水稻叶片灰白转黄突变体pyr1的鉴定与基因定位

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(6): 992−998/zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2011AA10A100), 国家自然科学基金项目(31171178)和重庆市攻关项目(CSTC, 2012ggc8002)资助。

*通讯作者(Corresponding author): 何光华, E-mail: hegh@第一作者联系方式: E-mail: kischengxin@Received(收稿日期): 2012-11-12; Accepted(接受日期): 2013-01-05; Published online(网络出版日期): 2013-03-22. URL: /kcms/detail/11.1809.S.20130322.1737.005.htmlDOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00992水稻叶片灰白转黄突变体pyr1的鉴定与基因定位程 欣 任德勇 马 娇 朱晓燕 桑贤春 凌英华 赵芳明 何光华*西南大学水稻研究所 / 转基因植物与安全控制重庆市市级重点实验室 / 南方山地农业教育部工程研究中心, 重庆 400716摘 要: 鉴定和克隆叶色突变基因对于深入了解叶绿素合成、降解途径的关系以及植物的光合作用有着重要的作用。

从EMS 诱变恢复系缙恢10号后代中鉴定出1个灰白转黄突变体pyr1, 该突变体在苗期部分死亡, 整张叶片呈现灰白色, 在不同的生育时期叶片呈现不同的颜色, 直到孕穗期叶片上部和叶缘表现黄色。

苗期到抽穗期突变体叶绿素含量比野生型显著或极显著降低。

透射电镜观察表明, 突变体与野生型细胞结构无明显差异, 但叶绿体发育异常, 内部大量降解, 基质片层退化。

遗传分析表明该性状受1对隐性基因控制, 利用326株F 2隐性定位群体将PYR1基因定位在第1染色体长臂上, 位于标记RM11722和Ind1之间, 物理距离约92 kb, 本研究为PYR1基因的图位克隆奠定了基础。

关键词: 灰白叶; 水稻(Oryza sativa L.); 叶绿体; 基因定位Identification and Gene Mapping of Leaf Pale Yellow-Revertible Mutant pyr1 in RiceCHENG Xin, REN De-Yong, MA Jiao, ZHU Xiao-Yan, SANG Xian-Chun, LING Ying-Hua, ZHAO Fang-Ming, and HE Guang-Hua *Rice Research Institute of Southwest University / Chongqing Key Laboratory of Application and Safety Control of Genetically Modified Crops / Engineering Research Center of South Upland Agriculture, Ministry of Education, Chongqing 400716, ChinaAbstract: It is important for the further understanding of the relationship between chlorophyll synthesis and degradation pathways and plant photosynthesis to identify and clone leaf color mutant gene. A leaf pale yellow-revertible mutant temporarily designated as pyr1 was obtainted from the progeny of rice (Oryza sativa L.) restorer line Jinhui 10 which was induced by ethyl methane sul-fonate (EMS). In the seedling stage, the whole leaf of mutants presented pale and some mutants died. The pyr1 displayed different colors in different growth periods. At the booting stage upper-leaf and leaf margin exhibited yellow. Compared with the wild type, the chlorophyl contents of pyr1 mutant decreased from seedling stage to filling stage. Transmission electronic microscopy obser-vation showed that the structure of cells had no obvious differences between mutant and wild type, but the chloroplast developed abnormally with degradation of the inside and matrix slices. Genetic analysis revealed that the trait was controlled by one reces-sive gene. With 326 recessive individuals from the F 2 segregation population, the PYR1 gene was finally mapped between RM11722 and Ind1 on the long arm of chromosome 1, with an approximate physical distance of 92 kb. These results provide a basis of PYR1 gene cloning by map-based strategy.Keywords: Pale leaf; Rice (Oryza sativa L.); Chloroplast; Gene location光合作用完成光能到化学能的转换, 对植物生命活动起着重要的作用。

光合作用主要是在叶绿体上进行, 叶绿体是植物细胞所特有的半自主性细胞器, 也是叶绿素、脂类、淀粉和氨基酸的合成场 所[1-2]。

叶绿素合成与叶绿体发育紧密相关, 涉及到叶绿体基因和核编码基因的协同表达[3], 尤其是编码质体蛋白的核基因的表达, 依赖于叶绿体的发育和代谢状态[4]。

叶色突变是自然界中比较常见的突变形式, 以其突变频率高、性状明显、易于鉴别等特点, 很早就被人们所关注和研究。

由于导致突变第6期程欣等: 水稻叶片灰白转黄突变体pyr1的鉴定与基因定位993的基因往往对叶绿素合成和降解途径产生直接或间接的影响, 改变叶绿素含量, 从而导致叶色变化, 因此也被称为叶绿素缺陷突变体[5]。

近些年, 叶色突变体的应用价值受到越来越多的青睐, 叶色变异可作为标记性状, 简化良种繁育和杂交育种[6]。

具有某些特殊优良性状的叶色突变体, 也为作物遗传育种提供了优异的种质资源[7]。

另外, 随着水稻、拟南芥等模式植物基因组序列的公布, 叶色突变体在功能基因组学上的研究价值正受到越来越多的关注, 已成为研究植物光合系统结构[8-9]、激素生理和抗病机制[10-11]以及基因功能和调控机制[12]的理想材料。

自20世纪30年代以来, 在拟南芥、水稻、玉米、高粱、棉花、小麦、大麦和大豆等高等植物中均有叶色突变体的报道[12-14], 水稻叶色突变基因在染色体上的分布比较广泛, 据不完全统计, 目前报道的已超过80个, 其中白化、黄化叶突变体最多, 部分叶色突变基因已经被定位[15-17], 至少有6个已被克隆, 如控制突变性状的编码镁离子螯合酶的OsCHLH基因[18]; 编码叶绿素a加氧酶(chlorophyll a oxygenase, CAO)的OsCAO基因[19]以及编码叶绿素合成酶的YGL1基因[20]。

这些基因大多是通过图位克隆的方法获得的。

大多数水稻叶色突变在苗期表达, 出现诸如白化、黄化、浅绿、条纹、斑点等表型。

本研究利用EMS诱变恢复系缙恢10号, 获得一个新型的灰白转黄突变体pyr1, 该突变体叶片苗期呈现灰白色, 在不同生育期表现不同颜色, 至孕穗期叶片呈黄色。

本文对其进行了表型鉴定、遗传分析和分子定位等研究。

1 材料与方法1.1材料在EMS诱导籼稻恢复系缙恢10号(Jinhui 10)后代中发现1个灰白转黄突变体pyr1, 连续多代种植观察, 突变表型稳定遗传。

以缙恢10号为野生型对照。

1.2 叶绿体色素含量测定上午9:00, 选取种植小区中间5个单株, 在苗期、抽穗期分别测定pyr1及其野生型叶片中部的叶绿体色素含量。

计算参考Lichtenthaler的方法[21]。

1.3细胞结构观察参照何瑞峰等[22]的方法用电镜观察突变体和野生型叶片的细胞结构。

以戊二醛和锇酸双重固定后, 利用不同梯度的乙醇逐级脱水, 再置换和包埋, 超薄切片后, 以醋酸双氧铀和柠檬酸铅液双重染色, H600型透射电镜观察并照相。

1.4农艺性状在植株成熟后, 分别选择缙恢10号和pyr1突变体小区中间10株, 考查株高、有效穗、每穗粒数、每穗实粒数、千粒重、结实率等主要农艺性状。

1.5 DNA的提取和连锁标记的筛选参照Michelmore等[23]的BSA法筛选连锁标记, 即从F2植株群体中分别选取10株正常单株和10株突变单株, 剪取等量叶片, 采用改良的CTAB法提取DNA[24], 构建正常基因池和突变基因池。

采用碱煮法提取定位群体单株DNA用于连锁分析[25]。

1.6 SSR扩增分析SSR引物序列参照/mi-crosat。

PCR总体积25 μL, 包括2.5 μL的10×PCR buffer (+Mg2+), 0.5 μL的2.5 mmol L−1 dNTPs, 17.75 μL的ddH2O, 2.0 μL的10 μmol L−1引物, 2.0 μL的模板DNA和0.25 μL的5 U μL−1Taq DNA聚合酶。