细胞周期同步化讲课稿
细胞周期同步化PPT课件
2021/3/7
CHENLI
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（1）.人工选择同步化
• 人工选择同步化：人为的将处于不同细胞 周期的细胞分离开，从而获得不同时期细 胞群体的方法。
• 人工选择同步化的方法：
（1）.有丝分裂选择法密
（2）度梯度离心法
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CHENLI
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有丝分裂选择法（反复振摇法）
• 利用有丝分裂细胞变圆隆起，与培养皿的 附着性降低的特点。此法的特点是细胞不 受药物等的伤害，同步化程度高，放入 37℃环境中，收集的细胞即可同步分裂。 缺点是分裂细胞一般占1%-2 ％，分离的细 胞数量少。
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同步化方法
• 1.自然同步化 • 2.人工同步化 • （1）人工选择同步化 • （2）人工诱导同步化
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1.自然同步化
• 自然同步化在自然界中，细胞自然同步化 的现象在动、植物及粘菌中都有所发现， 它们不受人为条件的干扰，因而有可能在 接近自然的条件下进行观察。
• 缺点：自然同步化受到很多条件的限制。
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2.2 DNA分裂中期阻断法
• 某些药物可抑制微管的聚合，将细胞阻断 于有丝分裂中期。非平衡生长问题不十分 明显。但长时阻断释放后许多细胞不能恢 复正常的细胞周期。
• 中期阻断药物最常用者为秋水仙素或其衍 生物秋水仙酰胺。
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DNA分裂中期阻断法的优缺点
• 优点：操作简便，效率高 • 缺点：这些药物的毒性相对较大，若长时
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DNA合成阻断法优缺点
• 优点：同步化程度高，适用于任何培养体 系，可将几乎所有的细胞同步化。
细胞周期与细胞同步化
M期 期
概况
时期 基本特点 时间 分期 最终阶段 形态、结构变化最大， 形态、结构变化最大， 细胞增殖标志 短，较恒定 前、中、后，末
前期
概况 染色质凝集，核被膜崩解， 染色质凝集，核被膜崩解， 纺缍体形成 20~30分 分 特点 1.染色体组装 染色质疑集，M期开始 染色体组装:染色质疑集 染色体组装 染色质疑集， 期开始 分裂前须先染色质组装成染色体 分裂前须先染色质组装成染色体 染色质逐渐变短， 染色质逐渐变短，变粗 核膜破裂， 核膜破裂，已成染色体 2. 核被膜破裂 核被膜消失， 核被膜消失，前期结束
3．N2阻断法 ． 此方法较秋水仙胺阻抑法好。 此方法较秋水仙胺阻抑法好。 (1)将细胞传代培养至指数生长期。 将细胞传代培养至指数生长期。 将细胞传代培养至指数生长期 (2)将培养瓶置于 2罐中通人适量 将培养瓶置于N 将培养瓶置于 CO2(约相当于罐中体积的 ％)。 约相当于罐中体积的5％ 。 约相当于罐中体积的 (3)关闭好 2罐，接上 2管子及压力 关闭好N 接上N 关闭好 缓缓向罐中充气一直到压力为80表，缓缓向罐中充气一直到压力为 90磅为止。 磅为止。 磅为止
二、细胞同步化
在一般培养条件下， 在一般培养条件下，群体中的细胞 处于不同的细胞周期时相之中。 处于不同的细胞周期时相之中。 为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、 为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、 基因表达或凋亡， 基因表达或凋亡，常需采取一些方法使 细胞处于细胞周期的同一时相， 细胞处于细胞周期的同一时相，这就是 细胞同步化技术。 细胞同步化技术。
(一)M期同步化方法 期同步化方法 1．振荡收集法 ． 该法利用M期细胞变圆易脱落的特点， 该法利用 期细胞变圆易脱落的特点， 期细胞变圆易脱落的特点 将生长旺盛的贴壁细胞按一定的时间间 隔振荡， 期细胞脱落， 隔振荡，使M期细胞脱落，逐步收集培 期细胞脱落 养基，并补充新的培养基。 养基，并补充新的培养基。收集的细胞 度冰箱中保存， 放4度冰箱中保存，离心沉淀后即获得 度冰箱中保存 M期细胞。 期细胞。 期细胞
细胞周期同步化
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人工选择同步化
有丝分裂选择法：对数期的单层培养细 胞——细胞分裂活跃，处于分裂期的细 胞变圆，贴壁生长——振荡使细胞脱落， 悬浮到培养液中——收集培养液，离 心——获得分裂期细胞，从新培养，获 得不同时相的细胞
优点是细胞未经过任何药物处理，能真
实反映细胞周期状况，细胞同步化效率
细胞周期同步化
将处于不同时相的细 胞分离开来，从而获 得不同时期的细胞群 体。
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自然同步化 细胞周期同步化 人工选择同步化
药物诱导
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有丝分裂选择法 密度梯度离心法 分裂中期阻断法 DNA合成阻断法
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自然同步化
自然界中已经存在一些细胞群体处于细 胞周期的同一时相
如有一种黏菌的变形体plasmodia，只进 行核分裂而不进行胞质分裂，结果形成 多核体结构。所有细胞核在同一细胞质 中进行同步分裂。
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高。缺点是分离的细胞数量少。精选ppt课件
密度梯度离心法：根据不同时期的细胞 在体积和重量上存在差别进行分离。得 到处于不同时期的细胞。
优点是方法简单省时，效率高，成本低。 缺点是对大多数种类的细胞并不适用。
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药物诱导
DNA合成阻断法——G1/S-TdR双阻断法： 1、将过量的TdR加入细胞培养液，所有 S期的细胞立刻被抑制，其他细胞运行到 G1/S交界处被抑制。2、将TdR洗脱，解 除抑制，被抑制的细胞沿细胞周期运行。 3、在解除抑制的细胞到达G1期终点前， 第二次加入TdR并继续培养，所有的细胞 被抑制在G1/S交界处。4、将TdR洗脱， 加入新鲜培养液培养一定时间，可获得S
6 期和G2不同时间点的同步化细胞精选。ppt课件
细胞周期同步化
细胞周期同步化在细胞培养过程中，细胞多处于不同的细胞周期时相中，其中有少数细胞在进行有丝分裂活动，其余细胞分别处于G1、S和G2各期。
不同时相的细胞对药物干预存在不同反应，会影响实验的重复性，因此,需要获得周期一致性的细胞。
利用细胞同步化技术可使细胞大量的处于同一细胞时期，并可获得该时期大量的物质，如细胞中期时的染色体.细胞周期同步化(synchronization）是指为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，借助某种自然或人为的实验手段,使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相（除了G0期的细胞）的现象。
细胞同步化本质上包括用一定的方法获得一定数量的同步化细胞群和使细胞进入同步化生长的两层含义。
DNA 合成抑制法是通过抑制DNA合成将细胞同步于同一时期的方法。
高浓度TdR（胸腺嘧啶核苷）双阻断法是目前常用的抑制DNA 合成的同步化方法.它可逆地抑制DNA 合成,而不影响其他时期细胞的转运，最终可将细胞群阻断在S 期或G1 /S 交界处.其原理是: Td Ｒ是细胞DNA 合成不可缺少的前体,但向培养基中加入过量TdＲ,可形成过量的三磷酸腺苷，后者能反馈抑制其他核苷酸的磷酸化，从而抑制DNA 合成.它将细胞同步于G1 /S期交界处，同步化程度高，适用于任何培养体系，可将几乎所有的细胞同步化，但是容易产生非均衡生长，个别细胞体积增大.TdＲ双阻断法因为简单易行且可逆，在肿瘤药理方面对细胞周期同步化的实验中得到了广泛的应用。
羟基脲、5—氟脱氧尿嘧啶、阿糖胞苷、氨甲蝶呤和高浓度ADR、GDR也属于DNA合成抑制剂,它们与TdR作用相似,均可通过抑制DNA 合成达到同步化的目的。
中期阻断法是利用破坏微管的药物将细胞阻断在M期从而得到同一时期细胞的方法，常用的药物有秋水仙素等。
秋水仙素通过抑制微管的聚合，进而抑制有丝分裂装置的形成，将细胞阻断于有丝分裂中期然后再释放使细胞达到同步化。
中期阻断法非平衡生长问题不明显，但可逆性比较差，当阻断时间过长时，许多细胞产生异常分裂。
细胞周期同步化
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自然同步化 细胞周期同步化 人工选择同步化
药物诱导
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有丝分裂选择法 密度梯度离心法 分裂中期阻断法 DNA合成阻断法
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自然同步化
自然界中已经存在一些细胞群体处于细 胞周期的同一时相
如有一种黏菌的变形体plasmodia，只进 行核分裂而不进行胞质分裂，结果形成 多核体结构。所有细胞核在同一细胞质 中进行同步分裂。
将处于不同时相的细胞分离开来从而获得不同时期的细胞群细胞周期同步化自然同步化人工选择同步化有丝分裂选择法密度梯度离心法药物诱导dna合成阻断法分裂中期阻断法自然界中已经存在一些细胞群体处于细胞周期的同一时相如有一种黏菌的变形体plasmodia只进行核分裂而不进行胞质分裂结果形成多核体结构
细胞周期同步化
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高。缺点是分离的细胞数量少。精选ppt课件
密度梯度离心法：根据不同时期的细胞 在体积和重量上存在差别进行分离。得 到处于不同时期的细胞。
优点是方法简单省时，效率高，成本低。 缺点是对大多数种类的细胞并不适用。
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药物诱导
DNA合成阻断法——G1/S-TdR双阻断法： 1、将过量的TdR加入细胞培养液，所有 S期的细胞立刻被抑制，其他细胞运行到 G1/S交界处被抑制。2、将TdR洗脱，解 除抑制，被抑制的细胞沿细胞周期运行。 3、在解除抑制的细胞到达G1期终点前， 第二次加入TdR并继续培养，所有的细胞 被抑制在G1/S交界处。4、将TdR洗脱， 加入新鲜培养液培养一定时间，可获得S
在实际工作中，常常几种方法并用，以 获得数量多、同步效率高的细胞。
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细胞周期及其调控(讲义)
体发出，连接在染色 体着丝点动粒上,着丝 点上具有马达蛋白。
+
-
+
+
+
+
-
极体微管：由中心体发出，在纺锤体中
部重叠，重叠部位结合有分子
马达，负责将两极推开。
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染色体的运动
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Two centrosomes, and their forming radial arrays of astral microtubules separating on the surface of an early prophase newt lung cell nucleus.
（三）G2期（有丝分裂准备期）
1. 促有丝分裂因子(MPF)合成 2. 微管蛋白（tubulin)合成 3. 0.3%DNA复制 4 . 结构功能蛋白的合成
G2期 check point： （1） 是否完成DNA复制 ？ （2）是否有DNA错误复制？
（四）M期 （有丝分裂期）
有丝分裂的主要特征是： 姊妹染色单体分离；核膜、核仁破裂重建。
– S期限制点：DNA复制是否完成？
– G2/M限制点：DNA是否损伤？细胞体积是否足够大？
– 中-后期限制点：纺锤体组装限制点。
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Four Checkpoints
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（1）限制点在细胞周期调控中的作用
细胞周期有敏感点，确保细胞周期事件有序进行，检 测，修复。
Checkpoint：
G1 、 G1 /S 、G2期
D
E
( Cyclin D、E 、A)
A
B
M 期 (Cyclin B)
细胞周期同步化
2.细胞同步化 细胞同步化 在一般培养条件下， 在一般培养条件下，群体中的细胞处 于细胞周期不同的时相之中， 于细胞周期不同的时相之中，不同阶段的 细胞其形态学和生化特性均有所不同， 细胞其形态学和生化特性均有所不同，为 了研究某一时相的细胞， 了研究某一时相的细胞，常需采取一些方 法使细胞处于细胞周期的同一时相， 法使细胞处于细胞周期的同一时相，这就 是细胞同步化技术。 是细胞同步化技术。
（二）人工同步化 概念：人为地将处于不同时期的细胞分离开来， 概念：人为地将处于不同时期的细胞分离开来， 从而获得不同时期的细胞群体。 从而获得不同时期的细胞群体。 方式： 方式： 1.选择同步化： 选择同步化： 选择同步化 选择同步化是根据细胞的体积 是根据细胞的体积、 选择同步化是根据细胞的体积、黏附性等的 时相特征来对不同时相的细胞进行选择和分离， 时相特征来对不同时相的细胞进行选择和分离， 从而实现细胞的同步化。 从而实现细胞的同步化。 2.诱导同步化： 诱导同步化： 诱导同步化 诱导同步化是在培养液中添加或去除某些成 诱导同步化是在培养液中添加或去除某些成 或者改变培养温度， 分，或者改变培养温度，从而对细胞的生长进行 阻滞或回复， 阻滞或回复，将不同步生长的细胞调整为同步生 获得时相较为均一的细胞群。 长，获得时相较为均一的细胞群。
细Hale Waihona Puke 周期同步化细胞周期：• 由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，叫 由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程， 细胞周期。分为 个期 个期： 细胞周期。分为4个期： • G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期 期 ，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙 复制之前的间隙 时间。 时间。 – S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期。 期 复制的时期。 ， 复制的时期 – G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的 期 ， 复制完成到有丝分裂开始之前的 一段时间。 一段时间。 – M期又称 期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结 期又称D期 ， 期又称 束。
细胞生物学细胞增殖与周期调控讲课文档
纺锤体（spindቤተ መጻሕፍቲ ባይዱe）
➢ 概念（concept）：由微管和微管蛋白组成的参与染色体向极移 动的纺锤式的结构。
➢ 结构组成：动粒微管：一端和中心体相连，另一端和动粒相连。
极性微管：一端和中心体相连，另一端游离或者是
相互搭桥。
➢ 装配：微管在中心体周围的装配： γ微管蛋白
中心体的分离：移动素类蛋白（KRPs）
3. 根据增殖状况，细胞的类型
① 周期中细胞（cycling cell）：是指在细胞周期中连续运转的细 胞，又称为连续分裂细胞或可育细胞，如表皮生发层细胞、部 分骨髓细胞。
② 静止期细胞（quiescent cell）：指的是暂时离开细胞周期，停止 细胞分裂，去执行一定的生物学功能，但在适当的刺激下可重新 进入细胞周期的细胞，又称为G0期细胞或休眠细胞，如淋巴细胞、 肝、肾细胞等。
核膜、核仁和部分 细胞器重新装配。
第四十页，共97页。
6.胞质分裂（cytokinisis）
胞质分裂开始于细胞分裂的后期，完成于细胞分裂的 末期。
胞质分裂开始时，在赤道板周围细胞膜及相应的胞质开 始下陷，形成环形缢缩，称为分裂沟(furrow)。分裂沟逐 渐加深，直至两个子代细胞完全分开。
胞质分裂可简单归纳为4个步骤：分裂沟位置确定、 肌动蛋白聚集和收缩环形成、收缩环收缩、收缩 环处细胞膜融合形成两个子细胞。
二、 细胞周期
1. 细胞周期的概念（concept of cell cycle）：指 从一次细胞分裂结束开始，到下一次细胞分裂 结束所经历的整个过程。分为：物质积累期（间期 或静止期）和细胞分裂期。
第四页，共97页。
2. 细胞周期时相组成：G1 S G2 M
第五页，共97页。
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细胞周期同步化在细胞培养过程中，细胞多处于不同的细胞周期时相中，其中有少数细胞在进行有丝分裂活动，其余细胞分别处于G1、S和G2各期。
不同时相的细胞对药物干预存在不同反应，会影响实验的重复性，因此，需要获得周期一致性的细胞。
利用细胞同步化技术可使细胞大量的处于同一细胞时期，并可获得该时期大量的物质，如细胞中期时的染色体。
细胞周期同步化(synchronization)是指为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，借助某种自然或人为的实验手段,使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相( 除了G0期的细胞)的现象。
细胞同步化本质上包括用一定的方法获得一定数量的同步化细胞群和使细胞进入同步化生长的两层含义。
DNA 合成抑制法是通过抑制DNA合成将细胞同步于同一时期的方法。
高浓度TdR(胸腺嘧啶核苷)双阻断法是目前常用的抑制DNA 合成的同步化方法。
它可逆地抑制DNA 合成，而不影响其他时期细胞的转运，最终可将细胞群阻断在S 期或G1 /S 交界处。
其原理是: TdＲ是细胞DNA 合成不可缺少的前体，但向培养基中加入过量TdＲ，可形成过量的三磷酸腺苷，后者能反馈抑制其他核苷酸的磷酸化，从而抑制DNA 合成。
它将细胞同步于G1 /S 期交界处，同步化程度高，适用于任何培养体系，可将几乎所有的细胞同步化，但是容易产生非均衡生长，个别细胞体积增大。
TdＲ双阻断法因为简单易行且可逆，在肿瘤药理方面对细胞周期同步化的实验中得到了广泛的应用。
羟基脲、5-氟脱氧尿嘧啶、阿糖胞苷、氨甲蝶呤和高浓度ADR、GDR也属于DNA合成抑制剂，它们与TdR作用相似，均可通过抑制DNA合成达到同步化的目的。
中期阻断法是利用破坏微管的药物将细胞阻断在M期从而得到同一时期细胞的方法，常用的药物有秋水仙素等。
秋水仙素通过抑制微管的聚合，进而抑制有丝分裂装置的形成，将细胞阻断于有丝分裂中期然后再释放使细胞达到同步化。
中期阻断法非平衡生长问题不明显，但可逆性比较差，当阻断时间过长时，许多细胞产生异常分裂。
过去研究中也发现，同步后的细胞的生长能力明显不如撤去阻断剂后得到的S期细胞旺盛。
秋水仙胺、Nocodazole也是目前常用的中期阻断剂。
经过同步化之后的细胞可以通过流式细胞术对其周期进行分析。
将细胞用PI（碘化丙啶）染液进行染色，使用流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。
由于细胞的DNA含量在不同时期有显著的差异，因此可以将细胞分成G1/G0期（1倍），S期（1-2倍）和G2/M期（2倍）。
流式细胞仪可以根据DNA含量在不同时间内的变化,从而确定细胞周期的长短,也可以直接标记DNA复制（放射性同位素标记）,统计细胞数量与标记细胞的百分比,对细胞周期进行综合分析.连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程为细胞周期(cell cyc1e)。
细胞周期包含四个阶段：①G1期(first gap),又称合成前期，指前一次有丝分裂完成到DNA复制前的一段时期；②S期(synthesis phase),即DNA合成期，为真核细胞分裂(cell pision)间期中进行DNA合成的阶段；③G2期(second gap),为DNA合成后期，指DNA合成结束至有丝分裂开始之间的一个阶段；④M期 (mitosis or pision) ,又称D期，是染色体真正开始分离时期。
细胞周期又可分为有丝分裂期（M期）和分裂间期(即G1→S→G2)两个时期。
尽管细胞周期中各期的持续时间因不同细胞类型而异，但相对而言M期最短，S期较长。
流式细胞仪（flow cytometer；FCM）的工作原理是在样品管中放入待测细胞，在气体的压力下使待测细胞进入充满鞘液的流动室。
在细胞流动室里单细胞悬液被鞘流液包绕通过流动室内一定孔径的孔，形成细胞柱。
然后通过对流动液体中单列的细胞进行逐一检测，得到单个细胞的光散射和荧光指标，在功能水平上定量分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等的物理、化学特征等多个参数。
流式细胞仪不仅可以根据不同时间内DNA含量的变化来确定细胞周期的长短，还可以直接用放射性同位素标记DNA复制，通过统计细胞数目与比较各时相细胞的百分比来检测是否达到预期目的，从而对细胞周期各时相进行综合分析。
流式细胞分析法与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，已成为当代最先进的细胞定量分析技术。
Hela细胞周期时间为21 h，其中G1期为10 h，S期为7 h，G2期为3 h，M期为1 h。
一、S期同步化方法（胸腺嘧啶核苷双阻断法，两次可让细胞同步化到G1/S期）胸腺嘧啶核苷(TdR)双阻断法：在处于对数生长期细胞的培养基中首次加入过量的DNA合成抑制剂TdR，能可逆地抑制S期细胞的DNA生成，而不作用其他细胞阶段的运转，导致大多数细胞群被同步化于G1/S期交界处，但仍有部分细胞处于S期范围；移去胸腺嘧啶核苷，细胞再培养一段比S期较长而短于G2、M、G1三期总和的时间，让它们完全越过S 期，但又不使按周期发展最快的细胞进入下一个S期。
第二次胸腺嘧啶核苷处理，当细胞继续运转至G1/S交界处时，被过量的胸腺嘧啶核苷抑制而停止。
细胞则于G1/S期边界汇集，再次撤掉胸腺嘧啶核苷，加入完全培养基，使细胞继续生长，则细胞同时启动于S 期。
5-氟脱氧尿嘧啶、羟基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、高浓度AdR和GdR等DNA合成抑制剂均可抑制DNA合成使细胞同步化，由于高浓度胸腺嘧啶核苷对S期细胞的毒性较小，因此常用胸腺嘧啶核苷双阻断法诱导细胞同步化。
其优点是同步化程度高，适用于任何培养体系。
几乎可将所有的细胞同步化，缺点是造成非均衡生长，个别细胞体积增大。
二、M期同步化方法（振荡收集法）该法利用M期细胞变圆易脱落的特点。
在处于对数增殖期的单层贴壁细胞（分裂活跃，M 期多）中加入Nocodazole。
一段时间后，多数细胞被阻滞与M期，轻轻振荡或拍击培养瓶，M期细胞则与瓶壁脱离，悬浮在培养液中，收集培养液，之后再加入新鲜培养液，按照此法继续收集，可得到一定数目的M期细胞。
振荡收集法操作简单，同步化程度高并且细胞不受药物伤害，能够真实反映细胞周期状况，缺点是由于M期较短，被分离出的细胞很少，只能应用于贴壁细胞。
收集到的有丝分裂期的细胞可以贮存在冰上，然后处理其余的培养瓶。
三.实验用品1.材料：Hela细胞。
2.试剂：0.25%胰蛋白酶液、无血清细胞培养液、DAPI试剂、Hank’s液、2mmol/L TdR、70％乙醇（保存于4℃）、RNase-A（10mg/ml,-20℃保存）、PI（650 g/ml，避光保存于-20℃）、PBS (pH 7.4保存于4℃)、秋水仙胺、秋水仙素。
3.器材：培养瓶、移液器、枪头、5ml注射器、试管、离心管、封口膜、微量移液器、Tips、烧杯、废液缸、细胞培养设备、倒置显微镜、台式离心机、水浴、4℃冰箱、二氧化碳培养箱、N2罐、流式细胞仪、超净工作台。
四.实验步骤(一)S期同步化方法（TdR双阻断法）(1) 取指数生长期细胞。
(2) 第一次阻断：将对数生长期细胞的培养基换成含2mmol/L的新鲜TdR培养液。
(3) 37℃、5%CO 二氧化碳培养箱中培养12h(4) 第一次释放：弃去含有胸腺嘧啶核苷的培养基，用Hanks液对贴壁细胞漂洗2～3次，并更换不含TdR的新鲜培养基，继续培养16h。
(5) 第二次阻断：弃去培养液，再加入浓度为2mmol/LTdR的新鲜培养基，37℃、5%CO 培养12h。
(6) 第二次释放：重复第（4）步骤，此时的细胞大部分出去G1/S期边界，同步化细胞随时间推移逐渐进入S期。
（二）M期同步化方法（振荡收集法）(1) 取生长于占瓶底面积60%～80%的细胞一瓶，轻轻摇晃或拍击培养瓶，使松动细胞脱落而悬浮在培养液中，并用离心管收集。
(2) 用Hank洗涤2次，漂洗液收集到离心管。
(3) 600rpm离心5分钟，并用培养液将细胞浓度调整为2.5×105个/ml接种于培养瓶。
(三)利用流式细胞术分析细胞周期时相(1) 将细胞传代培养至指数生长期，吸弃细胞培养上清，用Hanks液洗涤细胞一次，胰酶消化细胞，完全培养基终止，收集细胞。
1200rmp 5min离心，弃去上清。
(2) 4℃预冷的PBS漂洗细胞沉淀2次，1500rmp离心5分钟，收集细胞。
(3) 快速将细胞悬液注入预冷的70%乙醇中，封口膜封口。
4℃固定过夜（可长至2周）。
(4) 1500rmp 离心5分钟去固定液，收集固定细胞，用0.4mL PBS使细胞重悬并转至试管中吹打均匀（防止细胞破碎）。
PBS漂洗2次。
(5) 细胞染色液配制：40×加碘化丙啶（PI）母液（2 mg/ml）：100×RNA酶A母液（10 mg/ml）：1×PBS =25：10：1000。
(6) 细胞染色：根据细胞量，加入一定体积的细胞染色液（1～1.5ml）重悬，使上机时细胞通过率为200～350 Cell/s。
(7) 用300目（孔径40～50 m）的筛网过滤于流式上机管中，上机检测。
(8) 样品分析测定及打印。
(四) 秋水仙素阻抑法(1)将细胞培养至指数生长期。
(2)加入秋水仙素，使培养基最终浓度为0.25～0.5μg/mL，作用6～7小时。
(3)收集细胞，800rpm离心5～10分钟，弃去上清，沉于管底的细胞即为M期细胞。
(五)N2阻断法(1)将细胞传代培养至指数生长期。
(2)将培养瓶置于N2罐中并通入适量CO2(约相当于罐中体积的5％)。
(3)关闭N2罐，连接N2管子和压力表，慢慢向罐中充入氮气直到压力为80～90磅／英寸为止。
(4)将N2装置放在37℃培养箱中10～16小时。
次日取出，然后缓缓放出N2(最好放出窗外)。
(5)取出细胞观察同步化效果，并用振荡法收集细胞于离心管中。
(6)800rpm离心10分钟，收集细胞。
（六）G1期和G2期细胞的获得1．G2期细胞的获得根据细胞周期测定的数值，使用胸腺嘧啶核苷双阻断法使细胞同步化于G1/S期交界处后，使细胞释放胸腺嘧啶核苷后继续培养。
其培养时间应大于S期时间并小于S期与G2期总和的时间。
然后先用振荡收集法使已进入M期的细胞脱落瓶壁，弃去上清培养基；再用胰酶消化，加入新鲜培养基制成细胞悬液，离心收集细胞，即为G2期细胞。
2．G1期细胞的获得(1)向用胸腺嘧啶核苷双阻断法获得的细胞中加入一定量的培养基，继续培养大于S+G2+M期小于一个周期的时间即可获得G1期细胞。
(2)向细胞中加入缺乏异亮氨酸的培养基进行培养，培养时间超过一个细胞周期，即可获得G1期细胞。
Common methods for mammalian cell cycle synchronization.Method Synchrony inducing agent or treatment mechanism of action Cell cyclestageblockedChemical/pharmacol ogical inhibition of DNA replication/synthesis or mitotic spindle formation Lovastatin Inhibition of HMG-CoA reductase (cholesterol synthesis) and the proteasomeEarly G1 Mimosine Inhibition of thymidine, nucleotide biosynthesis, inhibition of Ctf4/chromatin binding Late G1; G1/S Thymidine TdR Excess thymidine-induced feedback inhibition of DNA replication G1/S Aphidicolin Inhibition of DNA polymerase-α and DNApolymerase-δG1/S HydroxyureaInhibition of ribonucleotide reductase G1/S ColchicineColcemideInhibition of microtubule polymerization G2/M NocodazoleInhibition of microtubule polymerization G2/M Mitogen or growthfactor withdrawalSerum starvation Growth restriction –induced quiescence G0/G1Amino acid starvation Growth restriction –induced quiescence G0/G1。