现代分子生物学重点

现代分子生物学第一章DNA的发现：1928年，英国Griffith的体内转化实验1944年，Avery的体外转化实验1952年，Hershey和Chase的噬菌体转导实验分子生物学主要研究内容（p11）DNA的重组技术基因表达调控研究生物大分子的结构功能研究——结构分子生物学基因组，功能基因组与生物信息学研究第二章DNA RNA组成脱氧核糖核酸 A T G C 核糖核酸 A U G C原核生物DNA的主要特征①一般只有一条染色体且带有单拷贝基因；②整个染色体DNA几乎全部由功能基因与调控序列组成；③几乎每个基因序列都与它所编码的蛋白质序列呈线性对应状态。

染色体作为遗传物质的特点：（1）分子结构相对稳定（贮存遗传信息）（2）通过自我复制使前后代保持连续性（传递遗传信息）（3）通过指导蛋白质合成控制生物状态（表达遗传信息）（4）引起生物遗传的变异（改变遗传信息）C值以及C值反常C值单倍体基因组DNA的总量C值反常C值往往与种系进化的复杂程度不一致，某些低等生物却有较大的C值。

如果这些DNA 都是编码蛋白质的功能基因，那么，很难想象在两个相近的物种中，他们的基因数目会相差100倍，由此推断，许多DNA序列可能不编码蛋白质，是没有生理功能的。

DNA的中度重复序列，高度重复序列中度各种rRNA，tRNA以及某些结构基因如组蛋白基因都属于这一类高度卫星DNA核小体是由H2A H2B H3 H4 各2分子生成的八聚体和约200bp的DNA构成的，H1在核小体外面。

真核生物基因组的结构特点①基因组庞大；②大量重复序列；③大部分为非编码序列，90％以上；④转录产物为单顺反子；⑤断裂基因；⑥大量的顺式作用元件；⑦DNA多态性：SNP和串联重复序列多态性；⑧端粒（telomere）结构。

DNA的一级结构，二级结构一级机构指构成核酸的四种基本组成单位--脱氧核糖核苷酸(核苷酸)的连接和排列顺序，表示了该DNA分子的化学组成。

DNA一级结构基本特点①DNA由2条相互平行的脱氧核苷酸盘绕而成；②DNA分子中的脱氧核糖和磷酸连接，排列在外侧，构成基本骨架，碱基排在内侧；③两条链的碱基按照碱基互补配对原则通过氢键结合形成碱基对。

DNA的二级结构定义：指两条脱氧多核苷酸链反向平行盘绕所组成的双螺旋结构。

两条相同、反向结合、碱基互补配对、氢键分类：根据DNA双螺旋结构螺距和旋转方向不同，可以分为B-DNA,A-DNA,Z-DNA等半保留复制：DNA在复制前氢键断裂，双螺旋解旋并分开，每一条作为合成新链的模板，按碱基配对的规则产生互补的两条链。

因此子代DNA双链中一条是原来的链，另一条是新合成的。

复制子（replicon）:DNA复制时，并不是整条链全部打开，而是在复制的局部将链打开，形成复制单位。

即从起始位点到终止位点的全部DNA。

复制叉（replication fork）：DNA分子在复制时，在复制起始位点两条链解开成单链，各自作为模板合成互补链，所以这个复制起点呈现叉子的形式。

环状DNA的复制⑴θ型⑵滚环型（rolling cycle）⑶D-环型（D-loop）原核生物DNA复制的特点：最小复制起始位点：一段245bp的序列，3个13聚体的回文结构＋4个9聚体的重复序列（复制起始蛋白结合位点）。

原核DNA复制的过程：1、DNA双螺旋的解旋⑴解旋酶（helicase）：dnaB编码的DnaB，通过水解ATP获得能量，沿5’→3’方向解开DNA双链。

（Rep 3’→5’）⑵单链DNA结合蛋白（SSB）：能结合并覆盖在单链DNA上，防止解开的DNA单链被酶降解以及重新结合成双链，以保持单链的存在。

原核生物SSB具“协同作用”。

⑶DNA拓扑异构酶（DNA topoisomerase）：催化DNA断裂和重新连接。

2、DNA复制的引发引发酶：引物合成。

DNA聚合酶不能引发DNA新生链的合成，先由引发酶催化合成RNA引物，DNA聚合酶再从RNA引物3’端开始合成新的DNA链。

后随链：引发前体（6种蛋白组成）＋引发酶组成引发体，发挥功效。

3、冈崎片段与半不连续复制半不连续复制（semidiscontinuous replication）：DNA复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的，故称半不连续复制。

DNA复制时，DNA聚合酶合成方向都是5’→3’方向延伸。

合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为先导链（领头链）；合成方向与复制叉移动的方向相反，先按5’→3’顺序合成一短DNA（冈崎片段），再连成一条完整的DNA链为滞后链（随从链）。

4、复制的终止复制终止子序列（Ter）：特定终止区域，Ter-tus复合物使DnaB不再解链，阻挡复制叉前移。

5、DNA聚合酶以DNA为模板的DNA合成酶以四种dNTP为底物反应需要有模板的指导Mg2+存在反应需要有3'-OH存在DNA链的合成方向为5 '→ 3 '原核生物DNA聚合酶的作用DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)：在修复中起作用DNA聚合酶Ⅱ(polⅡ）：修复DNADNA聚合酶Ⅲ(polⅢ）：DNA的真正复制酶真核生物DNA复制的特点1、真核生物每条染色体上有多个复制起点，多复制子2、真核生物染色体在全部复制完之前,各个起始点不再重新开始DNA复制；而在快速生长的原核生物中，复制起点可以连续开始新的复制(多复制叉)。

真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。

3、真核生物有多种DNA聚合酶。

真核生物DNA聚合酶α：复制，还具有引物酶活性，后滞链的合成β：修复作用，在DNA链上加上一个核苷酸γ：线粒体DNA复制中起作用δ：复制主要的酶。

先导链合成，行进距离大ε：后随链合成有关DNA损伤的修复1、错配修复2、切除修复3、重组修复4 、DNA的直接修复 5 、SOS反应原核转座子：①IS－两端有ITR，只编码转座酶②复合转座子－两端有IS或类IS，编码抗生素③TnA转座子－两端有ITR，可编码转座酶、解离酶、抗性物质。

插入序列（insertion sequence，IS）（1）是一类较小的没有表型效应的转座因子，长度约750~1500bp；λ::IS1（2）由一个转位酶基因和两侧的反向重复序列组成；（3）可双向插入靶位点，在插入后的两侧可形成正向重复序列复合转座子（copmposite transposon）①是一类较大的可移动成分；②中心区域含有关转座的基因，如转座酶；③带有一个或几个与转座作用无关的但可决定宿主菌遗传性状的基因，如大肠杆菌毒素Ⅰ基因、抗药性基因等。

转座子A家族（transposon A, TnA）不仅编码抗性标记基因，还编码转座酶和解离酶。

解离需要一个特异性的内部部位，这是TnA族的重要特征。

转座作用机制①复制型转座（replicative transposition）②非复制型转座（nonreplicative transposition）③保守性转座（conservative transposition）第三章编码链，正义链，模板链，反义链（知道图上的位置）作为模板进行转录的DNA链称为模板链、反义链或负链；而以模板相对的那条链称为编码链、有义链或正链。

转录的基本过程1 模板识别模板识别：指RNA聚合酶与启动子DNA相互识别并结合的过程。

启动子（promoter）：基因表达调控的顺式作用元件，为基因转录起始所必需的。

真核生物：还需转录调控因子参与2 转录起始转录起始：不需引物。

RNA聚合酶与非特异性结合位点相结合→聚合酶与启动子区闭合双链DNA相结合→二元闭链复合物→二元开链复合物→开始转录。

原核生物的转录起始1、RNA聚合酶全酶(α2'ββσ)与模板结合2、DNA双链解开,形成转录空泡3、在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应5’-pppG -OH + NTP →5’-pppG -OH + NTP起始复合物:RNApol - DNA - pppGpN- OH3 转录延伸RNA聚合酶释放σ因子，核心酶沿模板链移动并使新生RNA链不断延长。

1、σ亚基脱落，RNA – pol 聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；2 、在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。

4 转录终止转录终止：RNA链延伸到转录终止位点，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA 杂合链分离，转录泡瓦解，DNA恢复双链状态，RNA聚合酶、RNA链被释放。

RNA聚合酶σ因子：蛋白因子，负责模板链的选择和转录的起始，使全酶专一性识别模板上的启动子。

全酶核心酶：①依靠酸性蛋白和碱性核酸的静电引力与DNA松弛结合。

②负责转录由全酶识别并形成单链DNA的模板。

σ因子：负责模板链的选择和转录的起始，使酶专一性识别模板上的启动子。

✓提高聚合酶对DNA的亲和力✓降低聚合酶对模板DNA上非特异性位点的结合常数DNA聚合酶对α-鹅膏蕈碱的敏感程度在细胞中存在部位合成RNA酶Ⅰ基本不受影响，>10-3mol/L才轻微抑制核仁、18S、28SrRNA酶Ⅱ最为敏感，10-8～10-9mol/L即抑制核质mRNA酶Ⅲ介于上述2个中间核质tRNA、5SrRNA 、snRNA启动子（promoter，promotor ）：与基因表达启动相关的顺式作用元件，是结构基因的重要成分。

它是一段位于结构基因5’端上游100-200bp的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。

启动子特征：①序列特异性。

含保守序列框。

②方向性。

是一种有方向性的顺式调控元件③位置特异性。

位于所启动转录基因的上游或前端④种属特异性。

不同种、属，不同组织均不同原核生物Pribnow框（-10区）：在原核生物基因的-10（-4~-13）序列区存在的一段有助于dsDNA局部双链解开的保守序列5’TATAAT3’ 。

Pribnow框是RNA聚合酶的牢固结合位点。

Sextama框（-35区）在-35bp前后有一个保守的TTGACA序列，是RNA聚合酶初始结合位点。

RNA聚合酶依靠σ因子识别该位点，又称为识别位点。

-35区在很大程度上还决定启动子强度（结合速度）；-10序列区，通过影响开链式启动子复合物的形成速度而控制转录（解链速度）。

真核生物TATA框：又称Hogness框：中心位置在-25 (-20~-30)之间存在的TATA（A/T）A（A/T）区，与DNA双链解开有关，并决定转录起始位点。

功能与原核生物的Pribnow框类似。

CAAT框：-75附近，GGC/TCAATCT，可能控制转录起始的频率，与Sextama框功能类似，与RNA聚合酶结合有关。

正反取向均能发挥作用。

GC框：-90，GGGCGG，可能为转录因子的结合序列。