分子生物技术在医学中的应用

二十世纪生物医学发展的主要特点之一是对生命 现象和 疾病本质的认识 逐渐向分 子水平深 入。 DNA 双螺旋结构的发现为分子医学和基因医学的发展奠定 了基础。人们逐渐认识到 , 无论健康或疾病状态都是 生物分子及其相互作用的结果 , 生物分子中起关键性 作用者为基因及其表达产 物蛋白质, 因 此从本质上 说, 所有的疾病都可以被认为是 ! 基因病∀ 。近十年 来, 分子生物技 术已成为医学领域最有 力的研究工 具, 以下从基因工程技术、人类基因组计划与核酸序 列测定技术、基因诊断与基因体外扩增技术、生物芯 片技术在医学研究中为了解疾病的发生发展机制 , 诊 断和药物研制、开发中的应用。 1 基因工程技术 二十世纪七十年代初 , 由于基因重组技术得到发 展, 基因工程逐步发展成一套成熟的技术。将需要表 达的产物的目的基因 , 经分离、扩增、拼接入一定的 载体 , 然后植入表达用的菌体 ( 大肠杆菌、酵母菌或 真核细胞) , 通过生物复制表达出所需的产物 , 经分 离纯化, 制成产品。这一过程从研究到工业化已逐步 实现规范化, 并与制药工业结合起来, 形成规模化生 产。迄至 1999 年 , 美国批准上市的基因工程药物约 40 种, 而我国 上市 的约 12 种 , 仅有 一种 是独 创的 ( rHUIFNa1b) , 其余均是仿制。 1 1 施基因工程的途径 通过分离细胞 mRNA 逆转并扩增 ( RT - PCR) 目
医疗装备 2004 第 12 期
学技术操作复 杂、自动化程 度低、检测 效率低的不 足, 为了解疾病的发生发展机制、诊断和药物筛选提 供前所未有的信息量 , 既具有重大的基础研究价值, 又具有明显的临床应用前景。以下重点讨论了基因芯 片技术及其在医学研究中的应用。 4 2 基因芯片技术的基本原理 基因芯片 ( gene chip) 又 称 DNA 芯片、 DNA 微 阵列 , 是将许多预先设计好的寡核苷酸或基因 ( cD NA) 片段作为探针 , 有序地、高密 度地 ( 点与点之 间的距离一般小于 500km) 排列在玻璃、硅片或尼龙 膜等载体上, 制成 DNA 微阵列 ( DNAmicroarray) , 将 待测样品 DNA/ RNA 通过 PCR/ RT - PCR 扩 增、体外 转录等技术掺入荧光标记分子后, 与位于芯片上的探 针杂交, 再通过激光共聚焦荧光扫描系统检测探针分 子杂交信号强度 , 并配以计算机对荧光信号进行综合 分析后 , 即可获得 样品中大量基因序列 及表达的信 息, 由于常用硅芯片作为固相支持物, 且在制备过程 运用了计算机芯片的制备技术 , 所以称之为基因芯片 技术。 基因芯片种类较多 , 根据微阵列上探针的不同, 可分为寡核苷酸芯片和 cDNA 芯片两类。寡核苷酸芯 片是将寡核苷酸原位合成或合成后固定在芯片上 , 曝 露于标记样本 DNA 杂交 , 根据杂交信号出现部位的 寡核苷酸序列推测与其互补的 DNA 序列。可用于基 因发现、突变检测、表达监控和遗传制图 等。 cDNA 芯片 是将 cDNA 固定在芯 片上并曝露于 一组标记探 针, 可用于大尺度筛选和基因表达的研究。按照用途 可分表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、测序芯 片、毒理芯片等。 基因芯片的制备方法也可基本分为两类 : 一类是 原位合成 ; 一类是直接点样。原位合成是指直接在芯 片上用四种核苷酸合成所需的探针 ; 而直接点样是指 将已经合成好的探针定位在芯片上 , 待分析基因在与 芯片结合探针杂交之前必须进行分离、扩增及标记。 基因芯片技术主要包括四个主要步骤: 芯片制备、样 品制备、杂交反应及信号检测和结果分析。根据样品 来源、基因含量及检测方法和分析目的的不同, 采用 的基因分离、扩增及标记方法也各异。为了获得基因 的杂交信号必须对目的基因进行标记, 目前采用的最 普遍的是荧光标记方法。用计算机控制的高分辨率荧 光扫描仪可获得结合于芯片上目的基因的荧光信号, 通过计算机处理即可给出目的基因的 结构或表达信 息。杂交条件的选择与研究目的有关; 多态性分析或 29
Medical Equipment Vol 17, No 12
于核酸丝状体扩增、 BD Bioscience 公司的丝状体移置 扩增及 Gen- Probe 公司的中介转录扩增等。虽然对 各种病原体作了大量的比较研究, 但尚不清楚采用不 同的扩增方法在所获得的检测水平之间存在着怎样的 显著差异。目前认为 , 这些 新技术中 PCR 法灵敏度 较高。 3 4 分子流行病学 以往临床医学常常认可微生物病原体的实验技术 特性 , 但是标准的表现型方法 , 如血清分型、生物分 型和噬菌体分型等方法 , 在流行病学的 应用是有限 的。这些方法大多数是可变的 , 速度缓慢, 劳动强度 大。而基于 DNA 的分型方法可解决上述问题, 目前 已是深受欢迎的进行流行病分型的技术。应用较广泛 的分子分型方法有质粒照型、质粒和基因 DNA 的限 制核酸内切酶分析、采用特异 DNA 探针的混合分析, 以及采用脉冲场凝脉电泳或基于 PCR 方法的染色体 DNA 造型。所有这些方法都用电场来分离 DNA 碎片, 全部染色体或质粒进入独特图形或 ! 酶解图谱 ∀。用 溴化乙锭作染色或用核酸探针混合可见到这些图谱。 一般来说 , 分子分型已用来确定不同的分离菌对一次 或多次试验是否给出相同的或不同的结果。与流行病 相关的分离菌共用相同的 DNA 图形或 ! 酶解图谱 ∀。 但是与非流行病或流行病无关的分离菌则具有明显不 同的图形。如果取自不同病人的分离菌共用同一 ! 酶 解图谱∀ , 那是因为它们可能源于同一细胞系 , 和由 同一源或同一机理从一病人传给另一病人。同样 , 如 果从一病人身上多次分离出来一种微 生物的相同菌 株, 此种微生物很可能侵染或移到病人身上 , 这对研 究个别病人中移居和侵染分离菌之间的关系 , 辨别侵 染菌株的污染情况, 了解住院病人间的传染情况 , 评 估正接受传染治疗的病人是再次受到传染还是病情复 发, 以及密切关注抗菌抵抗株在医院中和不同医院间 的传播上具有重要的临床意义。 4 4 1 基因芯片技术 概况 生物芯片技术是随着 ! 人类基因组计划∀ 的进展 而发展起来的, 它是二十世纪九十年代中期以来影响 最深远的科技进展之一, 为 ! 后基因组计划∀ 时期基 因功能的研究提供了强有力的工具。生物芯片技术包 括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片以及 元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯 片等新型生物芯片, 它可以大规模、高通量地对成千 上万个基因进行同时研究 , 从而克服了传统分子生物
分子生物技术在医学中的应用
刘 华 ( 信阳中心医院器械科 , 河南信阳 464000)
文章编号 1002- 2376 ( 2004) 12- 0027- 04 中图分类号 TN919 2 文献标识码 A
摘
要
分子生物学近年来发展迅速 , 分子生物学研究的技术可使我们得以高分辨率 、 高敏感性和高 通
量的对成千上万个基因进行同时研究分析 , 在基因组水平上研究基因表达 , 在医学生命科学研究中主要应用 于 新基因发现 、 基因表达分析 、 基因突制与开发等 。 本文对分子生物技术在医学中主要应用 、 存在问题 、 相关仪器及进展作简要综述 。 关键词 分子生物学 ; 医学 ; 基因
收稿日技术拼接入载体, 转录 载体菌 , 构建工程菌。用生物复制方法培育工程菌, 从工程菌分泌液或包含体中分离表达产物, 经过变性 和复性, 取得表达产物的电泳图谱或少量纯品。经分 析鉴定证明表达产物是正确的。 1 1 2 中游工程 扩大至中试规模 , 确定各步工艺的条件至取得一 定量的产品, 进行审批所需的各项检测及质控, 并进 行必要的生物验证。 1 1 3 下游工程 扩大至满足市场需要的生产规律, 取得规律生产 的效益。 1 2 我国的现状及存在问题 目前我国工程菌的构建一般在条件较好的科研院 所和高校中进行 , 当务之急是尽快加强 基因功能研 究, 寻找一批有开发价值的 基因, 加强 国内国外合 作, 对我国自主克隆的基因进行全面功能分析, 开发 出有我国自主知识产权的基因组药物或产品。 我国的基因工程中试研究是一个薄弱环节, 在人 类后基因组计划实施中, 应重视建立专业化的中试基 地和生物技术孵化器 , 克服中试环节的瓶颈效应 , 加 快成果转化。人类后基因组计划含有巨大商机, 有胆 识的企业家和金融家加入到人类后基因组计划研究是 基因工程产业腾飞的机遇 , 因为发展我国基因工程产 业, 需要大量的资金, 一套中游工 程设备需要 50100 万美元。解决这三个阶段中资金问题是将构建成 的工程菌转化成生产力的重要保障 , 同时研究开发出 符合国情、经济、实惠的设备产品 , 也是解决我国发 27
每个碱基测序费用也越来越低 , 为顺利完成伟大的人 类基因组计划奠定了基础。 1999 年已公开声明完成 了人体 23 对染色体里 30 亿碱基对中的 10 亿个 DNA 序列的 测 序 工作 , 完 成 了人 类 基 因 组 测序 的 1/ 3; 2000 年 , 国际人类基因组计划即完成人 类全部 30 亿 碱基对的 ! 工作框架图∀ ; 在此基础上对测定完成的 DNA 序列进行认真的核定 , 有望在 2005 年绘制出最 终的精确的人类基因组图谱。 3 3 1 基因诊断和基因体外扩增技术 基因诊断 基因诊断是在声明基因序列或部分基因序列的基 础上 , 从分子水平诊断各种疾病的病因 , 检测基因突 变的手段。它是近代医学诊断的需要而产生的 , 对促 进医学发展有重要意义。用核酸序列测定来判断正常 与疾病基因的差别是最根本的基因诊断方法。而在临 床应用中样品多 , 要求结果急 , 不很适用。因此以基因 中碱基配对原理的核酸探针杂交技术和基因体外扩增 技术的基因诊断手段得到发展 , 在过去十年中 , 广泛用 来检测和识别临床标本中的微生物。特别是许多临床 微生物实验室已采用核酸扩增方法来诊断传染病, 识 别病原体, 以及描述有抗力的抗菌基因的特性; 还有, 分子技术最为令人兴奋的临床应用是检测和识别传染 因子 , 因为采用通常增长和显微方法是难以甚至不可 能做到的。此外 , 现已证实微生物的分子特性是进行 流行病研究和控制医院感染的强有力的方法。 3 2 核酸探针装置 核酸探针可直接检测临床标本中的病原体, 识别 分离后培养中的微生物。尽管有着许许多多的不同方 法, 但商品化产品的开发几乎毫无例外地全部集中在 液相混合和非各向同性标记的探针方面。这些特有序 列的探针能快速简便地识别临床标本中的病原体 , 对 病原体识别的灵敏度不高。大多数直接探针检测 , 需 要每微升核酸目标至少要有 1 万份基因; 当直接探针 检测采用信号或目标扩增时, 每微升中有 500 份基因 就能作出检测, 虽然探针检测已广泛应用, 但其分析 灵敏 度不 及基 于 目标 扩 增的 方 法如 聚 合酶 链反 映 ( PCR) 。 3 3 核酸扩增装置 采用核酸扩增诊断疾病的主要优点是这种方法能 扩增在低浓度中的特定目标, 最初开发核酸扩增装置 ( 以 PCR 为主 ) , 保持着最为广泛的用于研究和临床 实验室中的分子诊断方法。其他扩增方法, 有 Abbott 实验室的连接酶链反应、Qrganan- T eknika 公司的基