芒果SSR_PCR反应体系的优化

基 金 项 目 ： 国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 (No. 30760147) ， 广 东 省 农 业 攻 关 计 划 项 目 (No. 2005B20901026) ， 农 业 科 技 成 果 转 化 资 金 项 目 (No. 2008GB48B06) ， 林业科技支撑计划项目 (No. 2006BAD01A1705) ， 公益性行业科研专项经费项目 “ 芒果规范栽培及冷藏贮藏技术研究 ” 资助 。 第一作者简介 ： 黄丽芳 ， 女 ， 1985 年生 ， 在读硕士研究生 。 研究方向 ： 果树分子生物学 。 E-mail ： hlf032@ 。 * 通讯作者 ， 雷新涛 ， E-mail ： xtlei@ 。 收稿日期 ： 2010-01-13 修回日期 ： 2010-02-08
２．２．２
不 同 浓 度 的 ｄＮＴＰｓ 对 ＰＣＲ 反 应 体 系 的 影 响
结果平均值
模板 DNA/ng
由方差分析 可 知 ， dNTPs 的 浓 度 是 影 响 芒 果 SSR-PCR 的另一重要因素 。 由图 3 可知 ， 在 0.1～0.4 mmol/L 时随
AY942825
(CGG/CCT)
R:CGAATACCATCCAGCAAAA TAC
Taq 酶、 模板 DNA、 引物）进行 5 水平正交实验设计 （表2）。
Taq /U
表 2 SSR 反应体系 L25（56） 正交实验设计
Mg /(mmol/ L) 1.8
dNTPs /(mmol/L) 0.1
Taq /U
31 卷
图 1 金煌 SSR-PCR8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
2 5 14 22 20 12 21 22 23 24 25 4 15 9 10 17
1 3 16 10 10 18
2
表 4 PCR 反应各因素间方差分析
SS MS
DF
F 2.81 5.92 1.98 9.24 2.93
Pr>F
4
224.526 6
表 1 2 对芒果 SSR 引物
，，，，，，，，，，，，，，，，，， ，， ，
，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，，
，，，，，，，，，，，，
F: AGA TTTAAAGCTCAAGAAAAA R: AAAGACTAATGTGTTTCCTTC
AY628376
(GA)
F:CGAGGAAGAGGAAGATTATGAC
dNTPs ， 影 响 最
小 的 为 Taq 酶 ， 见表 4 。
Mg
dNTPs
２．２．１
不同浓度
Taq
的 模 板 ＤＮＡ 对
DNA
ＰＣＲ 反 应 体 系 的
影响 模 板 DNA 的浓度变化对实 验结果影响最大 。 由图 1 可知， 模
Error
Corrected Total
板 DNA 在 20 ng （1 、 9 、 12 、 20 、 23 号 处 理 ） 和 40 ng 从 图 2 可 见 ， 模 板 DNA 在 20 ～40 ng 时 ， 结 果 均 值 递 减 ； 在 40 ～100 ng 时 ， 结果 均值是递增 的 。 对 DNA 各 水 平 进 行 因 素 内 多 重 比 较 ， 结 果 表 明 ， 20 ng 和 40 ng 与其他水平差异极显著 ， 60 、 80 ng 与 100 ng 差异不显 著 。 因此 ， 选定模板 DNA 的最佳浓度为 80 ng 。
２
结果与分析
按表 2 设计的 25 个处理进行 PCR 反应后 ， 获得的产物通过 8％ 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ， 结果见
２．１ ＰＣＲ 正交实验设计
412
图1。 依照评分标 准， 图 1 各处理 的记分 见 表 3。 2 次重复计分结果 较一致 。
bp 600 500 400 300 200
２．２
正交实验结 将以上处理
果分析 和评分结果 用
SAS V8 进 行 分
析 。 由 F 值可知 ， 各因素水平变化 对 PCR 反 应 影 响 的显著性依次为 ： 模 板 DNA>dNTPs
1 2 3 4 5
> 引 物 >Mg2 +>Taq
酶 ， 即 模 板 DNA 对反应的影响最 大， 其次就是
３期
１．１．２ １．２ １．２．１
主要试剂与仪器 方法
购于大连宝生物工程公司 。 PCR 反应在 Eppendorf TP650 型扩增仪上进行 。 基因组 ＤＮＡ 的提取
琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 DNA 的 浓 度 和 纯 度 ， -20 ℃ 保存备用 。
１．２．２
ＰＣＲ 的扩增和正交实验设计
关键词 芒果 ； SSR ； 正交设计 ； 体系优化
doi
10.3969/j.issn.1000-2561.2010.03.014 S667.7
中图分类号
芒果 （Mangifera indica Linn. ） 是典型热带水果 ， 属于漆树科芒果属 ， 原产于亚洲南部热带的印度 ， 缅 甸等国家 ， 全世界大约有 1 000 多个品种 。 中国已有国内外种质资源 200 份左右 [1]， 分布在海南 、 广东 、 广西 、 云南 、 台湾等地 。 芒果果实外观美丽 ， 果肉细嫩 、 香甜 ， 具有特殊风味和较高的营养价值 ， 对于 热带及亚热带地区 ， 具有较高的经济效益 [2]。 分子标记是一种快速高效的遗传分析方法 ， 已得到广泛的应用 。 RAPD 、 AFLP 、 锚定 SSR 、 ISSR 等 在芒果的分类及遗传多样性分析上均有研究报道 [3-6]， Viruel 等 [7]人用 16 对 SSR 引物区别了 28 个芒果品种 的胚性及其地理学上的差异 。 简单重复序列 （Simple sequence repeats ， SSR ）， 又称微卫星 DNA ， 该标记 呈共显性 ， 数目多且在基因组中均匀分布 ， 多数位点呈选择中性 ， 符合孟德尔遗传学理论 ， 甚至部分降 解的 DNA 样品也可用 ， 结果稳定性好 [8]。 SSR 标记检测的位点多态性水平明显高于 AFLP 标记 ， 重复性优 于 RAPD[9]， 且 SSR 比 AFLP 操作简便 ， 花费较少 ， 现已广泛应用于水稻 、 小麦 、 热带牧草 、 玉米等作物 的研究中 [10-13]， 然而在果树上的研究相对较少 ， 尚未见芒果 SSR-PCR 优化体系的研究报道 ， 为此本文利 用正交实验设计方法 ， 对影响芒果 SSR-PCR 反应体系中的因素进行了优化 ， 建立较为完整可靠的芒果 SS
40
0.5
1.25 1.5
80
0.4
17
2.4
0.2
60
0.1
100 60
0.5
182Leabharlann 40.30.580
0.2
0.75 1
0.4
19
2.4
0.4
0.75 1
100 20
0.3
80
0.5
20
2.4
0.5
0.4
1.25 1.5
100 20
0.1
21
3.0
0.1
1.5
80
0.3
0.2
22
3.0
0.2
0.5
R 反应体系 ， 以期为芒果种质资源的进一步研究奠定基础 。
１
１．１
材料与方法
材料 植物材料 小菲芒 、 海豹芒 、 粤西一号芒 、 zill 、 串芒 、 台农一号芒 、 白象牙芒 、 林生芒 、 大龙
１．１．１
芒 、 泰国野生芒 、 矮芒 、 夏茅芒 、 三年芒 、 Keitt 、 Neelum 、 Spooner 、 Mallika 、 紫花芒 、 Banbaroo 、 Irwin 、 热农 2 号芒 、 Kent ， 正交实验为金煌芒 。 2008 年定植于中国热带农业科学院南亚热带作物研究所芒果种 质资源圃 ， 大田常规管理 。 2009 年 6 月采集芒果的幼嫩叶片 ， -20 ℃ 保存备用 。
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黄 丽 芳 等 ： 芒 果 SSR-PCR 反 应 体 系 的 优 化
411
β- 巯基乙醇 、 Tris-base 等均购自北京鼎国生物公司 。 TaqDNA 聚合酶 、 dNTPs
利用改良 CTAB 法 ， 提取芒果基因组 DNA [14]。 运用核酸蛋白测定仪和 1％
[15]
正交实验所用引物为 AY628376[7]， 体系 验 证 引 物 为 AY942825 ， 上 海 生 工 生 物工程技术服务有限公司合成， 见表 1。
PCR 扩 增 反 应 初 步 确 定 为 ： 94 ℃ 2.5 min ； 94 ℃ 30 s ， 50 ℃ 45 s ， 72 ℃
恒压 120 V， 电泳 2 h。
DNA/ng 20
/( µmol/L) 0.1
dNTPs / (mmol/L) 0.4
DNA/ng 60
/ (µmol/L) 0.5
0.5
14
0.5
0.2 0.3 0.4 0.5 0.1 0.2 0.3 0.4
0.75 1
40
0.2
15
1.8
0.5
0.75
80
0.1
60
0.3
16
2.4
0.1
1.25 1.5
100 20 60 40
0.4
1.2 1.8 1.8 1.8
0.5 0.1 0.2 0.3
0.5 1 1.25 1.5
40 100 20 40
0.3 0.2 0.3 0.4
23 24 25
3.0 3.0 3.0
0.3 0.4 0.5
0.75 1 1.25