植物胚胎培养与离体受精
胚胎培养
胚胎培养一、胚胎培养的概念1.胚胎：植物在受精后，受精卵形成合子，随即进行第一次分裂，进而形成分生组织和幼胚，再发育成成熟胚。
2.胚胎培养：胚胎培养是植物组织培养的一个主要领域。
植物胚胎培养是指对植物的胚（种胚）及胚器官（如子房，胚珠）进行人工离体无菌培养，使其发育成幼苗的技术。
二、胚胎培养的种类以及方法1.胚培养⑴幼胚培养①定义：将子叶期以前的具胚结构的幼小胚从母体上分离出来，放在无菌的人工环境条件下使其进一步生长发育形成幼苗的技术。
②特点：幼胚培养完全是异养的，离体条件下培养要求培养基成分复杂，培养不易成功。
附：以下几种发育方式：a、胚性发育，此种方式不能萌发成苗b、早熟萌发，长成的苗十分瘦弱c、产生愈伤组织，再由愈伤组织分化形成胚或不定芽⑵成熟胚培养①特点：成熟胚培养是自养的，培养基需要简单。
②主要目的：a、研究胚发育过程的形态建成b、生长调节物质的作用c、胚与胚乳相互关系和营养要求③培养方法：将受精后成熟或未成熟种子或果实，用70%-75%酒精表面消毒几分钟；用0.1%升汞溶液或饱和漂白粉溶液消毒10min，无菌水反复冲洗；无菌操作台上，直接或在解剖镜下剥取胚接种在培养基上。
2、胚乳培养⑴定义：指将胚乳组织从母体上分离出来，通过离体培养，使其发育成完整植株的技术。
⑵胚乳是由两个单倍的极核和一个单倍的精子结合而成的3倍体组织。
由它可获得无子结实的3倍体植株，进而可将它加倍成6倍体植株。
不同胚乳发育类型及发育时期直接影响外植体取材时期以及胚乳细胞产生愈伤组织频率。
胚乳培养的后代，常发生细胞染色体数目变化，形成多倍体、非整倍体等。
⑶培养的方法：取授粉4-8d后的幼果，常规消毒；无菌条件下切开果实，取出种子，分离出胚乳；接种在培养基上（MS、White等培养基，附加2，4-D或NAA 0.5～2.0，BA0.1～1.0。
），在25-270C和黑暗条件或散光下培养想成愈伤组织；转到分化培养基（MS培养基附加0.5～3.0 mg/l的BA及少量的NAA。
植物胚胎培养
培养(endosperm culture)、离体受精(in vitro pollination)等类型。 1904年Hanning最早成功培养萝 卜和辣根的胚。
植物胚胎培养
柱头
花柱 雌 蕊
花药 雄 蕊
花丝
子 胚珠 房
子房壁
植物胚胎培养
种子各部分的发育来源
植物胚胎培养
合子发育成胚
珠被发育成种皮 受精极核发育成胚乳
成果实，并含成熟种子。
三、胚珠和子房培养
2.胚珠培养和子房培养的技术 子房培养 影响子房培养的因素
❖ 材料的选择：品种间的差异、胚囊发育时期 ❖ 培养基：基本培养基、激素、蔗糖（3-10%） ❖ 接种方式：要注意极性；营养吸收
单倍体来源和发育途径
❖ 由助细胞或胚囊的无配子生殖产生单倍体 ❖ 卵细胞、助细胞、反助细胞均可发育产生单倍
2.胚培养技术
成熟胚培养：指子叶期至发育成熟的胚培养。成熟 胚是自养的，培养基需要简单。仅提供一定的温度、 湿度就可以发芽生成植物体。如种子的发育。
培养过程：
种子——95%酒精消毒——选取完好种子—
—70%酒精浸数秒——0.1%升汞或10%次氯酸钠浸
泡——无菌水冲洗——种子培养几天——剥离种
胚——接种在培养基上。 成熟胚培养一般较易获得成功
用于单倍体育种。 子房培养的意义: 获得杂种植株； 未授精子房培养为试管受精提供技术基础；
三、胚珠和子房培养
2.胚珠培养和子房培养的技术
胚珠培养：将胚珠从母株中分离出来，放 在无菌的人工环境条件下，让其进一步生长 发育，以致形成幼苗的过程。
根据胚珠是否受精分为两类：
植物胚胎培养
（2）防止幼胚早熟萌发的方法
①提高培养基渗透压。胚龄越小要求的渗透 压（糖浓度）越高，高糖浓度控制幼胚早熟 萌发的效果早已被证实。下述实例阐明不同 胚龄对糖浓度的要求。
②提高无机盐浓度。提高无机盐浓度也是为 了提高培养基渗透压。可加入适量的NaCl 以提高渗透压，浓度一般为0．2％－0．4 ％，超过0．8％对胚有毒害作用。
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（二）幼胚
发育早期的幼胚，由于胚胎发育要求更 为完全的人工合成培养基，而且剥离技 术要求很高，用成熟胚的培养方法很难 成功，可以采用胚珠预培养的方法。
具体做法：将授粉后的子房剥出用药剂
进行表面消毒，在无菌条件下切取胚珠
进行预培养。培养一定时间后，再将胚
从胚珠中剥出，接着培养裸露的胚，使
曼陀罗：5.0一8.1
水稻：5.0
番茄： 6.50
大麦：4.9
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(三) 环境条件对胚性发育的影响
1）光照条件：
由于胚在胚珠内发育是不见光的。一 般认为在黑暗或弱光下培养幼胚比较适 宜。光照对胚胎发育有轻微抑制作用， 离体培养条件下，幼胚正常胚性发育对 光的要求，还应根据植物种类来决定。
③加人甘露醇提高渗透压。甘露醇的浓度为 1．l％－5．5％，以部分地代替蔗糖，使幼 胚在等渗条件下继续胚性发育。
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（二） 培养基酸碱度对胚性发育的影响
培养基酸碱度对胚性发育也是非常重 要的。通常胚培养所用pH值的范围为。 因植物种类不同而有所差异。
如：
荠菜： 5.4－7.5
桃：5.8
（五）克服种子的自然不育性
（六）种子生活力的测定
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内容 3
组织培养的分类
组织培养的分类
植物组织培养概念(广义)又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织。
器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
植物组织培养概念(狭义)指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。
按外植体分，植物组织培养可分以下几类：
1.胚胎培养植物的胚胎培养，包括胚培养、胚乳培养、胚珠和子房培养，以及离体受精的胚胎培养技术等。
2.器官和组织培养器官培养是指植物某一器官的全部或部分或器官原基的培养，包括茎段、茎尖、块茎、球茎、叶片、花序、花瓣、子房、花药、花托、果实、种子等。
组织培养有广义和狭义之分。
广义：包括各种类型外植体的培养。
狭义：包括形成层组织、分生组织、表皮组织、薄壁组织和各种器官组织，以及其培养产生的愈伤组织。
3.细胞培养细胞培养包括利用生物反应器进行的，旨在促进细胞生长和生物合成的大量培养系统和利用单细胞克隆技术促进细胞生长、分化直至形成完整植株的单细胞培养。
4.原生质体培养植物原生质体是被去掉细胞壁的由质膜包裹的、具有生活力的裸细胞。
第3章 植物胚培养
附加成分
3、培养条件
通常会下降 12小时光照和25C，热带兰花杂交种胚30C
第一节 植物胚胎培养
五、幼胚培养方法
• （一）材料的选择与灭菌
• （二）幼胚的分离及培养
第一节 植物胚胎培养
• （一）材料的选择与灭菌 • 取材时期：大多数幼胚成功的实例证明，适宜于幼 胚发育时期多为心形胚至鱼雷形胚。（在解剖镜下 观察，摸索植物的授粉天数与胚胎发育的对应关 系）。 • 操作：取回大田或温室里授粉受精后的植物子房， 用70%的酒精进行表面消毒，再用0.1%氯化汞灭菌 10-30min，用无菌水冲洗3-4次，即可用于胚的分离 和培养。 • 次氯酸钠：5%的次氯酸钠处理10min用无菌水冲洗34次，即可用于胚的分离和培养。
第一节 植物胚胎培养 幼胚培养的关键技术：
取材时期 幼胚剥离 培养基设计 培养条件的控制（是否需要特殊处理）
第一节 植物胚胎培养 六、幼胚培养条件
培养基 环境条件
植物材料：胚柄
第一节 植物胚胎培养
• 基本培养基：MS N6 White等 • 糖的作用：蔗糖是最好的碳源之一，主要调解渗 透压的作用 • 无机氮以硝酸盐、铵盐的形式存在可以提高钾和 钙的浓度 • 氨基酸：谷氨酰胺刺激胚的生长；水解蛋白 • 维生素：促进幼胚的早期发育 • 植物生长调节剂 • 天然有机物：胚乳看护培养
造成染色体倍性变化的主要原因有： 培养基中的外源激素。猕猴桃的确胚乳培养中，当培 养基中含有3.0mg/L Zt +0.5-1.0mg/L 2,4-D时产生的 植株多是三倍体，而在3.0mg/L Zt +0.5-1.0mg/L NAA 时产生的植株多数不是三倍体。 继代的次数越多，倍性越不稳定。
第二节 植物胚乳培养 胚乳发育时期
第六章 植物的胚胎培养和离体授粉
2、影响幼胚培养的因素
1）培养基 A、基本培养基 • 幼胚要求更复杂的培养基。除了一般的无机盐成
分外，还要加入微量元素和生长辅助物质，不同 发育时期的幼胚对培养基成份要求不同，胚龄越 小培养及成份越复杂。K+、Ca2+水平稍高有利于 幼胚培养
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B、蔗糖： 糖的作用：
调节渗透压；碳源；防止幼胚早萌。 渗透压的保持对于幼胚培养相当重要，
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2 、幼胚离体培养中常见的生长发育方式
• 胚性发育(embryonal development)—— 幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活 体内的发育方式发育，最后形成成熟胚， 然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株， 这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就 是一个植株。
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早熟萌发(early mature sprouting)—— 幼胚接种后， 离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发 成幼苗，通常称为早熟萌发。
第六章 植物胚胎培养 和离体授粉
植物胚胎培养概念
• 对无菌分离出的成熟胚或未成熟胚进行离 体培养，以获得发育正常的植株的技术。
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植物胚培养根据在培养中所取外植体的部位 不同可分为 胚培养(embryo culture) 胚乳培养(endosperm culture) 胚珠培养(ovule culture) 子房培养(ovary culture)
在大多数情况下，一个幼胚萌发成一个植株，但有 时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞，以后形成 许多胚状体，从而可以形成许多植株，这种现象就 是所谓的丛生胚现象。
愈伤组织——在许多情况下，幼胚在离体培养中首 先发生细胞增殖，形成愈伤组织。一般来讲由胚形 成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种胚性愈伤 组织很容易分化形成植株。
《细胞工程》名词解释
植物细胞全能性:植物体的每个细胞都携带有该物种的全部遗传信息，因而只要在适当的条件下，植物一切生活细胞都具有分化为一个完整植株的潜在能力，这就是细胞的全能性。
这是细胞工程的理论基础。
细胞分化:个体细胞发育过程中，后代细胞在形态、结构和生理功能上发生差异的过程。
脱分化:原已分化的细胞，失去原有的形态和机能，又回复到没有分化的无组织的细胞团或愈伤组织，这个过程称为脱分化。
再分化:由脱分化状态的细胞再度分化形成另一种或几种类型的细胞的过程，称为再分化愈伤组织:外植体在离体条件下，细胞经脱分化等一系列过程，转变为一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团，称为愈伤组织。
愈伤组织细胞大而不规则,高度液泡化、没有次生细胞壁和胞间连丝。
继代培养:对来自于外植体所增殖的培养物通过更新新鲜培养基及不断切割或分离,进行连续多代的培养.外植体:植物组织培养中用来进行离体无菌培养的材料,可以是器官、组织、细胞和原生质体。
器官发生:指离体培养条件下的组织或细胞团分化形成不定根、不定芽等器官过程。
体细胞胚：由外植体可直接形成胚状体，外植体也可以经脱分化先形成愈伤组织，再由愈伤组织形成胚状体。
胚状体是由体细胞发育而来人工种子：通过将植物组织培养中所产生的体细胞胚或珠芽等包埋在“人工胚乳”和“人工种皮”里，制成的具有播种功能、类似天然种子的颗粒就称为人工种子。
繁殖系数：也叫增殖系（倍)数或增殖率，是指繁殖材料在一个培养周期内增殖的倍数。
污染：指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。
褐变：指在组织培养中，由于材料被切割而使多酚氧化酶活化将组织中的酚类物质氧化形成棕褐色的醌类物质，并向培养基中扩散，抑制培养物生长甚至导致其死亡的现象。
玻璃化：指组织培养过程中的特有的一种生理失调或生理病变，试管苗呈半透明状外观形态异常的现象。
悬浮培养：将游离的单细胞或小的细胞团，按照一定的细胞密度，悬浮在液体培养基中进行培养的方法。
分子遗传学
2、幼胚的早熟萌发与防止 幼胚的早熟萌发（Precocious gemination）—— 指幼胚在离体培养条件下，越过正常胚胎发育 阶段，在未达到生理和形态成熟的情况下，萌发长 成幼苗的现象。 早熟萌发形成的幼苗往往畸形、细弱，甚至不 能存活。所以，离体培养幼胚需要防止早熟萌发。
防止方法： 增加培养基中糖和无机盐的浓度，提高培养基 独特，在被子植物中，它是三 倍体组织。胚乳是胚发育的主要营养组织。它 是一种均质的薄壁细胞组织，完全没有维管成 分的分化。在离体条件下，可无限增生和进行 器官分化，并可形成三倍体的再生植株。 在胚乳培养中，除少数寄生或半寄生植物 可以直接从胚乳分化器官以外，绝大多数被子 植物的胚乳，无论成熟还是未成熟，都要先经 历愈伤组织阶段，然后才能分化出植株。
3、胚柄在胚培养中的作用 不同发育时期的幼胚，离体培养成 功率差异较大。一般胚龄越大成功率越 高，胚龄越小成功率越低。 胚柄的存在对幼胚能否成活至关重 要。胚柄在离体培养中对胚的作用机理 还不清楚，可能跟胚柄能合成并向胚提 供生长发育所需物质（激素？）有关。
4、胚培养的培养基
糖：高浓度的糖，一方面做能源和碳源；另一方面 作渗透压调节剂维持高水平的渗透势，并防止幼 胚的早熟萌发。多用蔗糖，也可用甘露醇替代。 无机盐：氨盐和无机氮的存在有利于幼胚的成活和 发育。 氨基酸和维生素：氨基酸有利刺激幼胚生长；但维 生素不一定是必需的，依不同种而定。
生长调节物质 :离体胚的正常发育不需添加激素。但 若要诱导愈伤组织则需外加一定的激素。
pH值：胚培养要求一定的pH范围，否则生长抑制。
5、培养条件 光照：通常认为胚培养不需要光照，因为 胚是在胚珠内发育的。光照对胚胎发育 有轻微抑制作用，随培养时间和胚生长 的进行，光照条件要逐步改变。 温度：因种类而异，与器官培养差异不大。
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一 、什么是植物胚胎培养
? 胚胎培养（embryo culture ）是植物组 织培养的一个主要领域。植物胚胎培养 是指对植物的胚（种胚）及胚器官（如 子房、胚珠）进行人工离体无菌培养， 使其发育成幼苗的技术。
? 从离体胚到完整的植株，其发育途径有3 条：1、正常胚胎发育途径 2、脱分化 形成愈伤组织 3、早熟萌发产生畸形苗
? 例2：伊华林等以柑橘异源四倍体杂种为 父本与单胚的二倍体柑橘类型杂交，通 过幼胚获得了三倍体植株。
– 2、获得单倍体和多倍体植株
– 例1：孙敬三等利用小麦 X玉米获得了小麦 单倍体。
? 例2：伊华林等以柑橘异源四倍体杂种为 父本与单胚的二倍体柑橘类型杂交，通 过幼胚获得了三倍体植株。
? 3、打破种子休眠，促进胚萌发
? 例：Arrillaga 等（1992）证明用各种方 法处理未经层积处理的花白蜡完整种子， 都不能明显提高种子的发芽率，但将种 子浸泡24h后，取出胚进行离体的胚培养， 胚萌发率高达90%以上。因此他们认为 离体胚培养可以解除种子休眠。
? 5、克服种子生活力低下和自然不育性， 提高种子发芽率
? 例：Musa balbisiana 是商品香蕉的1个 野生亲缘物种，其种子在自然条件下不 能萌发，然而通过离体胚的培养很容易 产生幼苗
? 2.配子之间是否有识别过程以至特异 ? 结合？
? 3.配子融合的动力学机制？
? 4.植物如何避免多精入卵问题？
? 5.受精对卵细胞的激活作用始自何时？ ? 通过何种机制？何种信号？
试管受精（test-tube fertilization）
将胚珠或子房在离体培养的条件下进行授粉和 受精的方法。（ 60年代）
IVF的研究意义
1. 为受精生物学的重要理论问题的探索与解决 开辟了新的途径；
2. 用于遗传育种中可以克服自交不亲和性，进 行作物改良。
离体受精所能克服的是那些以花粉 —柱头或花粉 — 花柱相互作用为基础的不亲和障碍，并不是万能的。
中央细胞和精细胞的融合及发育
当前热点问题
利用离体受精系统研究受精与早期胚胎发生过程 中的基因表达，是本领域研究由细胞水平进入分 子水平的新趋势，主要工作是
4. 核融合——融合过程中的信号问题
离体受精的细胞学研究现状
1. 配子识别 ——判别糖蛋白的作用 2. 膜融合——多精入卵问题的探讨 3. 胞质融合 ——精细胞质全部进入卵细胞
4. 核融合——融合过程中的信号问题
核融合一般在精—卵融合后35-90min 出现 。烟草卵细胞 有明显的极性即液泡端和胞质端，但无论精子在卵细胞 哪一端融合，卵细胞质都可很快地移向精核处将其纳入 并包被。
Feeder Cell:
未成熟胚悬浮细胞或小孢子细胞
Feeder Cell促进被饲养物生长的原因：
1）增加细胞密度 2）细胞旺盛分裂或分化过程中产生活性物质
——生长促进因子 (GPF) （维持细胞分裂、生长和发育所必需的）
从离体受精到植株开花约 需100天，形成的籽粒具 有正常发育的胚和胚乳。
目前，唯一一例离体融 合产生的合子培养获得再 生可育植株是在 玉米中实 现的。
3. 胞质融合 ——精细胞质全部进入卵细胞 4. 核融合——融合过程中的信号问题
离体受精的细胞学研究现状
1. 配子识别 ——判别糖蛋白的作用 2. 膜融合——多精入卵问题的探讨
3. 胞质融合 ——精细胞质全部进入卵细胞
体内自然受精过程中，至少部分被子植物的精细胞质未 能进入卵细胞；而在离体受精时，精细胞质则 全部进入 卵细胞 。
三 、植物胚胎培养的内容
1、胚培养 （1）成熟胚培养 （2）幼胚培养 2、胚珠培养 3、子房培养 4、胚乳培养 5、植物离体受精
三 、植物胚胎培养的内容
1、胚培养 （1）成熟胚培养 （2）幼胚培养 2、胚珠培养 3、子房培养 4、胚乳培养 5、植物离体受精
? 1.来自同一花粉管的两个精子是定向 ? 还是随机运动到卵细胞或中央细胞？
离体受精的技术基础 （二）
2. 单对配子融合
1) 微电融合
85%融合率，只有此法融合的产物再生了植株。
2) 高钙—低PH介导融合
电融合方法的代替技术。
3) 一般钙条件融合 4) PEG诱导的融合
离体受精的技术基础 （三）
3. 人工合子的培养
培养方法 ——目前常采用 微室饲养 培养 将商品通过室底部微孔滤膜吸取周围 饲 养细胞 释放的活性物质，促进其发育。
离体受精（IVF）
指在离体环境中完成 被子植物的精、卵融合 而且利用受精所产生的“离体合子”培养再生植 株，做到整个受精与胚胎发育过程完全在离体条 件下完成。（ 90年代）
离体受精的技术基础 （一）
1.配子分离
1) 卵细胞的分离
a. 酶学的方法 b. 直接解剖法
2) 精细胞的分离
a. 渗透压冲击法 b. 机械分离法
IVF的研究意义
1. 为受精生物学的重要理论问题的探索 与解决开辟了新的途径；
2. 用于遗传育种中可以克服自交不亲和 性，进行作物改良。
离体受精的细胞学研究现状
1. 配子识别 ——判别糖蛋白的作用
利用分离的雌、雄配子对其细胞膜特征，如表面膜蛋白 特别是糖蛋白的分布等直接进行分析，这可以帮助判断 糖蛋白在被子植物中是否和在动物及低等植物中一样是 配子识别必不可少的；
二 、植物胚胎培养的意义
? 1、克服杂种胚的败育，获得稀有杂种 ? 例：程桂琴等（2000）通过离体胚培养
成功地获得了纤毛鹅观草和5个四倍体小 麦种（品种）的属间杂种植株及愈伤组 织，有效地克服了纤毛鹅观草和四倍体 小麦杂种胚发育小的问题。
– 2、获得单倍体和多倍体植株
– 例1：孙敬三等利用小麦 X玉米获得了小麦 单倍体。
2. 膜融合——多精入卵问题的探讨 3. 胞质融合 ——精细胞质全部进入卵细胞 4. 核融合——融合过程中的信号问题
离体受精的细胞学研究现状
1. 配子识别 ——判别糖蛋白的作用
2. 膜融合——多精入卵问题的探讨
膜融合的方式，在不同的离体受精系统中融合的原理是 不同的，一种是精细胞质很快进入卵细胞，精细胞膜作 为其中的一部分参与了受精卵细胞膜的重组。另一种是 精细胞整体进入卵细胞，精细胞膜并不参与融合产物细 胞膜的形成。