HPLC_ELSD法测定酵母浸膏中游离L_精氨酸
HPLC-ELSD法测定氨基酸原料药中5种糖类杂质
学报Journal of China Pharmaceutical University2021，52（1）：66-7066HPLC-ELSD法测定氨基酸原料药中5种糖类杂质刘蕾#，姜峰#，欧阳汉霖，惠人杰*（江南大学药学院，无锡214122）摘要建立一种高效液相色谱-蒸发光散射检测（HPLC-ELSD）测定氨基酸原料药中5种糖类杂质的分析方法。
利用离子交换树脂分离富集氨基酸样品中的残留糖类杂质，并采用Lichropher NH2色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）进行分离，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，漂移管温度为40℃；增益值为8；载气为氮气（压力为350kPa）。
经验证，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖检测限为20.8~75.0mg/kg，定量限为96.2~238.8mg/kg，5种糖在线性范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999，加样回收率在84.9%~107.8%之间。
该方法操作简便、灵敏度高、精密度好、准确可靠，可用于氨基酸原料药的残糖杂质分析。
关键词氨基酸；糖类杂质；HPLC-ELSD；阳离子交换树脂中图分类号R917文献标志码A文章编号1000-5048（2021）01-0066-05doi：10.11665/j.issn.1000-5048.20210109引用本文刘蕾，姜峰，欧阳汉霖，等.HPLC-ELSD法测定氨基酸原料药中5种糖类杂质［J］.中国药科大学学报，2021，52（1）：66–70. Cite this article as：LIU Lei，JIANG Feng，OUYANG Hanlin，et al.Determination of five carbohydrate impurities in amino acid bulk drug by HPLC-ELSD［J］.J China Pharm Univ，2021，52（1）：66–70.Determination of five carbohydrate impurities in amino acid bulk drug by HPLC-ELSDLIU Lei#,JIANG Feng#,OUYANG Hanlin,HUI Renjie*School of Pharmaceutical Sciences,Jiangnan University,Wuxi214122,ChinaAbstract An analytical method was developed for the determination of five carbohydrate impurities in amino acid drug substances by high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detection(HPLC-ELSD).Sugar impurities in the amino acid sample were separated and enriched by cation exchange resin.A Lichropher NH2column(4.6mm×250mm,5μm)was used for chromatographic separation,and a gradient elution was performed using acetonitrile-water as mobile phase.The drift tube temperature was40o C,the gain value was8,and nitrogen(350kPa)was auxiliary gas.Method validation results showed that the limits of detection for fructose,glucose,sucrose,maltose and lactose were in the range of20.8-75.0mg/kg and that the limits of quantitation were in the range of96.2-238.8mg/kg.Good linear relationship(r≥0.999)were in the linear range for the five sugars,and the recoveries ranged from84.9%-107.8%.With easy operation,high sensitivity,good precision and reliable accuracy,the method can be used for analysis of residual sugar impurities in amino acid drug bulk drug.Key words amino acids;sugar impurities;HPLC-ELSD;cation exchange resinThis study was supported by the Fundamental Research Funds for the Central Universities(No.JUSRP22047)and the Special Funds for Jiangnan University Laboratory Management(No.JDSYS201927)收稿日期2020-05-07*通信作者Tel：************E-mail：huirenjie@基金项目中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（No.JUSRP22047）；江南大学实验室管理专项资助项目（No.JDSYS201927）#刘蕾和姜峰为共同第一作者第52卷第1期刘蕾，等：HPLC-ELSD法测定氨基酸原料药中5种糖类杂质#LIU Lei and JIANG Feng contributed equally to this work氨基酸是构成蛋白质的基本单位，在人类的生长、繁殖和免疫等方面发挥着重要作用［1］。
HPLC-ELSD和GC-FID测定中长链甘油三酯含量比较研究
HPLC-ELSD和GC-FID测定中长链甘油三酯含量比较研究刘蔓蔓;滕英来;汪勇;张宁;李爱军【期刊名称】《中国油脂》【年(卷),期】2015(040)010【摘要】采用间接法定量,建立了HPLC-ELSD外标法和GC-FID内标法测定中长链甘油三酯含量的方法,并对两种方法进行比较.结果表明:两种方法在各自的质量浓度范围内均具有良好的线性关系,HPLC-ELSD外标法测定辛癸酸甘油酯和大豆油的平均加标回收率分别为101.0％和99.5％,RSD分别为1.58％和1.62％,得到酯交换产物中中长链甘油三酯含量为72.8％±0.80％;GC-FID内标法测定辛癸酸甘油酯和大豆油的平均加标回收率分别为99.4％和99.6％,RSD分别为1.24％和2.03％,得到酯交换产物中中长链甘油三酯含量为72.5％±0.84％.说明两种分析方法均具有良好的精密度和重复性.HPLC-ELSD外标法的分析时间为43 min,GC-FID内标法分析时间仅需12.7 min.【总页数】5页(P78-82)【作者】刘蔓蔓;滕英来;汪勇;张宁;李爱军【作者单位】暨南大学食品科学与工程系,广东油脂生物炼制工程技术研究中心,广州510632;暨南大学-萨斯喀切温大学油料生物炼制与营养联合实验室,广州510632;暨南大学食品科学与工程系,广东油脂生物炼制工程技术研究中心,广州510632;暨南大学-萨斯喀切温大学油料生物炼制与营养联合实验室,广州510632;暨南大学食品科学与工程系,广东油脂生物炼制工程技术研究中心,广州510632;暨南大学-萨斯喀切温大学油料生物炼制与营养联合实验室,广州510632;暨南大学食品科学与工程系,广东油脂生物炼制工程技术研究中心,广州510632;暨南大学-萨斯喀切温大学油料生物炼制与营养联合实验室,广州510632;暨南大学食品科学与工程系,广东油脂生物炼制工程技术研究中心,广州510632;暨南大学-萨斯喀切温大学油料生物炼制与营养联合实验室,广州510632【正文语种】中文【中图分类】TS225.6;TQ646【相关文献】1.HPLC-ELSD与GC-MS法测定牛乳甘油三酯sn-2位脂肪酸组成 [J], 韩瑞丽;马健;张佳程;生庆海2.HPLC-ELSD法测定中/长链脂肪乳注射液中大豆油和中链甘油三酸酯的含量 [J], 陈依群;黎卫明;李帼蓉3.HPLC-ELSD测定呋喃二烯脂肪乳注射液中大豆油和中链甘油三酯的含量 [J], 王艳;杨秀春;韩晓;杨磊;孙晓岩;王东凯;4.酶法催化紫苏油和MCT合成中长链甘油三酯研究 [J], 黄昭先;王满意;孙承国;王风艳;王翔宇;江连洲5.正常小鼠和肿瘤小鼠毛发中长链脂肪酸含量测定及比较 [J], 刘江琴;庄海旗;莫丽儿因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
HPLCELSD法测定几种水产品卵及生殖腺中磷脂的组成
信８∞
号
分析，根据线性标准曲线方程计算出各标样的加入
分糈柱（２ｓｏ黻黻×垂。６礅嫩），洗脱方法采用梯度洗 脱，洗脱液为Ａ、Ｂ两种，洗脱液Ａ液组成为：氯仿 ：甲醇：氨水（８０：１９．５：Ｏ．５，Ｖ／Ｖ／Ｖ）；Ｂ液组成
为：氯佬：荦簿：拳；氮水（６§：３莲：ｏ。Ｓ；５．５， Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）。超声波脱气后使用。洗脱流速为１．
ｏｍＬ／ｍｉｎ。梯度洗脱程序如表１所示［２０１。程序结
分析仪器
２０１２年第５期
ＨＰＬＣ—ＥＬＳＤ法狈！Ｊ定
几种水产品卵及生殖腺中磷脂的组成
王琦１
薛长湖２
徐杰２
李兆杰２
（１．武汉工业学院食品科学与工程学院，武汉４３００２３｝２．中国海洋大学食品科学与工程学院，青岛２６６００３）
摘要利用高效液相色谱一蒸发光散射检测（ＨＰＬｃ—ＥＬＳＤ）测定方法，对阿拉斯加狭鳕鱼卵、鲟鱼鱼籽、鸢乌 贼卵、虾夷扇贝精巢及卵巢、海胆生殖腺中磷脂组成进行了检测。以ＺＯＲＢＡＸ Ｒｘ－ＳＩＬ型正相硅胶色谱分析柱 （４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）为分离柱，使用氯仿：甲醇：氨水（８０：１９．５：ｏ．５，Ｖ／Ｖ／Ｖ）及氯仿：甲醇：水：氨水（６０： ３４；Ｏ．５：５．５，Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）为流动相进行二元梯度洗脱，流速为１．Ｏ ｍＬ／ｍｉｎ，柱温３０℃。蒸发光散射检测器漂移 管温度６５℃，雾化气（氮气）压力４．５Ｍｐａ流速为２．ｏＬ／ｍｉｎ。在上述条件下对各水产品卵／生殖腺所提取磷脂中的 心磷脂（ＣＬ）、磷脂酰乙醇胺（ＰＥ）、磷脂酰胆碱（ＰＣ）、磷脂酰肌醇（ＰＩ）、磷脂酰丝氨酸（ＰＳ）、鞘氨醇磷脂（ＳＭ）溶血磷 脂酰胆碱（ＬＰＣ）等组分进行了测定，结果发现各磷脂组成在各自浓度检测范围内线性关系良好，方法精密度较高， 将该方法用测定于水产品卵／生殖腺来源磷脂样品中磷脂组成，可以获得快速、准确的分析结果。对于其它来源的 磷脂样品测定也具有重要的参考价值。
HPLC-ELSD-UV法同时测定氨酚那敏三味浸膏胶囊中长梗冬青苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素
HPLC-ELSD-UV法同时测定氨酚那敏三味浸膏胶囊中长梗冬青苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素赵迪;周悌强;冯素香;李娟;徐鹏;李建生【期刊名称】《中成药》【年(卷),期】2012(034)010【摘要】目的建立氨酚那敏三味浸膏胶囊中长梗冬青苷、白花前胡甲素和白花前胡乙素的定量分析方法.方法采用HPLC-ELSD-UV法测定长梗冬青苷、白花前胡甲素和白花前胡乙素,色谱柱为Venusil XBP-C18 (4.6 mm× 250 mm,5 μm),流动相为乙腈-水,梯度洗脱,体积流量为1.0 mL/min,紫外检测波长为320 nm；ELSD 参数:漂移管温度为80℃,氮气体积流量为2.5 mL/min,雾化温度为36 ℃,柱温30℃.结果长梗冬青苷在1.071 6～5.358 μg范围内的线性关系良好(r =0.999 1),平均回收率100.3％,RSD为2.05％(n=9)；白花前胡甲素和白花前胡乙素分别在0.892 4～4.462 μg(r =0.999 9)和0.486 8～2.434 μg(r =0.999 7)范围内线性关系良好,平均回收率分别为100.03％、99.02％,RSD为2.01％、1.98％(n=9).结论本方法测定结果准确可靠,重复性好,可为氨酚那敏三味浸膏胶囊的质量控制提供定量评价方法.【总页数】5页(P1908-1912)【作者】赵迪;周悌强;冯素香;李娟;徐鹏;李建生【作者单位】河南中医学院,河南郑州450008【正文语种】中文【中图分类】R927.2【相关文献】1.HPLC法测定金贝痰咳清颗粒中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量方法研究[J], 刘洋;李伟2.高效液相色谱法同时测定止咳片中白花前胡甲素和白花前胡乙素含量 [J], 赵万晴;戚继红3.高效液相色谱法测定前胡中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量 [J], 田玉路;王宏侠;高萌;赵丽丽;张兰桐;王巧4.HPLC法测定金贝痰咳清颗粒中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量方法研究[J], 刘洋;李伟5.超高液相色谱法同时测定通宣理肺丸中白花前胡甲素和白花前胡乙素 [J], 陈少萍; 王丽丽; 梁艺坚因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
HPLC-ELSD 法测定含三七中成药的皂苷成分的含量
HPLC-ELSD 法测定含三七中成药的皂苷成分的含量王芮;郭华【期刊名称】《西北药学杂志》【年(卷),期】2014(000)006【摘要】目的：建立三七成分中皂苷成分的测定方法。
方法采用 HPLC-ELSD 法测定三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1和 Rb1的含量。
结果3个成分分离效果很好，线性关系良好。
回收率测定结果在95．6％～105．0％之间。
结论所建立的方法简便、准确、重复性好，可用于含三七的中成药中皂苷成分的质量控制。
%Objective To establish a method for the determination of saponins in Chinese patent drugs .Methods Notoginsenoside R1 ,ginsenosides Rg1 and Rb1 were determined by using HPLC-ELSD .Results Notoginsenoside R1 ,ginsenosides Rg1 and Rb1 were well separated .The recoveries were between 95 .6% and 105 .0% .Conclusion The method issimple ,accurate with good re-peatability and can be used for the quality control for Chinese patent drugs .【总页数】3页(P575-577)【作者】王芮;郭华【作者单位】解放军307医院药学部，北京 100071;军事医学科学院门诊部，北京 100850【正文语种】中文【中图分类】R917【相关文献】1.HPLC-ELSD法测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量 [J], 郑义;陈晓兰;丁宁;朱善元2.HPLC-ELSD法测定舒络颗粒中黄芪甲苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量 [J], 唐露;李希;冯建安;杨华;易晓霞3.HPLC-ELSD法测定通迪胶囊中三七皂苷R1和人参皂苷Rg1、Rb1的含量 [J], 满莹;宋铁兵;王玉华;肖威4.HPLC法测定含三七类保健食品中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1含量 [J], 张治军;钟名诚;黄秋华5.脑得生软胶囊中三七皂苷R_1、人参皂苷Rg_1和人参皂苷Rb_1含量的HPLC-ELSD法测定 [J], 胡迪;樊文娟;邵贝贝;吴慧;王光忠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
高效液相色谱仪测定发酵液中的氨基酸含量
高效液相色谱仪测定氨基酸的含量1 L--色氨酸含量的测定1.1实验仪器与试剂色氨酸样品，甲醇，高效液相色谱仪，0.03%KH2PO4溶液1.2 HPLC色谱分析条件流动相为0.03%KH2PO4溶液（A）-甲醇（B），线性梯度淋洗，流速1.0mL/min，柱温35℃，检测波长276nm。
1.2标准溶液的配制精密称取色氨酸标准标准品50mg，置100ml容量瓶中，振摇，用流动相溶解到刻度，作为供试品溶液，另取色氨酸样品适量，同法操作。
1.3标准直线的制作精密称取色氨酸标准样品适量,分别稀释制成每1ml 中含色氨酸50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1000.0μg 的溶液，注入液相色谱仪，以色氨酸峰面积A为纵坐标，浓度C为横坐标，制作回归标准直线。
1.4发酵液中样品中色氨酸含量的测定取发酵液，稀释配制成约500μg/ ml 的溶液，摇匀，过滤，取25μl进样，在高效液相色谱仪下测量，记录峰值面积，作图。
2L-精氨酸含量的测定2.1实验仪器与试剂L-精氨酸标准样品，乙腈，高效液相色谱仪，磷酸二氢铵。
PH计，磷酸，2.2HPLC色谱分析条件流动相: 以磷酸二氢铵溶液( 称取磷酸二氢铵1.15g, 加水800m 溶解后, 用磷酸调节pH 值至2.0±0.1, 加水稀释至1000ml ) - 乙腈为流动相，线性梯度淋洗; 柱温为30℃检测波长为206nm；进样量：25μl。
2.2标准直线的制作精密称取精氨酸标准标准品50mg，置100ml 容量瓶中，振摇，用流动相溶解到刻度，作为供试品溶液，另取色氨酸样品适量，同法操作。
精密称取精氨酸标准样品适量,分别稀释制成每1ml 中含精氨酸50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1000.0μg 的溶液，注入液相色谱仪，以精氨酸峰面积A为纵坐标，浓度C为横坐标，制作回归标准直线。
2.3发酵液中样品中精氨酸含量的测定取发酵液，稀释配制成约500μg/ ml 的溶液，摇匀，过滤，取25μl 进样，在高效液相色谱仪下测量，记录峰值面积，作图。
酵母抽提物中游离氨基酸的测定与分析
酵母抽提物中游离氨基酸的测定与分析钱敏;白卫东;赵文红;陈海光;陈悦娇;黄桂颖【期刊名称】《现代食品科技》【年(卷),期】2012(028)007【摘要】本文首先摸索了游离氨基酸的HPLC法测定条件,建立了同时测定16种游离氨基酸的方法,然后对酵母抽提物中的游离氨基酸进行了分析研究.通过高效液相色谱法测定了热反应前后酵母抽提物、HVP粉、猪肉酶解物中的游离酸,得出结论:酵母抽提物中游离氨基酸的种类和含量最多；热反应后的酵母抽提物中氨基酸含量减少,且随着加入还原糖(木糖)含量的增多,游离氨基酸含量也随着减少.因此,酵母抽提物可作为Maillard反应制备肉味香精的良好氨基酸原料.【总页数】5页(P878-881,870)【作者】钱敏;白卫东;赵文红;陈海光;陈悦娇;黄桂颖【作者单位】仲恺农业工程学院轻工食品学院广东广州510225;华南农业大学食品学院广东广州510642;仲恺农业工程学院轻工食品学院广东广州510225;华南农业大学食品学院广东广州510642;仲恺农业工程学院轻工食品学院广东广州510225;仲恺农业工程学院轻工食品学院广东广州510225;仲恺农业工程学院轻工食品学院广东广州510225;仲恺农业工程学院轻工食品学院广东广州510225【正文语种】中文【相关文献】1.黏虫蜜源植物花蜜中游离氨基酸的测定与分析 [J], 刘保玲;王高平;胡京枝2.侗家奇液酒中游离氨基酸含量测定分析 [J], 王翔;杨晓燕;张钰萍3.五种绿茶中游离氨基酸的测定和分析 [J], 刘凯;雷学昌;赖飞;王震;张宝林4.矛头蝮蛇蛇毒中游离氨基酸测定与分析 [J], 薛雁;李秀琳;李秀娜;丁忠福;崔亮亮5.氨基酸分析仪测定含乳饮料中游离甘氨酸的方法研究 [J], 冯志强;周兴起;庄俊钰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
HPLC法测定丙酸菌发酵液中游离氨基酸的含量 (1)
种氨基酸的方法，并将其应用于丙酸菌发酵液
中氨基酸的检测。
３６０ｎｍ，进样量２０ＩｘＬ。采用的梯度洗脱程序如
表ｌ。
２材料与方法
２．１仪器与试剂 日本岛津ＬＣ一２０ＡＢ型高效液相色谱仪；
Ｔａｂｌｅ
表１梯度洗脱程序
１ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ｐｒｏｇｒａｍ
ＳＰＤ一２０Ａ紫外检测器；ＣＴＯ一１０ＡＳ柱温箱；
氨酸，经衍生反应生成的，因此不能对半胱氨酸 准确定量，仅做半胱氨酸的定性分析，以确定发 酵液是否含有半胱氨酸。１９种氨基酸在３０ｒａｉｎ内 均分离良好。 ３．２色谱条件的优化
ＤＮＦＢ衍生剂的配制
精密量取０．５ｍＬ ＤＮＦＢ，置于５０ｍＬ棕色容量 瓶中，乙腈定容至刻度线，混匀，配制浓度约为 １７０ｍｍｏｌ／Ｌ，用封口膜密封，置于４。Ｃ冰箱避光 保存。 ２．２．２混合氨基酸标准溶液的配制
３．６加样回收率实验 取已知含量的同一样品５份，分别准确加人
率，结果见表５。１８种氨基酸的加样回收率均在
９５％～１０３％范围内，回收率较好。
氨基酸标准品混合溶液，以外标法计算加样回收
表５
Ｔａｂｌｅ ５
１８种氨基酸的加样回收率（ｎ＝５） ｆ １１＝５ Ｊ
测碍量
悻ｇ／ｍＬ
Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ １８ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ａｌｎｉｉｌＯ ａｃｉｄｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ａｓ
ｆｏｌｌｏｗｓ：２，４一ｄｉｎｉｔｒｏｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ（ＤＮＦＢ）ａｓ
ｐｒｅ—ｃｏｌｕｍｎ
ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ，ＴＩＡＮＨＥ Ｋｒｏｍａｓｉｌ
ｍｍ
Ｃ１８
ａｃｅ—
（４．６ｍｍ ２５０ｍｍ，５ ｍ）ａｓ ｔｈｅ ｒｅｖｅｒｓｅｄ—ｐｈａｓｅ ｃｏｌｕｍｎ，ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ Ａ：０．０５
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
酵母浸膏(Yeast Extract)是采用新鲜酵母经酵母自溶、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物，有酵母自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色至浅棕色，反应呈弱酸性。
它是含有HPLC-ELSD法测定酵母浸膏中游离L-精氨酸万红贵，宗素艳，蔡恒，朱明新，袁建锋(南京工业大学制药与生命科学学院，南京210009)摘要：建立高效液相色谱-蒸发光散射(HPLC-ELSD)测定酵母浸膏中游离L-精氨酸(L-Arg)的检测方法。
采用Alltima C18(250mm×4.6mm i.d.，5μm)色谱柱，以5.0mmol/L七氟丁酸的0.2%(体积分数)三氟乙酸溶液和乙腈(体积比为93.3∶6.7)为流动相，流速为0.6mL/min，ELSD漂移管的温度为110℃，载气流速为2.8L/min。
在该色谱条件下，L-精氨酸浓度20.0～500mg/L时，其峰面积的自然对数与相应的浓度的自然对数线性关系良好(R2=0.9995)，回收率97.57%～103.5%，精密度RSD＜2.39%。
该方法能简便、快速、准确地测定酵母浸膏中L-精氨酸的含量，亦可为其他有机氮源及发酵液中游离L-精氨酸分析提供参考。
关键词：高效液相色谱(HPLC)；蒸发光散射检测(ELSD)；酵母浸膏；L-精氨酸(L-Arg)中图分类号：O657.7+2文献标志码：A文章编号：1005-9989(2009)02-0269-04Determination of L-arginine in yeast extract by high performance liquid chromatography-evaporative light-scattering detectorWAN Hong-gui,ZONG Su-yan,CAI Heng,ZHU Ming-xin,YUAN Jian-feng (College of Life Science and Pharmacy,Nanjing University of Technology,Nanjing210009) Abstract:High performance liquid chromatograpHy(HPLC)coupled with evaporative light scattering detector (ELSD-2000)was used for the determination of L-arginine in yeast extract without derivatization.A Alltima C18 (250mm×4.6mm i.d.,5μm)was used with the mobile pHase of0.2%trifluoroacetic acid water solution containing5.0mmol/L heptafluorobutyric acid and acetonitrile(the ratio of volume was93.3to6.7).The flow rate was at0.6mL/min.The drift tube temperature of ELSD was set at110℃,and with the nitrogen flow rate of2.8 L/min.The calibration curves were showed good linearity(r2=0.9995)within the concentration range of20.0~500 g/L for L-arginine.The average recoveries were ranged from97.57%to103.5%and the standard deviation was less than 2.39%.The method was evaluated as rapid,accurate and simple.The validated method is successfully applied to quantify L-arginine in yeast extract which provides a new basis of overall assessment on quality of other organic nitrogen source and determination of L-arginine in fermentation broth.Key words：HPLC;ELSD;yeast extract;L-arginine收稿日期：2008-06-27作者简介：万红贵(1955—)，男，江苏无锡人，研究员，高级工程师，研究方向为发酵代谢调控。
·269·蛋白质、氨基酸类、肽类、水溶性维生素、酵母多糖、酵母核酸组成的一种混合物，在培养基中主要起补充氮源和提供微生物生长的各种维生素及氨基酸[1]的作用。
鸟氨酸生产菌大多为精氨酸缺陷型[2]，故必须在培养基中添加适量的L-精氨酸才能满足鸟氨酸生产菌的生长。
鸟氨酸发酵生产中，酵母浸膏作为主要有机氮源来源，是非常重要的原材料。
因其含有丰富游离氨基酸，故不需在培养基中额外添加精氨酸，但因原料来源及处理方法不同而造成不同生产厂家和不同批次的酵母浸膏中游离L-精氨酸含量不同，从而对鸟氨酸发酵产酸、糖酸转化率等造成重大影响。
因此，有必要建立一种检测酵母浸膏中游离L-精氨酸检测方法，以确定培养基中酵母浸膏的添加量。
目前已报道的L-精氨酸的检测方法主要有坂口试剂法[3-7]、电化学法[8]、化学发光法[9-10]、氨基酸分析仪测定法和高效液相色谱法[11-16]，但目前报道的高效液相色谱法测定氨基酸大多采用柱前衍生化法[11-12]或HPLC-ELSD的梯度洗脱[13-16]检测，未见HPLC-ELSD的等度洗脱分析检测L-精氨酸的报道。
研究中采用HPLC-ELSD及反相柱Alltima C18 (250mm×4.6mm i.d.，5μm)定量分析酵母浸膏中游离L-精氨酸，与其他的方法相比，该测定方法具有快速简便，样品不需衍生化可直接进样，不用梯度洗脱，不受前体氨基酸及其他肽类物质干扰，在较短的时间内达到分离目的等优点，适合于从复杂体系中快速检测游离L-精氨酸的含量。
1材料与方法1.1仪器Alltech高效液相色谱仪：包括426型HPLC 泵，ELSD2000检测器，Alltech色谱工作站，美国奥泰科技有限公司；离心机：上海安亭科学仪器厂；BS124S电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司。
1.2试剂乙腈：色谱纯，Caledon Laboratories公司；三氟乙酸、三氯乙酸：AR，国药集团化学试剂有限公司；七氟丁酸：AR，Fluka公司；娃哈哈饮用纯净水：杭州娃哈哈集团有限公司；L-精氨酸标准品、L-组氨酸、L-赖氨酸：BR，国药集团化学试剂有限公司；酵母浸膏1＃：BR，北京；酵母浸膏2＃：BR，上海生产；酵母浸膏3＃：BR，江苏。
1.3色谱条件色谱柱：Alltima C18(250mm×4.6mm i.d., 5μm)；流动相：5.0mmol/L七氟丁酸的0.2%(体积分数)三氟乙酸溶液和乙腈(体积比为93.3∶6.7)；流速0.6mL/min；检测器：ELSD2000；漂移管温度110℃；气体流量2.8L/min；进样量20μL。
1.4标准溶液的配制精密称取L-精氨酸标准品100mg，用纯净水溶解，定容至100mL，得到浓度为1.000g/L的L-精氨酸标准品储备液。
分别取不同体积的储备液于10mL容量瓶中，用纯净水定容，配成不同浓度的标准液。
1.5样品处理精密称取酵母浸膏约2.0g，置于50mL容量瓶中，用纯净水定容配制得质量浓度为4.0g/L样品溶液，准确量取5mL样品溶液，加入等体积的30%三氯乙酸溶液，静止60min后离心(10000r/ min)15min，取上清液，经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液待测。
2结果与讨论2.1流动相流速的选择分别以流速为0.6、0.7mL/min和0.8mL/min 的5.0mmol/L七氟丁酸的0.2%三氟乙酸-乙腈溶液(体积比为93.3∶6.7)为流动相进行试验。
结果表明，采用0.7mL/min和0.8mL/min时，保留时间短，但色谱峰拖尾且L-精氨酸色谱峰不能与杂质峰完全分离，而以流速为0.6mL/min时，虽分析时间延长，但色谱峰对称性好，峰形尖锐，L-精氨酸色谱峰与杂质峰完全分离。
在达到良好分离度的前提下，选择0.6mL/min为流动相流速。
2.2检测器参数的选择蒸发光散射检测器的漂移管温度和气体流量是影响检测结果的重要参数。
漂移管温度低于某一温度时，因流动相得不到充分的挥发，基线水平较高，而温度过高时，可能会带来更大的噪音，随着气体流量增大，响应值也随之减小。
因此，分别考察了漂移管温度为105、110℃和115℃，气体流量为2.5、2.8L/min和3.0L/min。
结果表明，在漂移管温度110℃、气体流量2.8L/min时，基线平稳，噪音较小，有适宜的响应值。
因此，实验选择此参数进行测定。
2.3其他氨基酸对分离的影响·270·酵母浸膏成分复杂，除含有L-精氨酸外还含有其他游离氨基酸。
L-赖氨酸(L-Lys)、L-组氨酸(L-His)与L 精氨酸为碱性氨基酸，性质相似。
为此，考察了L-赖氨酸和L-组氨酸对L-精氨酸分离度的影响。
配制3种氨基酸的混合溶液(质量浓度均为100mg/L)按1.3项下条件进样，其色谱图如图1所示，通过单组分定性确定3种氨基酸的保留时间。
由图1可以看出，L-赖氨酸和L-组氨酸不能完全分离，但两者与L-精氨酸分离度均＞1.5，表明对L-精氨酸分离没有影响。
2.4线性范围和检出限在1.3节规定的色谱条件下，对一系列不同浓度的L-精氨酸标准溶液进样，以L-精氨酸标准品浓度(mg/L)ρ的自然对数为横坐标，相应的峰面积A 的自然对数为纵坐标，进行线性回归，得标准曲线方程为lnA=1.113㏑ln ρ－8.1268，相关系数r 2=0.9995，线性范围为20.0~500mg/L 。
当信噪比(S/N)为3时，测得L-精氨酸的检出限为6.9mg/L 。
2.5精密度取上述线性范围内的3个浓度(100、200、500mg/L)的L-精氨酸标准溶液，连续进样(20μL)6次，以峰面积和保留时间作为考察体系精密度的指标，峰面积的相对标准偏差(RSD)在1.08%~2.39%之间，保留时间RSD 0.971%~2.03%之间，表明该方法精密度良好。