电转染操作流程
Neon电转染操作步骤
Protocol for Neon transfection system (100 μl Tips) 电穿孔技术的原理电穿孔技术是利用脉冲电场改变细胞膜的状态和通透性,达到将DNA导入细胞以及促使细胞发生融合的目的。
该技术目前一方面应用于细菌、真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞的基因转移,另一方面应用于细胞融合,制备杂交细胞和动物克隆等影响电穿孔效率的因素电场强度:电压太低时,细胞膜的改变不足以允许DNA分子通过,而电压过高时又会造成细胞的不可逆损害。
对于大多数哺乳动物细胞而言,250~2500V/cm的电压可获得有效转染[2,3]。
电脉冲形状和长度:电脉冲形状主要有指数衰减式和方波两种,一般需20~100毫秒。
缓冲液:通常使用甘露醇和蔗糖等非离子缓冲液,但有报道认为HEPES缓冲液的转染效率更高,血清也可以提高转染效率[4]。
其它诸如转染温度、DNA浓度和构象等均会对转染效果产生影响。
1.Cultivate the required number of cells (5×105-2×106 adhere cell per each 100ul Neon Tip),the cells should be 70-90% confluent on the day of experiment. 实验前培养足够量的细胞（对于100ul的tip，每个tip需要5×105-2×106 贴壁细胞，可以根据实际情况调整），并使其在实验当天达到70%-90%的汇合度。
2.Pre-warm an aliquot of culture medium containing serum, DPBS and so on.预热实验所需的culture medium，DPBS等。
3.Prepare 6-well plate by filling the wells with 2.0 ml of culture medium containing serum andsupplements without antibiotics and pre-incubate plate in a humidified 37℃/5% CO2 incubator. 准备6孔板，在每孔中加入2.0 mL 不含抗生素的正常培养基，放到倒培养箱中预热。
细胞电转染
细胞电转染电转的简介 (1)电穿孔转染的基本原理及过程 (1)电穿孔转染条件的选择 (1)1 电参数 (1)2脉冲时程 (2)3 脉冲次数 (2)4 细胞因素 (3)5 质粒因素 (3)6 温度 (4)7．缓冲液以及培养液的成 (4)仪器常用键区介绍 (5)Neon TM电转染一般流程 (7)电转的简介电穿孔转染，作为物理方法的一种，出现于20世纪80年代中。
这种方法不仅能够将DNA、RNA，还能将抗体、酶及其他生物活性分子转入细菌、酵母、动物细胞和植物细胞。
它是一种高效、简便的基因转移系统，具有其它转移方法无可比拟的优越性，如操作简便、快捷，可重复性强，臻染率高，适用谱广等。
尤其对目前一般认为难转染的悬浮培养细胞也能获得较高的转染。
电穿孔转染的基本原理及过程电穿孔法是通过电场作用于细胞几微秒到几毫秒之后，在细胞膜上暂时形成小孔或开口，把大分子如DNA等导入细胞并最终进入胞核的技术。
其过程简述如下：首先在电击过程中，细胞膜上出现穿孔，质粒在电泳力的作用下与细胞膜接触，并与细胞膜上电穿孔的区域形成一种可转移的复合物。
再次电击后，质粒脱离复合物并扩散至胞质内，开始瞬转；同时小部分质粒进入核内与染色体整合，开始稳转。
一旦DNA扩散进入细胞，细胞膜上的小孔可自动重新闭合。
电穿孔转染条件的选择1 电参数电场强度E与电压V有以下关系：V=E×d，在电穿孔实验中，d为两电极之间的距离，是一个定值，故本文所指的电场强度的选择即电压的选择。
对于动物细胞来说，电场强度通常选择1～1000V／cm，并遵循低电场长时程的原则。
电场强度的大小对DNA摄入量的影响主要有：在阈电场强度Ec (Ec=Uc／1．5R)以下无R)以下无DNA摄入；适中的场强下DNA的摄入呈电场依赖型，随场强的升高而增大；高场强下，DNA的摄入进入平台期，与电场的大小无关。
电场强度的大小对细胞存活率的影响主要有：在阈电场强度以下存活率无变化；在适中的场强下，存活率呈电场依赖型，随场强的升高而下降；存活率在高场强下降为0。
微生物电转染系统安全操作及保养规程
微生物电转染系统安全操作及保养规程前言微生物电转染系统是生物实验室中的一种基础设施，广泛应用于分子生物学、细胞生物学、遗传学等学科领域。
安全操作和保养微生物电转染系统非常重要，可避免不必要的事故、延长设备寿命、提高实验效率。
本文将详细介绍微生物电转染系统的安全操作和保养规程。
安全操作规程1. 确认设备完好在使用微生物电转染系统前，应确认设备完好无损。
若发现设备损坏或有异样，应及时联系设备维护人员进行维修。
2. 使用合适的电源微生物电转染系统应接入稳定、可靠的电源。
为保证设备安全运行，不要与其他高功率设备共用同一个电源插座。
另外，不得在通电状态下更换电源插头或电源线。
3. 操作前必须了解设备及试剂性质在操作微生物电转染系统前，应仔细了解设备及试剂性质。
操作人员应具有相关实验室操作技能，并熟知微生物电转染系统的使用方法。
4. 操作前应脱酒精或佩戴手套在进行微生物电转染系统操作前，应先进行手部消毒。
可使用70%的酒精在待消毒部位反复擦拭，或佩戴手套。
佩戴手套时应避免使用过期手套，以免产生渗透性或易破裂现象。
5. 禁止穿着不符合场所规定的衣物或饰品在使用微生物电转染系统时不得穿着开放式的衣物、高跟鞋，也不得佩戴任何类似项链、手镯、耳环、戒指等饰品。
如有长发，应把头发妥善束起，以免夹到设备中。
6. 操作过程中应专心、耐心在进行微生物电转染系统操作过程中，应专心、耐心，避免分心或走神。
如有特殊事项需要处理，应先停止操作并告知值班人员，等待处理完成后再继续操作。
7. 操作过程中注意安全在微生物电转染系统操作过程中，应随时注意周围环境，避免过于繁忙的操作、操作时翻倒试剂数、因手部滑动使设备脱离插座等情况发生。
8. 操作完成后及时关机和清洗在微生物电转染系统操作完成后，应及时关机、拆下电源、清洗台面。
如有特殊情况，需要将试剂和设备留存，应进行必要的标识，并告知后续使用操作人员。
保养规程1. 定期维护微生物电转染系统的各种零部件内部连接处松动、腐蚀等问题，可能会导致设备性能下降，使用寿命缩短，因此需要定期进行维护断路等工作。
thp1细胞电转方法
thp1细胞电转方法THP-1细胞是一种来源于人类单核细胞系的模型细胞，广泛用于炎症、免疫和肿瘤等相关研究中。
在研究过程中，需要对THP-1细胞进行电转染，以实现外源基因的转染和表达。
下面将介绍一种常用的THP-1细胞电转方法。
1. 购买所需试剂和试验器材：首先需要购买所需的试剂和试验器材，包括电转剂、细胞培养基、完整培养基、含抗生素的培养基、细胞培养器具（离心管、移液器、离心机等）等。
2. 预处理THP-1细胞：将THP-1细胞解冻后在完整培养基中培养至细胞密度达到80%以上，然后用含抗生素的培养基将细胞转移至新的培养皿中。
3. 调整细胞密度：在进行电转染前，需要将细胞密度调整至适宜的水平。
一般来说，细胞密度应在1×10^6至5×10^6之间。
4. 准备电转剂和DNA：根据电转剂的说明书，合适地稀释电转剂，并将要转染的质粒DNA溶解在含有电转剂的缓冲液中。
5. 进行电转染：将细胞培养皿放入离心管中，加入预先混合好的电转剂和DNA 溶液，轻轻摇动培养皿使其均匀分布，并将离心管置于电转仪中进行电转染。
6. 培养和筛选转染细胞：将进行电转染的THP-1细胞移至含抗生素的培养基中培养，并在接下来的培养过程中定期检查细胞的外观和生长情况，筛选出具有稳定表达目的基因的细胞株。
7. 验证转染效率：通过检测外源基因的表达水平、蛋白质水平或功能性实验等方法，验证转染效率和稳定性。
总结：以上就是一种常用的THP-1细胞电转方法的步骤。
通过合理地进行电转染实验，可以实现对THP-1细胞的基因转染和表达，为相关研究提供有力支持。
当然，在进行电转染实验时，需要注意操作规范，遵守相关实验守则，以确保实验结果的可靠性和准确性。
cho细胞的瞬时电转染方法
cho细胞的瞬时电转染方法
CHO细胞的瞬时电转染方法如下：
1. 以细胞密度、转染试剂的添加量、含目的基因的质粒的添加量为因素，以目的基因的表达量和转染效率为响应变量，进行三因子九水平的均匀设计，获得瞬时转染工艺参数。
2. 根据瞬时转染工艺参数，以质粒的添加量和转染试剂的添加量为因素，以目的基因的表达量和转染效率为响应变量，进行二因子的正交设计，获得包含CHO胞悬液的细胞密度、转染试剂的添加量以及质粒的添加量的瞬时转染条件。
3. 根据瞬时转染条件，向CHO细胞悬液中加入转染试剂和质粒进行瞬时转染，培养，得到重组CHO细胞。
以上方法仅供参考，具体步骤可能因实验条件和目的的不同而有所差异。
如需更多信息，建议阅读专业文献或请教专业人士。
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华）一、基础理论转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。
分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。
病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。
但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。
其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。
需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。
影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。
二、转染操作流程（以常用的6孔板为例）(1) 细胞培养：取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。
(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。
(2) 转染液制备：在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL；轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。
(3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。
(4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。
三、转染注意事项1. 血清A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。
B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。
细胞电转仪操作流程
细胞电转仪操作流程
1. 细胞准备：
收集并洗涤细胞，调整细胞浓度至推荐范围，通常在10^6-10^7 cells/mL之间。
如果需要，对细胞进行特定处理，如饥饿或预热等。
2. 核酸准备：
根据实验要求准备好适量的DNA或RNA溶液，计算出每个样品所需的体积和浓度。
3. 混合细胞与核酸：
将细胞悬液与核酸溶液轻轻混匀，按照设备手册建议的比例加入到电转杯中。
4. 设置参数：
打开细胞电转仪，根据细胞类型、细胞数量以及所用仪器的操作手册设置合适的电压、脉冲长度、脉冲次数及脉冲间隔等参数。
5. 装载电转杯：
将含有细胞和核酸混合物的电转杯放入电极板之间，并确保电极接触良好。
6. 执行电击：
启动电转程序，按照预设的条件进行电转化。
7. 恢复培养：
电转完成后，迅速将电转杯中的细胞转移至预冷的含血清或其他营养成分的缓冲液中，以终止电穿孔效应，降低细胞毒性。
8. 孵育与检测：
继续将细胞在适宜温度下孵育一段时间，以便核酸整合入细胞内并表达。
在合适的时间点可以通过荧光显微镜观察、PCR扩增、Western Blot检测、流式细胞术分析等方式验证转染效率。
9. 后续处理：
根据实验目的，可以进一步进行细胞培养、基因表达功能研究、药物筛选等下游实验。
电穿孔转染质粒DNA
质粒的构建：1. 酶切反应按照1ugDNA需1-10u内切酶的用量，在反应体系中加入相应的10×缓冲液，内切酶的体积不得大于总体积的十分之一，ddH2O补足体系，如需长时间消化，还需加入适量的BSA 已稳定内切酶活性。
2. DNA片断的回收欲回收的DNA片断经琼脂糖凝胶电泳分离后，切下所需片断所在的凝胶（胶的体积尽可能小），加入3倍体积的BufferQX1,及适量的QIAXⅡ(Glassmilk),55℃10分钟，每隔2分钟涡旋1次，待凝胶完全溶解，12000转离心1分钟，BufferQX1洗涤沉淀1次以消除剩余凝胶.。
再用BufferB洗涤沉淀2次，将沉淀晾干，加入适当体积的ddH2O,离心后收集上清，琼脂糖凝胶电泳确定回收效率。
3. DNA片断3凹端的补平于Eppendorf管中依次加入DNA0.2-5ug,2mMdNTP2ul,人以一种酶切缓冲液（10×）2ul,加水至19ul。
然后加入1-5单位Klenow酶，混匀后室温下反应15分钟。
待补平反应结束后，于65℃水浴20分钟使Klenow酶失活，电泳定量后即可用于连接反应或-20℃保存备用。
4. DNA片断3凸端的补平于Eppendorf管中依次加入DNA0.2-5ug,2mMdNTP2ul,人以一种酶切缓冲液（10×）2ul。
,加水至19ul。
然后加入1-2单位T4噬菌体DNA聚合酶，12℃温育15分钟，于75℃加热10分钟，使T4噬菌体DNA聚合酶灭活。
5. 载体的脱磷酸化：载体质粒经内切酶酶切后可直接进行脱磷酸化处理。
40ul的酶切反应体系，景点永建车酶切完全后可加入10×CIAP（牛小肠碱性磷酸酶）缓冲液5ul,水4ul和适量CIAP进行脱磷酸化反应。
CIAP的用量依载体5端磷酸的摩尔数及末端性质而定，对于5突出的末端，每100pmol 5末端磷酸需1单位CIAP，对于5凹端或平末端，每2pmol 5端末端磷酸需1单位CIAP,一般2ug 5kb的线性化质粒DNA约翰1.4pmol 5端磷酸。
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Neon TM
电转染一般流程
1． 电穿孔前一至两天，将细胞转移至装有新鲜培养基的培养皿中，保证实验当天细胞量达
到70-90%。
2． 加培养基（不含抗生素）到24孔板中，每孔500µl ，放于37℃培养箱预热。
（注：使用
其他孔数培养板或者100µl 枪头时，加入培养基和质粒及细胞的数量见下表1） 3． 将培养细胞取出，悬浮细胞直接取部分培养的细胞计数，确定细胞密度；贴壁细胞用2ml
的PBS 冲洗细胞，吸出PBS ，加入约750µl 胰酶消化3min ，加入750µl 培养基，终止消化，取部分细胞悬液进行细胞计数，确定细胞密度。
4． 将悬浮细胞转到离心管，室温下100-400g 离心力离心5min ，倒掉上清。
5． 向细胞中加入2mlPBS 冲洗细胞，室温下100-400g 离心力离心5min 。
6． 吸出PBS,用重悬缓冲液R 重新悬浮细胞沉淀，最终使细胞密度为2.0×107个/ml 。
轻轻
吹打细胞，使其形成单细胞悬液。
（注：细胞悬液在室温时间不能超过15-30min ,否则将导致细胞活性和转染效率降低）
7． 将适量质粒加到1.5ml 离心管中，再加入细胞悬液，轻轻混匀。
所用细胞浓度、DNA 和
接种体积见下表1）。
8． 将装有3ml 电解缓冲液E 的Neon TM 管插入移液器架中。
9． 在仪器上设置脉冲电压、脉冲宽度、脉冲数。
10．将枪头插入NeonTM 移液器中，用10µl 的枪头吸细胞混合液，枪头中必须无气泡。
将带有样品的NeonTM 移液器垂直插入NeonTM 管中。
11．选择电穿孔方案，并按下触摸屏上的Start （开始）键。
12．电脉冲释放后，触摸屏上会显示完成，提示电穿孔完成。
13．将脉冲好的样品立即转移至准备好的装有预热培养基的培养板中。
将培养板放到培养箱培养。
14．实验结束后，倒掉移液器中E 液，关闭电转仪。
注意：1．加R 液体积=四大格细胞总数/（4×104）×细胞液体积/（2.0×107）。
2．加入质粒体积=加入质粒的量/质粒浓度。
3．加入细胞悬液体积=需加细胞数量/细胞悬液浓度。
4．每个枪头最多只能用2次。
5．Neon TM 管装入的3ml 电解缓冲液E 可用10次电转化。
6．Neon TM 管中加入3ml 电解缓冲液，用10µl 枪头时加E 液,100µl 枪头时用E2液。
表1
NeonTM 枪头 平板培养基的体积 细胞数量（个） 规格 每孔表面积(cm2)
DNA(µg) 10µl 100µl 96孔 0.3 0.2-0.3 √ 100µl 1-3×104 48孔 0.7 0.3-0.7 √ 250µl 5-7.5×104 24孔 2 0.5-1.5 √ 500µl 0.5-1.5×105 12孔 4 0.5-3.0 √ 1.0ml 1-3×105 6孔 10 2.0-4.0 √ √ 2.0ml 0.5-1×106 60mm 20 4.0-8.0 √ 5ml 2-4×106 10CM
60
8.0-16
√
10ml
4-8×106。