector has finished the transformation,the E.coliDH5αcan realize α-complementation with the amino terminal of theβ-galactosidase that was produced by the plasmid pUC18,finally,the transformant was inoculated to the LB culture mediumthat contains ampicillin, color substrate X - gal and inducer IPTG,the transformantsarepositive clones if they can survive andbescreened out by the blue and white spot screening.Keywords: Engineering bacterium DH5α;Alkaline lysis method;Plasmid pUC18;Blue and white spot screening目录1 前言 ............................................................................................... 错误！未定义书签。
感受态大肠杆菌的制备(DH5a)
制备感受态大肠杆菌（DH5α）
一．原理和用途
1.利用CaCl2对大肠杆菌细胞膜的作用，使细菌产生短暂的可摄取外源DNA的过程
2.用于质粒DNA或连接产物转化大肠杆菌，构建重组克隆
二．材料
1.高压灭菌：50ml离心管，枪头等
2.试剂：0.1M CaCl2，无菌甘油
三．
《精编分子生物学》，科学出版社，第三版
一步法（TSS）制备感受态大肠杆菌（DH5α）
一. 准备工作
冻存菌株，LB液体培养基，Transform Storage Solution（TSS）
消毒：三角瓶（50ml、500ml），50ml一次性离心管（预冷），1.5ml EP管（预冷）
低温离心机，超低温冰箱，冰盒，冰水浴，移液器（1000μl,200μl）,枪头
二. 操作步骤
1.活化菌株：－80℃取出保存菌株（如DH5α、BL21、BG5183等），37℃摇菌过夜。
或：－80℃取出保存菌株，（可选：EP管摇菌）涂板，37℃培养过夜，复壮菌株，然后再挑菌并活化菌株。
2.三角瓶（500ml）中加入100ml LB，加1-2ml 活化好的菌液，37℃摇置约3h，使菌生长
至对数生长中期，OD值至0.3-0.4(不超过0.6)（菌液成半透明状）。
3.冰水浴30min，分装至50ml离心管，4℃，3000rpm（1000g），10min。
4.弃尽上清，沉淀用约10倍体积2×TSS重悬菌体，100-200μl分装至预冷的EP管中，
－80℃保存。
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DH5α感受态细菌制备
１）从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
２）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌用冰预冷的50ml离心管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至０℃。
切记：所有步骤均需无菌操作。
３）于４℃ 5000转/分离心10分钟。
４）倒出培养液，将管倒置于灭菌过的滤纸上１分钟以使最后残留的培养液流尽。
５）以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬沉淀，放置于冰上15-30min。
６）于４℃以5000转/分离心10分钟。
７）倒出培养液，将管倒置１分钟以使最后残留的培养液流尽。
(重复步骤5.6.7会效果更好)
８）每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的含15%甘油的0.1mol/L CaCl2重悬沉淀。
９）用冷却的无菌枪头从每种感受态细胞悬液中各取100μl转移到无菌的1.5ml EP管中。
需要冷却的器具：1ml枪头，200ul枪头，1.5ml EP管，0.1mol/L的CaCl2，50ml离心管，灭菌甘油，灭菌滤纸。