PCR技术与DNA复制的比较
新人教《生物技术与工程》高考总复习：第7讲 重点研究“基因工程操作中限制酶的选择和PCR技术”
答案：(1)EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ、Sma Ⅰ和EcoR Ⅴ (2)磷酸二 酯键 (3)自我复制 一个至多个限制酶切割位点 用含有该抗生素的培养基培养 宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 (4)位于基因首端的一段特 殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
同。而扩增后的产物中可能含有MunⅠ 和 XhoⅠ 的识别位点，故在引物末端添加限
制酶的识别序列不能被限制酶MunⅠ和Xho Ⅰ所识别，故应该选用添加限制酶 EcoRⅠ和限制酶SalⅠ识别序列，据图中对限制酶的注释可知，限制酶MunⅠ与限 制酶EcoRⅠ 识别并切割后的黏性末端相同，故 R 末端添加的序列所对应的限制酶 是EcoRⅠ，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ；荧光蛋白基因中含 有限制酶EcoRⅠ的识别位点，故对载体使用限制酶MunⅠ 和XhoⅠ 切割。综上所 述，对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割，对扩增后的产物选用添加限制酶EcoR Ⅰ和限制酶SalⅠ识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；
项目 已知序列
PCR引物
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中 (虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是________。
A．5′AACTATGCG……AGCCCTT3′ B．5′AATTCCATG……CTGAATT3′ C．5′GCAATGCGT……TCGGGAA3′ D．5′TTGATACGC……CGAGTAC3′
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加 限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是______， 在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构 建完成的整个过程共需要________种酶。
高中生物第3章基因工程第节基因工程的基本操作程序教案选择性3
第2节基因工程的基本操作程序课标内容要求核心素养对接阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
1。
科学思维：结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。
2．科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
一、目的基因的筛选与获取1．目的基因(1）概念:用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2）实例:培养转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因.2．筛选合适的目的基因(1)较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
（2)实例:在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物—-Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。
（3)认识基因结构和功能的技术方法：DNA测序技术、遗传序列数据库、序列比对工具。
3．利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术.(2）条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶。
（3)过程：①变性：温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA受热变性后解为单链.②复性：温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下加到引物的3′端合成子链.④重复循环多次。
（4）结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n)。
二、基因表达载体的构建1．构建基因表达载体的目的(1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2）使目的基因能够表达和发挥作用。
2．基因表达载体的组成[填图］3．基因表达载体的构建首先用一定的限制酶切割载体,使它出现一个切口，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因的DNA片段,再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。
高中生物中图版(2023)生物技术实践第六单元蛋白质和DNA技术 第6章第2节
第二节DNA片段的扩增——PCR技术一、DNA在细胞内的复制1．所需的酶：解旋酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶等。
2．引物：一段RNA。
3．原料：四种脱氧核苷酸。
4．原则：碱基互补配对原则。
二、PCR技术的过程1．把PCR缓冲液、DNA模板、一对引物、四种脱氧核苷酸、DNA聚合酶、Mg2＋等成分加入到微量离心管中。
2．把离心管置于95℃的高温中，使DNA碱基对之间的氢键断裂，DNA双链拆开成为两条单链。
3．将离心管置于55℃的环境中，使一对引物分别结合到两条分开的模板链上。
4．再将离心管转置于72℃的环境中，在DNA聚合酶的催化下，游离的脱氧核苷酸从引物的一端进行顺次连接，从而形成两条新的子链。
这样高温变性、低温复性和中温延伸三个步骤便构成了PCR过程的一个循环。
三、实验操作1．准备(1)为了避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的离心管、吸头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。
(2)如果没有PCR仪，可以设置3个恒温水浴锅，温度分别为95℃、55℃和72℃，然后按要求在3个水浴锅中来回转移PCR的微量离心管即可。
2．扩增3．检测利用DNA在260nm的紫外线波段的吸收值曲线来测定相应含量。
即：DNA的浓度(μg/mL)＝错误!×稀释倍数。
预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中问题1问题2问题3问题4一、DNA复制(体内)与PCR技术(体外)体内复制PCR反应不同点解旋在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开加热至95 ℃左右，双链全部解开，不需解旋酶引物一小段RNA 单链DNA分子片段合成子链在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72 ℃特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增TaqDNA聚合酶不需要需要循环次数受生物体自身控制30多次温度体内温和条件高温(可变)相同点①需提供DNA复制的模板②四种脱氧核苷酸为原料③都需要一定的缓冲溶液④子链延伸的方向都是从5′端到3′端①解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键。
生物选修3基因工程知识点归纳
AGGTCACGTCG TCCAGTGCAGC AGGUCACGUCG
RNA聚合酶
RNA聚合酶
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非编码区
真核细胞的基因结构
编码区
非编码区
编码区下游
RNA聚合酶
结合位点 外显子
内含子
(能编码蛋白质) (不能编码蛋白质)
调控遗传信息的表达 (调控序列)
精品课件
6. 原核生物与真核生物基因结构的主要区别是什么？
不一定
13.将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，需要什么工具？
14.DNA连接酶的作用是什么？ DNA连接酶可将__双__链__D_N_A_片__段__之间的缝隙“缝合”起来，
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的__磷__酸__二__酯__键__。
精品课件
15.互补的黏性末端之间的碱基对间的氢键的恢复，与酶有关吗？ 无关 16.DNA连接酶对所连接的DNA片段的碱基序列有严格要求吗？ 没有 17.DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？
不需要
构建基因表达载体 连接滞后链上的 冈崎片段
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蛋白质
将单个脱氧核苷酸 合成互补子链
需要
PCR技术需要耐高温的 DNA聚合酶，即Taq酶 将游离脱氧核苷酸连接 到引物，形成互补子链
20.能否把目的基因直接导入受体细胞？需要什么工具？
21.载体的作用是什么？
① 作为运载工具，将外源基因转移到受体细胞中去； ② 使外源基因能在受体细胞内稳定保存、复制和表达。
14.进行PCR时，怎样使DNA双链解开？
利用DNA的热变性原理
在80℃-100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构解体，双链分开
精品课件
15.高温解决了打开双链的问题，但怎样解决DNA聚合酶失活的问题？ 需要一种耐高温的DNA聚合酶，即Taq酶（70℃-75℃）
新教材高中生物第3章基因工程 基因工程的基本工具与聚合酶链式反应PCR技术教师用书苏教版选择性必修3
第一节基因工程及其技术第1课时基因工程的基本工具与聚合酶链式反应(PCR)技术课标内容要求核心素养对接1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。
2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
生命观念：掌握基因工程的基本工具的种类及作用,并能说出它们在基因工程中的应用。
科学思维：掌握PCR技术的过程与原理,并能正确比较PCR技术与体内DNA复制的异同。
社会责任：通过了解基因工程的发展历程,认同新技术的发展是一代又一代科学家前赴后继努力的结果,并会给人类发展带来巨大的经济效益和社会效益。
一、基因工程是在多学科基础上发展而来的1957年：科恩伯格等首次发现DNA聚合酶。
↓1967年：罗思和海林斯基等发现运转工具质粒,同年,科学家发现DNA连接酶。
↓1970年：特明和巴尔的摩各自在RNA病毒中发现逆转录酶。
史密斯等人分离到限制性内切核酸酶。
↓1972年科学家伯格领导的研究小组完成了世界上首次DNA分子体外重组。
↓1973年科学家科恩领导的研究小组利用大肠杆菌质粒进行了另一个体外重组DNA分子实验。
↓接着,科恩和美国博耶证明真核生物的基因可以在原核生物中进行表达。
↓1976年,科学家用质粒为载体,将生长激素释放抑制因子基因转入大肠杆菌,1977年首次生产出治疗肢端肥大症、巨人症的生长激素释放抑制因子。
↓1977年桑格测定了一种噬菌体的基因组序列,这是人类首次对完整基因组的核苷酸顺序进行测定。
二、基因工程的基本工具1．基因工程(1)概念：又称为DNA重组技术,是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法,将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA,然后导入受体细胞,并使其在受体细胞中表达,产生人类需要的基因产物的技术。
(2)原理：基因重组。
(3)操作水平：基因(分子)水平。
2．“分子剪刀”——限制性内切核酸酶(限制酶)(1)作用：识别DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列,并使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
PCR技术
探究点三 PCR 扩增技术1．简述PCR 原理。
2．补充完整PCR 的反应过程(1)________：当温度上升到90℃以上时，双链DNA 解聚为单链，如下图：(2)________：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合，如下图：(3)________：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A ，T ，C ，G)在________________的作用下，根据________________原则合成新的DNA 链，如下图：思维拓展1．DNA 复制需要引物的原因：DNA 聚合酶不能从头开始合成DNA ，而只能从3′端延伸DNA 链。
2．PCR 结果：(1)PCR 一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、复性、延伸三步。
(2)两引物之间的固定长度的DNA 序列呈指数扩增。
3．细胞内DNA 复制与PCR 技术的比较细胞内DNA 复制 PCR不 同点 解旋 在解旋酶的作用下边解旋边复制 80℃～100℃高温解旋，双链完全分开 酶 DNA 解旋酶、DNA 聚合酶 Taq DNA 聚合酶引物 RNA DNA 或RNA温度 体内温和条件 高温相同 点 ①需提供DNA 复制的模板；②四种脱氧核苷酸作原料；③子链延伸的方向都是从5′端到3′端探究示例3 近十年来，PCR 技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用DNA 半保留复制，在试管中进行DNA 的人工复制(如图)，在很短的时间内，将DNA 扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。
(1)加热使DNA 双链打开，这一步是打开________键，称为________，细胞中是在________的作用下使此键断裂的。
(2)当温度降低时，引物与模板______端结合，在DNA 聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最终合成2个DNA 分子，此过程中原料是________，遵循的原则是______________。
DNA复制与转录、翻译、PCR的区别
脱氧核苷酸连接到模板链上，并使脱氧核苷酸之间过磷酸二酯键连接；3、沿着模板链不断延伸，最终形成两个一模一样的DNA分子。
补配对原则，游离的核糖核苷酸与脱氧核苷酸配对，3、核糖核苷酸间通过磷酸二酯键连接成RNA（mRNA，tRNA，rRNA）体．另一端的反密码子与mRNA上的密码子配对，两氨基酸间形成肽键。
核糖体继续沿mRNA移动，每次移动一个密码子，至终止密码结束，肽链形成解开的两条链分别与引物结合；3、延伸：在Taq酶的作用下，按碱基互补配对原则，脱氧核苷酸之间过磷酸二酯键连接成新链。
重复上述三步，就能获得大量的目的基因。
模板去向复制后，模板链与新形成的子链形成双螺旋结构转录后，模板链与非模板链重新形成双螺旋结构分解成核糖核苷酸扩增后，模板链与新合成的子链形成具有双螺旋结构的目的基因特点1、边解旋边复制；2、半保留复制边解旋边转录一条mRNA可与多个核糖体结合翻译成多条相同的多肽链1、半保留复制；2、快速大量复制产物形成两个完整的DNA分子三种单链RNA 蛋白质(多肽链)短时间内形成大量的目的基因DNA复制、转录、翻译、；逆转录以及PCR技术比较二、在基因过程的各种检测和鉴定：1、标记基因：为了检测目的基因（目的基因表达载体）是否导入受体细胞； 2、用DNA分子杂交法：检测目的基因是否插到染色体DNA上（工具：基因探针）3、用DNA分子杂交法：检测目的基因是否转录出mRNA（工具：基因探针）；4、用抗原—抗体杂交法：检测mRNA是否翻译出蛋白质；5、鉴定：个体水平鉴定：比如抗虫实验。
一、命题规律与趋势纵向分析近五年高考生物试题看，基因表达是考查的重点之一，多出现在选择题中。
从命题角度来看，高考重点考查基因表达涉及转录与翻译两个生理过程和这两个生理过程的比较以及与中心法则、其他生理过程的比较。
预计2013年高考，重点以考查转录和翻译两生理过程为主，会和DNA复制、遗传定律等知识多角度的交叉综合考查。
PCR上岗证考试题及答案(全)
PCR上岗证考试题及答案(全)PCR上岗证考试题及答案（全）一、选择题（共20题，每题2分）1在核酸提取时,常需使用氯化钠、醋酸钠等盐溶液,其目的是:(A)A中和核酸的负离子,使其易于沉淀B调节PH值C保证核酸的完整性D无特定目的2临床上使用核酸扩增方法诊断沙眼衣原体感染,在标本收集上最为关键的是(B)A标本的采取方式B标本的保存方式C标本的运送方式D标本采取的时间3→之所以要将基因扩增检验实验室的产物分析区设置为负压状态,目的是:(B)A防止生物传染危险物的逸出B防止扩增产物从该区进入上游区域C防止该区灰尘的逸出D无特殊目的4核酸探针的标志性特征是:(DA一小段已知序列的单链核酸B一小段未知序列的单链核有同位素或非同位素标记物5核酸提取纯化中, XXX最首要的潜在污染源是:(D)A实验室环境B实验用品如吸头、离心管等C实验人员的手D以上A 和B6PCR方法检测病原微生物所扩增的区段,一般为:(B)A整个病原体基因组B病原体基因组内的保守区域C病原体基因组内的任一区域D以上都不是7无创产前基因诊断为胎儿做出基因检测,需从孕妇外周血中分离获得及大批的:(B)A孕妇有核红细胞B胎儿有核红细胞C白细胞D以上均可8.临床PCR测定的重复性不好的原因如下,但除外:(BA试剂盒核酸提取方法对扩增按捺物去除不干净B尺度品浓度不准C核酸扩增仪空间温度不均D加样重复性差9有关于动力学定量PCR方法中对扩增效率的测定,下述哪一条是错误的:(BA必须在扩增的指数期内测定B可在扩增的任何阶段进行C与扩增产物的测定有关D尽大概多选几个测定点10.临床基因扩增检修的室内质量控制与通常的临床定性免疫测定IQC的最大不同在于:(D)A弱阳性质控血清的设置B强阳性质控血清的设置C阳性质控血清的设置D以上均是11、PCR技术扩增DNA,需求的条件是( A )①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖体A、①②③④B、②③④⑤C、①③④⑤D、①②③⑥12、镁离子在DNA或RNA体外扩增反应的浓度一般为（D）A、0.3-1mmol/LB、0.5-1mmol/LC、0.3-2mmol/LD、0.5-2mmol/L13、多重PCR需要的引物对为（D）A、一对引物B、半对引物C、两对引物D、多对引物14、PCR是在引物、模板和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应，其特异性决定因素为（B）A、模板B、引物C、dNTPD、镁离子15、在PCR反应中，下列哪项可以引起非靶序列的扩增的扩增( C )A、TaqDNA聚合酶加量过多B、引物加量过多C、A、B都可D、缓冲液中镁离子含量过高16、PCR技术的发明人是（A）A、MullisB、XXX.XXX、XXX.才木17、PCR产物短期存放可在（A）保存。