第二章细胞培养及培养细胞的特点
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细胞工程-7 细胞培养的基本概念及培养细胞的生物学特征
一、细胞培养发展简史
• 动物细胞（组织）培养技术起源于1885年，德国人 Roux 用温生理盐水在体外培养鸡胚髓板，并使之 存活了数月之久。 • 动物细胞（组织）培养的奠基人是美国生物学家 Harrison。在1907年采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴 培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，保持存 活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程。 Harrison - - isolated pieces of frog embryonic tissue known to give rise to nerve fibres - grew them in frog lymph - observed outgrowth of axons over period of weeks in 1907.
5，由于细胞培养有可能在同一时期、相同条 件、相似性状的条件下提供大量的实验样 本，所以相对耗资较少，因而也就成为生物 制品、单克隆抗体和基因工程制品生产的 重要手段。
6，细胞和组织生长在人工培养环境中，与体 内环境相比仍然存在一定的差异，培养的 细胞或组织，其形态或功能会发生不同程 度的改变。因此再利用培养细胞做实验对 象时，不能将其与体内细胞完全一样看 待，只能把它们视作一种既保持动物体内 原细胞一定的性状、结构和功能又发生某 些改变的特定的细胞群体。
四、体外培养细胞的分型
根据离体细胞在体外生长时是否贴壁的性 质，将其分为贴壁型与悬浮型两类
正常体内组织细胞类型
四、体外培养细胞的分型
贴壁型(anchorage-dependent cell)
按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型
1)成纤维细胞型 （fibroblast） 2)上皮细胞型 （epithelium） 3) 游走细胞型 （wandering） 4)多形型细胞 （polymorphic）
细胞生物学部分名词解释
脂质体（liposome）：是根据磷脂分子可在水相中自我装配成稳定的脂双层膜的球形结构的趋势而制备的人工球形脂质小囊。
膜运输蛋白：细胞膜上具有转运功能的跨膜蛋白，能选择性地使非自由扩散的小分子物质透过质膜。运输蛋白根据作用方式分成三类：载体蛋白、通道蛋白、离子泵。
Na+-K+-ATP酶：Na+-K+-ATP酶是一种离子泵，又称Na+-K+泵，是细胞膜上进行主动运输的一种载体蛋白。
第十章
有丝分裂器：中期细胞中出现的由染色体、星体、中心体及纺锤体所组成的结构，称为有丝分裂器。
减数分裂：是有性生殖的生物在生殖细胞形成过程中的一种特殊的有丝分裂方式。其二倍体原始生殖细胞内染色体复制一次之后，细胞连续分裂两次，从而使得生殖细胞中染色体数目比原始的生殖细胞中染色体数目减少了一半。
异染色质：在间期细胞中结构比较紧密，碱性染料着色较深的染色质。
核仁组织区：是指在人类染色体组中的某些染色体次缢痕处的、携带rRNA基因并可以形成核仁的部位。
多基因家族：是真核细胞基因组中来源相同、结构相似、功能相关的一组基因，是由一个祖先基因经重复和变异形成的，是真核生物基因结构中最显著的特征之一。
吞噬：指细胞在摄入直径大于1微米的颗粒物质时，细胞部分变形，使质膜凹陷或形成伪足将颗粒包裹后摄入细胞的过程。
吞饮：是指细胞在摄入溶质或液体时，胞质下陷形成一小窝，然后小窝离开质膜形成小泡，把局部的细胞外液及其溶质大分子摄入细胞内的过程。
受体介导的内吞作用：是指细胞在摄取大分子物质时，具有高度特异性的细胞表面受体与配体结合形成的复合物，通过细胞膜局部凹陷形成有被小窝、小窝与胞学：是研究细胞的结构、形态、生理功能及生活史的科学。（未作要求）
膜运输蛋白：细胞膜上具有转运功能的跨膜蛋白，能选择性地使非自由扩散的小分子物质透过质膜。运输蛋白根据作用方式分成三类：载体蛋白、通道蛋白、离子泵。
Na+-K+-ATP酶：Na+-K+-ATP酶是一种离子泵，又称Na+-K+泵，是细胞膜上进行主动运输的一种载体蛋白。
第十章
有丝分裂器：中期细胞中出现的由染色体、星体、中心体及纺锤体所组成的结构，称为有丝分裂器。
减数分裂：是有性生殖的生物在生殖细胞形成过程中的一种特殊的有丝分裂方式。其二倍体原始生殖细胞内染色体复制一次之后，细胞连续分裂两次，从而使得生殖细胞中染色体数目比原始的生殖细胞中染色体数目减少了一半。
异染色质：在间期细胞中结构比较紧密，碱性染料着色较深的染色质。
核仁组织区：是指在人类染色体组中的某些染色体次缢痕处的、携带rRNA基因并可以形成核仁的部位。
多基因家族：是真核细胞基因组中来源相同、结构相似、功能相关的一组基因，是由一个祖先基因经重复和变异形成的，是真核生物基因结构中最显著的特征之一。
吞噬：指细胞在摄入直径大于1微米的颗粒物质时，细胞部分变形，使质膜凹陷或形成伪足将颗粒包裹后摄入细胞的过程。
吞饮：是指细胞在摄入溶质或液体时，胞质下陷形成一小窝，然后小窝离开质膜形成小泡，把局部的细胞外液及其溶质大分子摄入细胞内的过程。
受体介导的内吞作用：是指细胞在摄取大分子物质时，具有高度特异性的细胞表面受体与配体结合形成的复合物，通过细胞膜局部凹陷形成有被小窝、小窝与胞学：是研究细胞的结构、形态、生理功能及生活史的科学。（未作要求）
第二章微生物纯培养
显微镜下进行。 适应于高度专业化的科学研究
毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微 生物。
显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢 子以获得纯培养。
小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在
显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的
分离。
第二章微生物纯培养
五、选择培养
为了从混杂的微生物群体中分离出某种 微生物，可以根据该微生物的特点，包括营 养、生理、生长条件等，采用选择培养的方 法进行分离。
1、涂布平板法（Spread Plate method）
步骤： 制板 稀释 加菌液 涂布 特点：简单易行，但易造成机械损伤
培养 挑菌落
第二章微生物纯培养
2、稀释倒平板法
步骤： 稀释 加菌液 浇培养基 培养
挑菌落
第二章微生物纯培养
1.取样
25g或25ml 检样
稀释样品的取样和倾注平皿
1mL
1mL
第二章微生物纯培养
2、富集培养
主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同， 制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物 旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，更 容易从混杂的群体中分离到特定的微生物。
富集条件可从多方面选择，如温度、pH、紫外 线、高压、光照、氧气、营养等等。
例如：分离产芽孢细菌，可以对样品进行高温处 理，然后再进行培养。
第二章微生物纯培养
第二章微生物纯培养
六、微生物的保藏技术
基本要求：
保证菌种经过较长时间后仍保持生活能力，防止被 杂菌污染，形态特征和生理形状尽可能不发生变异。
用于长期保藏的原始菌种称为
保藏菌种或原种（stoch culture）。
第二章微生物纯培养
毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微 生物。
显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢 子以获得纯培养。
小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在
显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的
分离。
第二章微生物纯培养
五、选择培养
为了从混杂的微生物群体中分离出某种 微生物，可以根据该微生物的特点，包括营 养、生理、生长条件等，采用选择培养的方 法进行分离。
1、涂布平板法（Spread Plate method）
步骤： 制板 稀释 加菌液 涂布 特点：简单易行，但易造成机械损伤
培养 挑菌落
第二章微生物纯培养
2、稀释倒平板法
步骤： 稀释 加菌液 浇培养基 培养
挑菌落
第二章微生物纯培养
1.取样
25g或25ml 检样
稀释样品的取样和倾注平皿
1mL
1mL
第二章微生物纯培养
2、富集培养
主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同， 制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物 旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，更 容易从混杂的群体中分离到特定的微生物。
富集条件可从多方面选择，如温度、pH、紫外 线、高压、光照、氧气、营养等等。
例如：分离产芽孢细菌，可以对样品进行高温处 理，然后再进行培养。
第二章微生物纯培养
第二章微生物纯培养
六、微生物的保藏技术
基本要求：
保证菌种经过较长时间后仍保持生活能力，防止被 杂菌污染，形态特征和生理形状尽可能不发生变异。
用于长期保藏的原始菌种称为
保藏菌种或原种（stoch culture）。
第二章微生物纯培养
《细胞生物学》笔记
《细胞生物学》笔记●第一章绪论●一、细胞学与细胞生物学发展简史●1 生物科学3个阶段以及细胞的发现●（1）三个阶段：形态描述阶段、实验室生物阶段、现代生物学阶段。
●（2）1665年胡克第一次发现植物细胞；1674年列文虎克发现红细胞。
●2 细胞学说的建立及意义●细胞学说的建立●第一阶段●1838~ 1839年，施莱登(德国)和施旺(德国)提出“细胞学说”●①所有生物都是由细胞构成的:●②每个细胞都是相对独立的单位●③已存在的细胞繁殖产生新细胞●第二阶段●1858年，德国医生和病理学家魏尔肖一细胞来自于细胞●细胞学说的意义●推进了人类对于生命的认识，推动科学的发展，与进化论和遗传学共称为生物学三大基石●二、细胞的统一性与多样性●1 细胞的基本特征●细胞的基本共性●①化学组成相似●②细胞质为膜脂-蛋白体系●③遗传装置相同●④分裂方式为一分为二●细胞是生命活动的基本单位●①构成有机体的基本单位●②代谢与功能的基本单位●③有机体生长与发育的基础●④繁殖的基本单位，遗传的桥梁●⑤生命起源的归宿，生物进化的起点●细胞的大小及其影响因素●细胞大小●高等动植物，同一器官与组织的细胞大小在一个恒定的范围之内，与物种差异无关●细胞内蛋白质与核糖体RNA的量决定细胞的大小●影响因素●信号通路中心的蛋白激酶一mTOR●细胞所处的时期●细胞核DNA的含量●2 原核细胞与真核细胞●（1）原核细胞●特点●①体积小，繁殖快，适应环境能力强●②没有生物膜系统●③基因组很小，主要遗传物质仅为一个环状DNA●④基因表达简单，没有复杂的细胞分化●⑤进化地位低●举例●支原体（最小最简单的细胞）●细菌●蓝藻●（2）真核细胞●3大基本结构系统●生物膜结构系统●①选择性物质跨膜运输与信号转导:●②双层核膜将细胞分成细胞质与细胞核，使基因精确表达:●③各细胞器相互独立,协调功能行使:●④膜上附着大量酶，催化大部分化学反应●遗传信息传递与表达系统●组分: DNA. RNA和蛋白质。
细胞生物学：第2章 细胞
细胞器
细胞核 染色体
DNA
无核膜和核仁 一个细胞只有一条 双链DNA, DNA不与或 双链DNA, DNA不与或 很少与组蛋白结合 环状， 环状，存在于细胞质
很长的线状分子， 很长的线状分子，含有 很多非编码区， 很多非编码区，并被核 膜所包裹。 膜所包裹。 21
§3.真核细胞基本知识概要
◆基本结构体系 ◆细胞的大小与分析 ◆细胞形态结构与功能的关系 ◆植物细胞与动物细胞的比较
9
病毒与细胞在起源与进化中的关系
病毒是非细胞形态的生命体，它的主要生命活动必 须要在细胞内实现。病毒与细胞在起源上的关系， 目前存在3种主要观点： 生物大分子→病毒→细胞 病毒 生物大分子 细胞 生物大分子→细胞→病毒
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§3.原核细胞
（Prokaryotic Cells） ）
◆没有明显可见的细胞核,同时也没有核膜和 没有明显可见的细胞核, 核仁,只有拟核，进化地位较低。 核仁,只有拟核，进化地位较低。 ◆原核细胞的基本特点: 原核细胞的基本特点: 遗传信息量少; ■遗传信息量少; 内部结构简单, ■内部结构简单,特别是没有分化为以 膜为基础的专门结构和功能的细胞器和细 胞核膜。 胞核膜。
遗传信息表达系统
该系统又称为颗粒纤维结构系统， 该系统又称为颗粒纤维结构系统， 该系统包括细胞核和核糖体。 该系统包括细胞核和核糖体。
27
纤 维 结 构
28
颗 粒 结 构
29
细胞骨架系统
细胞骨架是蛋白与蛋白搭建起的网络结构, 细胞骨架是蛋白与蛋白搭建起的网络结构, 包括细胞质骨架和细胞核骨架。 包括细胞质骨架和细胞核骨架。 细胞骨架系统首要作用是维持细胞的一 定形态； 定形态； 细胞内物质运输的动脉； 细胞内物质运输的动脉； 细胞内基质区域化； 细胞内基质区域化； 帮助细胞移动或行走； 帮助细胞移动或行走； 主要成分:微管、微丝和中间纤维 主要成分:微管、微丝和中间纤维。
第二章 细胞工程-【必背知识】2021-2022学年高二生物章节知识清单人教版2019选择性必修3
新人教版生物学选择性必修3《生物技术与工程》知识梳理第二章 细胞工程 第一节 植物细胞工程细胞工程： 细胞工程是指应用细胞生物学 、分子生物学 和发育生物学 等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平上的操作，有目的地获得 特定的细胞、组织、器官、个体 或其产品的一门综合性生物工程。
1．原理和方法：细胞 生物学和分子 生物学。
2．操作水平：细胞 水平或细胞器 水平。
3．目的：按照人的意愿来改变细胞内的遗传物质 或获得细胞产品 。
一、植物细胞工程的基本技术1. 细胞的全能性：细胞经_分裂_和_分化_后，仍然具有_产生完整生物体_或__分化成其他各种细胞__的_潜能_，即细胞具有_全能性_。
2. 细胞具有全能性的原因（物质基础）生物体的细胞中都含有该物种的全套遗传物质_，都有_发育成为完整个体所需的全部遗传信息_。
1. 生物体生长发育过程中细胞不表现全能性的原因（不离体的细胞无法表现出全能性的原因） 在特定的时间时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性地表达 2. 全能性大小比较（1）受精卵、体细胞、生殖细胞 __受精卵＞生殖细胞＞体细胞____（2）分化程度高的细胞、分化程度低的细胞__分化程度低的细胞＞分化程度高的细胞_____ （3）分裂能力强的细胞、分裂能力弱的细胞 __分裂能力强的细胞＞分裂能力弱的细胞____ （4）植物细胞、动物细胞__植物细胞＞动物细胞__________ （5）幼嫩的细胞、衰老的细胞__幼嫩的细胞＞衰老的细胞____ （一）植物组织培养技术1. 概念：植物组织培养是指将_离体_的植物_器官__、_组织_或_细胞_（称为_外植体_）等，培养在人工配制的_培养基_上，给予_适宜的培养条件_，诱导其形成__完整植株_的技术。
2. 原理：__植物细胞的全能性__3. 生殖方式：_无性生殖__4. 分裂方式：__有丝分裂__5. 过程：外植体――愈伤组织―再分化胚状体或丛芽――→发育植株脱分化：在一定的_激素_和_营养_等条件的_诱导_下，_已经分化_的细胞_失去其特有的结构和功能__，转变成_未分化的细胞__的过程。
第二章--微生物的纯培养和显微技术
第二节 显微镜和显微技术
一、显微镜的种类及其原理 二、显微观察样品的制备 三、显微镜下的微生物
几个基本概念：
一、显微镜的种类及原理
1.普通光学显微镜（复式显微镜）
机械装置: 镜座、支架、载物台、调焦螺旋等 光学系统: 物镜、目镜、聚光镜等
使用油镜时加镜油的目的: (1)增加照明亮度 (2)增加显微镜的分辨率
细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线 照射后可激发荧光；另有一些物质本身虽 不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗 体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧 光显微镜就是对这类物质进行定性和定量 研究的工具之一
105
荧 光 显 微 镜 观 察
5、 透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM)
原理：用一束电子作为它的能源，电子的波长很短，能够 检测极细微的物体，如病毒和分子。
应用：通过细胞超薄切片，观察细胞内部的详细结构如细 胞膜、细胞核等。（可放大几万倍）
6、 扫描电子显微镜（scanning electron microscope, SEM)
原理：类似于电视或电传真照片。即利用电子“探针”，在 样品表面进行“扫描”，激发样品表面放出二次电子，二次电子由 探测器收集，并转变为光信号。
光学显微镜
光学理论依据
德国理学家Ernst Abbe，在19世纪70年代建立的 在Abbe的公式中，两物体之间的最小可分辨距 离被称为最小距离（d）
最小距离=0.5/nsin= 0.5/NA
分辨率（R) ∝ 1/d
分辨率(最小可分辨距离)=0.5λ∕ n sinθ = λ∕2NA
波长与分辨率
高压蒸汽灭菌锅
2、接种操作
接种工具： 白金or镍铬合金接种针/环
植物组织培养第二章
（三）Байду номын сангаас细胞胚胎发生的基因表达机理（略）
二、植物体细胞胚胎发生途径
（一）体细胞胚胎发生的方式 由外植体诱导体细胞胚胎发生的途径有两种： 直接途径和间接途径。 直接途径：从外植体某些部位的胚性细胞直接 诱导分化出体细胞胚胎。这种“胚性细胞”是在胚 胎发生之前就已决定了的。 间接途径：外植体先脱分化形成愈伤组织， 在从愈伤组织的某些细胞，即重新决定为胚性细胞 的细胞分化出体细胞胚胎，多数体细胞胚胎的形成 是通过间接途径产生的。
植物愈伤组织的培养
愈伤组织培养是指将母体植株上的各个部分切下，形成 外植体，接种到无菌的培养基上，进行愈伤组织诱导、生长 和发育的一门技术。 一般情况下，植物组织均能诱发形成愈伤组织，由外植 体形成愈伤组织，标志着植物离体培养的开始。
差异：（1） 受精卵的全能性最高 （2） 受精卵分化 后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。 潜在全能性的原因：基因表达的选择性
科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一 定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就 可能表现出全能性，发育成完整的植株。 人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。
三、植物体细胞胚胎发生的极性和生理隔离
体细胞胚胎具有两个明显特点： 1、双极性 2、与母体组织或外植体的维管束系统无直接联系，处于较为 孤立的状态，即存在生理隔离。
（一）体细胞胚胎发生的极性
单个胚性细胞与合子胚一样，具有明显的极性，第一次 分裂多为不均等分裂，顶细胞继续分裂形成多细胞原胚，基 细胞进行少数几次分裂形成胚柄。 （二）体细胞胚胎发生的生理隔离
第二章
植物组织培养的基本原理
植物细胞全能性理论是植物组织培养的核 心理论。 离体细胞具有生命的特征属性，在全能性的 基础上，提供合适的营养和环境条件，离体细 胞经历脱分化和再分化过程
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如：真正的成纤维细胞、心肌、平滑肌、 成骨细胞，血管内皮。 形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出2—3个长短不等的突起 中有卵圆形核
生长特点
排列成放射状，漩 涡状，并不紧靠 连成片，细胞— 细胞接触易断开 而单独行动。
游离的单独的成 纤维样细胞，常 有几个伸长的细 胞突起。
体外培养细胞类型（2）——成纤维细胞型
❖ 游走细胞型
❖ 细胞质常伸出伪足或突起，呈活跃的游走 或变形运动， 贴附于支持物上散在生长，一 般不连接成片。该类细胞形状很不稳定，有 时与上皮样细胞 或成纤维细胞难以区别。单 核细胞、巨噬细胞及某些肿瘤细胞在体外培 养时常呈现此种形态。
❖ 多形型细胞
❖ 生长时像神经细胞那样呈多角形，并伸出 较长的神经纤维，很难确定它们的形状，因 而我们将此类细胞称为多形型细胞。体外培 养时常见的多形型细胞是神经元和神经胶质 细胞。
细胞培养：将组织块用机械方法或酶解法分离成单个 细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单层细胞 生长，或在培养液中呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养。
器官培养：所谓器官培养，是指采取某些措施使器官 的原基、器官的一部分或整个器官在体外存活、生长，并 保持其原有结构和功能的培养技术称为器官培养。
体 外 培 养 的 种 类
如：皮肤及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤
形态：类似体内的上皮细胞 扁平，不规则多角形，中有圆形核
生长特点
易相连成片， 相靠紧密相连， 成薄层铺石状。
生长时呈膜状 移动，很少脱离 细胞群而单个活动
体外培养细胞类型（1）——上皮细胞型
成纤维细胞型
名称：凡在培养中形态与成纤维细内、外的粘附方式：存在差异
体内：粘附是全方位 外形具有复杂的立体特征
体外：多数情况，细胞只有一个附着平面 外形一般与体内时明显不同
按照培养细胞粘附生长时的主要形态，可分为 4大类型
分类
根据形态大致的不同，主要4类：
上皮细胞型 成纤维细胞型 游走细胞性 多形型细胞
上皮细胞型
名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于。 来源：来源于外胚层，内胚层细胞
细胞密度 3T3 低密度
成纤维细胞样
标准pH 上皮样细胞 高密度 上皮样细胞
生长状态改变 悬浮或贴附 悬浮
圆形
转化与否 未转化
成纤维样
贴附 成纤维或上皮样
转化后 可成上皮样
悬浮生长型
概念 培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械 方法使保持悬浮状态下生长
来源 自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞。癌、肿细胞 也可能
贴附(粘附)型细胞
粘附:是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在 方式
结果：基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织， 有机体的绝大多数细胞必须粘附于一固相表面才能生存和 生长。
培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某 一固相表面才能生存和生长，因而属于粘附型细胞。
粘附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有粘附于固相表面才能 生存的细胞。
2．脱分化或去分化(Dedifferentiation) 细胞也可能出现脱分化或去分化，即细胞失掉发生分化
的能力。
二、培养细胞形态分类
体外细胞培养物的生长类型
按生长方式分为两种类型
贴附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。 悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下 即可生长的细胞。 绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，只有少数细胞类 型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。
❖ （二）细胞性别
❖ 在23对染色体中有一对性染色体，女性的两个X 染色体中有一个在间期呈明显的异固缩状态，呈半 月形或三角形小体，称Barr小体，紧贴在核膜内面。 男性Y染色体在间期形成颗粒状Y小体，位于胞核近 中央位。培养细胞的细胞核超微结构与体内细胞无 大差别，仍保持性别特征，尤其原代培养细胞易于 显示，用特殊染色法均可观察到Barr小体和Y小体。
六、体外培养细胞的生存环境
❖ （一）无污染环境 ❖ 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在
体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于 缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物 或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致 细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保 持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。
但, 人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同， 当细胞被置于体外培养后,生活在缺乏动态平衡的环境 中,久了，必然发生变化。
因此，对于体外培养的细胞，应该把他们视作一种 既能保持动物体内原细胞一定的性状、结构和功能又 具有某些改变的特定的细胞群体，而不能将之与体内 的细胞完全等同。
第二节 细胞培养的细胞生物学
❖ （二）温度
❖ 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜 的温度。
❖ 指数增生期：又称对数期。此期细胞增殖旺 盛，成倍增长，活力最佳，适用于进行实验 研究。细胞生长增殖状况可以细胞倍增情况 （细胞群体倍增时间）及细胞分裂指数等来 判断。在此阶段，若细胞处于理想的培养条 件，将不断生长繁殖，细胞数量日渐增加。 细胞将接触而连成一片，渐次长满培养器皿 底面，提供细胞生长的区域逐渐减少甚至消 失。因接触抑制而细胞运动停止、密度抑制 而细胞终止分裂。
❖ 1、体外培养的细胞，尤其是反复传代、长期 培养者，有可能发生染色体非二倍体改变等 情况。
❖ 2、 细胞培养对人员、设备等条件都要求较 高。这些都影响细胞培养技术的更广泛应用。
❖ 3、 动物细胞的培养对营养的要求较高。
❖ 4、动物细胞培养的另一个突出特点，是对环 境条件要求严格。
正确认识：现在人工模拟体内环境的技术已经很高,
特点 在悬浮中生长良好，细胞圆形，单个或小细胞团
优点
生存空间大，提供数量大 传代方便(不需消化) 易于收获 可获得稳定状态 缺点 观察不方便 很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)
三、培养细胞的生长特点
（一）贴附 （二）接触抑制 （三）密度抑制
四、培养细胞的生长和增殖过程
（一）单个细胞的生长过程
特点：细胞呈活 跃移动，可见细 胞分裂，但不旺 盛。与 体内原组织在形 态结构和功能活 动上相似性大。
传代期：
传代：体内细胞生长在动态 平衡环境中，而组织培养细胞 的生存环境是培养瓶、皿或其 它容器，生存空间和营养是有 限的。当细胞增殖达到一定密 度后，则需要分离出一部分细 胞和更新营养液，否则将影响 细胞的继续生存，这一过程叫 传代。初代培养的细胞一经传 代后便改称做细胞系。
一、体内外细胞的差异及分化
（一）体内外细胞的差异
培养细胞最多见的表现是：失去原有组织结构和细胞 形态，分化减弱或不显，出现类似“反祖” 现象；表现为 细胞趋单一化，或获得不死性，或变成具有恶性性状的细 胞群。
1.与体内主要不同
相对孤立、相对单一，缺乏体内的系统作 用，失去神经体液的调节和细胞相互间的影响。
二、细胞培养的优点
1.研究的对象是活细胞
在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活 力，并可长时间监控、检测甚至定量评估一部分 活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命 活动等。
2. 研究条件可以人为控制
可以根据需要，控制包括pH、温度、氧气、 二氧化碳、张力等物理化学的条件，同时，可以 施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实 验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。
特点：在全生命期中此期的 持续时间最长，细胞增殖旺 盛，并能维持二倍体核型。
衰退期：
特点：此期 细胞仍然生存， 但增殖很慢或 不增殖，最后 衰退凋亡。
（三）体外培养细胞一代生存期
所谓细胞的“一代”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。
潜伏期 指数增生期 停止期
❖ 潜伏期：包括悬浮期及潜伏期。当细胞接种 入新的培养器皿，不论是何种细胞类型、其 原来的形态如何，此时细胞的胞质回缩，胞 体均呈圆球形。先悬浮于培养液中，短时间 后，那些尚可能存活的细胞，即开始附着于 底物，并逐渐伸展，恢复其原来的形态。再 经过一潜伏期，此时细胞已存活，具有代谢 及运动但尚无增殖发生。以后出现细胞分裂 并逐渐增多而进入指数生长期。
组织培养这一名词实际上是一个通用名词，其实际内容 根据培养物的不同可概括为三个不同概念：
组织培养：将活体的一小片组织放在盛有培养液的 玻璃或塑料培养器皿中，待组织块粘着后，沿底面平面 移动生长的过程称为组织培养。从组织块中生长出来的 仍然是细胞，细胞在生长的同时也发生移动，至使组织 中的培养难以长时间维持其原有结构，结果也就成了细 胞培养。
贴附生长型的培养特点
1. 与体内同名的细胞不完全相同 如：形态相似的成纤维细胞，可不同来源。 自同一动物不同组织的成纤维样细胞相 似但发展趋向不同
2.培养细胞的形态不稳定 条件改变，细胞形态可能有变化
培养细胞形态不稳定
血清 Hela
高血清
低血清
成纤维细胞样 上皮样细胞
pH Hela
太酸或太碱
成纤维细胞样
细胞工程的研究范畴
•细胞与组织培养 • 细胞融合 • 细胞核移植 • 染色体工程 • 胚胎工程 • 干细胞与组织工程 • 转基因生物与生物反应器
第二章 细胞培养 及培养细胞的生物学特点
第一节 组织培养(tissue culture)
一、组织培养的基本概念
组织培养（tissue culture）习惯上泛指所有的体外培 养，即器官培养、组织培养和细胞培养的总称。其本意是 指从活的机体中取出组织或细胞，模拟机体内生理条件， 在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生 存，并维持其结构和功能的技术称为组织培养。
记录: 摄影照片、缩时电影、电视
5.研究的范围比较广泛
学科多：病毒学、免疫学、肿瘤学、遗传学、临床 医学等
对象广： 各种动物：低等动物、高等动物、人类 一种动物：不同年龄、不同组织、正常或 异常（肿瘤）
生长特点
排列成放射状，漩 涡状，并不紧靠 连成片，细胞— 细胞接触易断开 而单独行动。
游离的单独的成 纤维样细胞，常 有几个伸长的细 胞突起。
体外培养细胞类型（2）——成纤维细胞型
❖ 游走细胞型
❖ 细胞质常伸出伪足或突起，呈活跃的游走 或变形运动， 贴附于支持物上散在生长，一 般不连接成片。该类细胞形状很不稳定，有 时与上皮样细胞 或成纤维细胞难以区别。单 核细胞、巨噬细胞及某些肿瘤细胞在体外培 养时常呈现此种形态。
❖ 多形型细胞
❖ 生长时像神经细胞那样呈多角形，并伸出 较长的神经纤维，很难确定它们的形状，因 而我们将此类细胞称为多形型细胞。体外培 养时常见的多形型细胞是神经元和神经胶质 细胞。
细胞培养：将组织块用机械方法或酶解法分离成单个 细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单层细胞 生长，或在培养液中呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养。
器官培养：所谓器官培养，是指采取某些措施使器官 的原基、器官的一部分或整个器官在体外存活、生长，并 保持其原有结构和功能的培养技术称为器官培养。
体 外 培 养 的 种 类
如：皮肤及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤
形态：类似体内的上皮细胞 扁平，不规则多角形，中有圆形核
生长特点
易相连成片， 相靠紧密相连， 成薄层铺石状。
生长时呈膜状 移动，很少脱离 细胞群而单个活动
体外培养细胞类型（1）——上皮细胞型
成纤维细胞型
名称：凡在培养中形态与成纤维细内、外的粘附方式：存在差异
体内：粘附是全方位 外形具有复杂的立体特征
体外：多数情况，细胞只有一个附着平面 外形一般与体内时明显不同
按照培养细胞粘附生长时的主要形态，可分为 4大类型
分类
根据形态大致的不同，主要4类：
上皮细胞型 成纤维细胞型 游走细胞性 多形型细胞
上皮细胞型
名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于。 来源：来源于外胚层，内胚层细胞
细胞密度 3T3 低密度
成纤维细胞样
标准pH 上皮样细胞 高密度 上皮样细胞
生长状态改变 悬浮或贴附 悬浮
圆形
转化与否 未转化
成纤维样
贴附 成纤维或上皮样
转化后 可成上皮样
悬浮生长型
概念 培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械 方法使保持悬浮状态下生长
来源 自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞。癌、肿细胞 也可能
贴附(粘附)型细胞
粘附:是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在 方式
结果：基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织， 有机体的绝大多数细胞必须粘附于一固相表面才能生存和 生长。
培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某 一固相表面才能生存和生长，因而属于粘附型细胞。
粘附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有粘附于固相表面才能 生存的细胞。
2．脱分化或去分化(Dedifferentiation) 细胞也可能出现脱分化或去分化，即细胞失掉发生分化
的能力。
二、培养细胞形态分类
体外细胞培养物的生长类型
按生长方式分为两种类型
贴附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。 悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下 即可生长的细胞。 绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，只有少数细胞类 型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。
❖ （二）细胞性别
❖ 在23对染色体中有一对性染色体，女性的两个X 染色体中有一个在间期呈明显的异固缩状态，呈半 月形或三角形小体，称Barr小体，紧贴在核膜内面。 男性Y染色体在间期形成颗粒状Y小体，位于胞核近 中央位。培养细胞的细胞核超微结构与体内细胞无 大差别，仍保持性别特征，尤其原代培养细胞易于 显示，用特殊染色法均可观察到Barr小体和Y小体。
六、体外培养细胞的生存环境
❖ （一）无污染环境 ❖ 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在
体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于 缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物 或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致 细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保 持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。
但, 人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同， 当细胞被置于体外培养后,生活在缺乏动态平衡的环境 中,久了，必然发生变化。
因此，对于体外培养的细胞，应该把他们视作一种 既能保持动物体内原细胞一定的性状、结构和功能又 具有某些改变的特定的细胞群体，而不能将之与体内 的细胞完全等同。
第二节 细胞培养的细胞生物学
❖ （二）温度
❖ 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜 的温度。
❖ 指数增生期：又称对数期。此期细胞增殖旺 盛，成倍增长，活力最佳，适用于进行实验 研究。细胞生长增殖状况可以细胞倍增情况 （细胞群体倍增时间）及细胞分裂指数等来 判断。在此阶段，若细胞处于理想的培养条 件，将不断生长繁殖，细胞数量日渐增加。 细胞将接触而连成一片，渐次长满培养器皿 底面，提供细胞生长的区域逐渐减少甚至消 失。因接触抑制而细胞运动停止、密度抑制 而细胞终止分裂。
❖ 1、体外培养的细胞，尤其是反复传代、长期 培养者，有可能发生染色体非二倍体改变等 情况。
❖ 2、 细胞培养对人员、设备等条件都要求较 高。这些都影响细胞培养技术的更广泛应用。
❖ 3、 动物细胞的培养对营养的要求较高。
❖ 4、动物细胞培养的另一个突出特点，是对环 境条件要求严格。
正确认识：现在人工模拟体内环境的技术已经很高,
特点 在悬浮中生长良好，细胞圆形，单个或小细胞团
优点
生存空间大，提供数量大 传代方便(不需消化) 易于收获 可获得稳定状态 缺点 观察不方便 很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)
三、培养细胞的生长特点
（一）贴附 （二）接触抑制 （三）密度抑制
四、培养细胞的生长和增殖过程
（一）单个细胞的生长过程
特点：细胞呈活 跃移动，可见细 胞分裂，但不旺 盛。与 体内原组织在形 态结构和功能活 动上相似性大。
传代期：
传代：体内细胞生长在动态 平衡环境中，而组织培养细胞 的生存环境是培养瓶、皿或其 它容器，生存空间和营养是有 限的。当细胞增殖达到一定密 度后，则需要分离出一部分细 胞和更新营养液，否则将影响 细胞的继续生存，这一过程叫 传代。初代培养的细胞一经传 代后便改称做细胞系。
一、体内外细胞的差异及分化
（一）体内外细胞的差异
培养细胞最多见的表现是：失去原有组织结构和细胞 形态，分化减弱或不显，出现类似“反祖” 现象；表现为 细胞趋单一化，或获得不死性，或变成具有恶性性状的细 胞群。
1.与体内主要不同
相对孤立、相对单一，缺乏体内的系统作 用，失去神经体液的调节和细胞相互间的影响。
二、细胞培养的优点
1.研究的对象是活细胞
在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活 力，并可长时间监控、检测甚至定量评估一部分 活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命 活动等。
2. 研究条件可以人为控制
可以根据需要，控制包括pH、温度、氧气、 二氧化碳、张力等物理化学的条件，同时，可以 施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实 验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。
特点：在全生命期中此期的 持续时间最长，细胞增殖旺 盛，并能维持二倍体核型。
衰退期：
特点：此期 细胞仍然生存， 但增殖很慢或 不增殖，最后 衰退凋亡。
（三）体外培养细胞一代生存期
所谓细胞的“一代”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。
潜伏期 指数增生期 停止期
❖ 潜伏期：包括悬浮期及潜伏期。当细胞接种 入新的培养器皿，不论是何种细胞类型、其 原来的形态如何，此时细胞的胞质回缩，胞 体均呈圆球形。先悬浮于培养液中，短时间 后，那些尚可能存活的细胞，即开始附着于 底物，并逐渐伸展，恢复其原来的形态。再 经过一潜伏期，此时细胞已存活，具有代谢 及运动但尚无增殖发生。以后出现细胞分裂 并逐渐增多而进入指数生长期。
组织培养这一名词实际上是一个通用名词，其实际内容 根据培养物的不同可概括为三个不同概念：
组织培养：将活体的一小片组织放在盛有培养液的 玻璃或塑料培养器皿中，待组织块粘着后，沿底面平面 移动生长的过程称为组织培养。从组织块中生长出来的 仍然是细胞，细胞在生长的同时也发生移动，至使组织 中的培养难以长时间维持其原有结构，结果也就成了细 胞培养。
贴附生长型的培养特点
1. 与体内同名的细胞不完全相同 如：形态相似的成纤维细胞，可不同来源。 自同一动物不同组织的成纤维样细胞相 似但发展趋向不同
2.培养细胞的形态不稳定 条件改变，细胞形态可能有变化
培养细胞形态不稳定
血清 Hela
高血清
低血清
成纤维细胞样 上皮样细胞
pH Hela
太酸或太碱
成纤维细胞样
细胞工程的研究范畴
•细胞与组织培养 • 细胞融合 • 细胞核移植 • 染色体工程 • 胚胎工程 • 干细胞与组织工程 • 转基因生物与生物反应器
第二章 细胞培养 及培养细胞的生物学特点
第一节 组织培养(tissue culture)
一、组织培养的基本概念
组织培养（tissue culture）习惯上泛指所有的体外培 养，即器官培养、组织培养和细胞培养的总称。其本意是 指从活的机体中取出组织或细胞，模拟机体内生理条件， 在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生 存，并维持其结构和功能的技术称为组织培养。
记录: 摄影照片、缩时电影、电视
5.研究的范围比较广泛
学科多：病毒学、免疫学、肿瘤学、遗传学、临床 医学等
对象广： 各种动物：低等动物、高等动物、人类 一种动物：不同年龄、不同组织、正常或 异常（肿瘤）