免疫组化方法(冰冻切片)
冰冻切片免疫组化
1 冰冻切片4~8um,室温放置30分钟后,入4℃丙酮固定10分钟另：丙酮先在-20C 预冷,然后在4C固定片子15分钟,固定后在室温下干燥后再做免疫组化,PBS洗,5分钟×3;
2 用3％另 %过氧化氢孵育5~10分钟另：最好是用3%H2O2/甲醇溶液,室温20分钟;此配方不易产生脱片;配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml,混匀后使用,每次新鲜配制,消除内源性过氧化物酶的活性;PBS洗,5分钟×2;
3 5~10％正常山羊血清PBS稀释封闭,室温孵育10分钟;倾去血清,勿洗,
4 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小时或4℃过夜;
5 回收一抗,PBS冲洗,5分钟×3次;
6 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗1%BSA-PBS稀释,37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液,37℃或室温孵育10~30分钟;
7 PBS冲洗,5分钟×3次;
8 显色剂显色DAB或AEC;
10 自来水充分冲洗,复染,封片;
如果你的组织曾放在多聚甲醛中固定的话,建议还是抗原修复效果比较好,如果没在甲醛中浸泡,无需抗原修复;
如果你的片子切完后在冰箱中保存的话,做之前,从冰箱取出后先室温半小时,然后入37℃烤箱一小时,再进行免疫组化实验,掉片现象会少一点;我们以前片子从-20℃取出后,接着就做免疫组化,片子掉得很多;。
冰冻切片与石蜡切片的区别
1．冰冻切片是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。
其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。
新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。
冰冻时，组织中水份易形成冰晶，往往影响抗原定位。
一般认为冰晶少而大时，影响较小，冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织中上述现象更易发生。
冰晶的大小与其生长速率成正比，而与成核率（形成速率）成反比，即冰晶形成的数量愈多则愈小，对组织结构影响愈严重。
因此，应尽量降低冰晶的数量。
Fish认为冰冻开始时，冰晶成核率较慢，以后逐渐增加，其临界温度为-33。
C,从-30。
C降至-43。
C之间，成核率急剧增加达1018，然后再减慢。
基于上述理论可采取以下措施减少冰晶的形成。
（1）速冻，使组织温度骤降，缩短从-33。
C43。
C的时间，减少冰晶的形成。
其方法有二：①干冰-丙酮（酒精）法：将150-200ml丙酮（酒精）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不再昌泡时，温度可达-70℃C，用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（纯酒精）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。
将组织（大小为1cm××）投入异戊烷内速冻30-60s后取出，或置恒冷箱内以备切片，或置-80℃低温冰箱内贮存。
②液氮法：将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。
取出组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。
（2）将组织置于20%-30%蔗糖溶液1～3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。
影响冰冻切片的因素较多，因此，技术难度较大，选择好的冰冻切片机是保证切片质量的关键。
冰冻切片免疫组化染色步骤
冰冻切片免疫组化染色步骤一、前言冰冻切片免疫组化染色是一种常用的技术，可以用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
该技术需要经过多个步骤，包括样品处理、切片、抗体染色等。
本文将详细介绍这些步骤。
二、样品处理1. 采集样品首先需要采集需要检测的样品。
比较常见的样品包括动物或人类组织、细胞培养物等。
2. 固定样品采集好的组织或细胞需要进行固定处理，保证其形态和结构不受损伤。
固定处理一般使用4%多聚甲醛或4%乙醛进行。
3. 脱水处理为了使样品更易于切割，需要对其进行脱水处理。
脱水处理可以通过将固定好的组织或细胞分别浸泡在70%、80%和95%乙醇中进行。
4. 包埋处理最后，将脱水后的样品进行包埋处理，即将其置于石蜡中，并逐渐加热至60℃以上，直到石蜡完全浸透到样品中。
三、切片1. 制备切片将包埋好的样品切成5-10微米厚的切片。
这一步需要使用专业的冰冻切片机进行，确保切片质量。
2. 将切片悬浮在载玻片上将制备好的切片悬浮在载玻片上，并进行干燥处理。
这一步需要注意，避免样品受到外界污染。
四、抗体染色1. 抗原修复为了提高抗体的结合效率，需要对样品进行抗原修复处理。
这一步可以通过加热或酶解等方式实现。
2. 阻断非特异性结合为了避免非特异性结合，需要在抗体染色前对样品进行阻断处理。
常用的阻断剂包括牛血清白蛋白和小鼠IgG等。
3. 抗体染色将已经稀释好的一抗和二抗依次加入到载玻片上，并进行孵育处理。
这一步需要注意控制反应时间和温度等因素。
4. 显色与荧光显微镜观察最后，通过加入显色剂或荧光染料实现蛋白质的可视化。
观察过程需要使用荧光显微镜进行。
五、总结冰冻切片免疫组化染色是一种常用的技术，可以用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
该技术需要经过多个步骤，包括样品处理、切片、抗体染色等。
在实验过程中，需要注意控制反应时间和温度等因素，以确保实验结果的准确性。
冰冻切片实验技术
实验技术：组织切片的制备点击次数：350 发布日期：2009-11-9 来源：长沙赢润仅供参考，谢绝转载，否则责任自负组织切片的制备二）切片方法-细节注意1 切片方法的选择光镜和免疫组化研究的切片一般为5μm，而神经组织切片为20-100μm，有利于追踪神经纤维的走行。
1.1 冰冻切片是免疫组织化学中最常用的一种切片方法，能够最大量的保存抗原、操作简便，主要适用于不稳定的抗原（如检测细胞膜的某些抗原成分），但标本来源受限。
冰冻切片时,组织中水分易形成冰晶,影响抗原定位。
冰晶小而多，对组织结构损害大。
因此可采用以下措施减少冰晶的形成：①速冻，缩短组织从-33～-43℃的时间。
具体方法是：⑴干冰-丙酮（乙醇）法：将150-200ml丙酮（乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不冒气泡时，温度可达-70℃。
用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（乙醇）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。
将组织（约1cm×0.8cm×0.5cm）t投入异戊烷内速冻30-60s后取出，置-80℃低温保存或置恒冷冰箱内以备切片；⑵液氮法：将组织块平放于软塑料瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾。
此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。
取出组织块后立即置入-80℃冰箱贮存或作恒冷切片。
②将组织置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。
冰冻切片一般用恒冷切片机。
切片后如不染色，必须将切片吹干，贮存于低温冰箱内，进行短暂预固定干燥后贮存于低温。
【目的】组织标本必须首先被制成组织切片，再经过染色处理，然后才能在显微镜下进行临床诊断和科学研究。
【原理】苏木素染色结合伊红染色是常规组织学染色技术，也称为H & E染色。
第三节冰冻切片介绍
第三节冰冻切片介绍冰冻切片术是一种常用的组织学技术，可以用于研究人体组织和动物组织的结构和功能。
它可以提供组织的横断面，便于观察不同结构的细胞和组织。
本文将介绍冰冻切片的原理、步骤和应用。
一、冰冻切片的原理冰冻切片是通过将组织固定在低温下进行切割，从而得到组织横切面的方法。
冷冻技术能够减少组织的变性和破坏，可以保留细胞和组织原有的形态和结构。
在常温下，组织中的脂质和蛋白质会被破坏，切片过程中也容易产生伤口和变形。
而低温冷冻可以减少这些问题的发生，使切片更加准确和可靠。
二、冰冻切片的步骤1.组织固定：将新鲜组织（或已加工处理的组织）固定在适当的固定液中，如4%的甲醛。
固定的时间根据组织的性质和要研究的问题而定，一般在几小时到几天之间。
2.组织置于冰箱中冷冻：将固定的组织置于冷冻器中进行冷冻，通常是在-20摄氏度以下。
冷冻的时间根据组织的大小和要研究的问题而定，约为几小时到一天。
3.制备冰冻切片：将冷冻的组织取出，放在切片机的架子上。
使用冰冷的刀片对组织进行切割，得到所需的冰冻切片。
切片的厚度根据组织的性质和要研究的问题而定。
4.切片上薄片：将冰冻切片绕在切片刀上，并用玻璃刀刮去多余的细胞和组织。
然后将切片放在玻璃片上，并以适当浓度的甘油溶液滴在切片上，使切片保持湿润。
5.染色和保存：根据需要将切片进行染色，使用常用的染色方法如血液染色、免疫染色等。
染色完成后，将切片放在一个干燥的玻璃片上，然后用封闭剂将切片封闭，以防止切片的变形和损坏。
最后，将切片保存在适当的环境中，避免阳光暴晒和湿气侵入。
三、冰冻切片的应用冰冻切片技术在医学研究和临床诊断中有广泛的应用。
1.病理学研究：冰冻切片可以用于观察组织的病理变化，如细胞增生、坏死和变异等。
通过冰冻切片技术，可以更加准确地诊断和鉴定疾病。
2.免疫组化染色：冰冻切片可以进行免疫组织化学染色，用于检测和定位特定蛋白质的表达。
通过这种方法，可以研究细胞和组织中特定分子的分布和功能。
冰冻切片的免疫组化染色
冰冻切片的免疫组化染色1. 新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片(也可-80℃保存),厚度为5～6 m。
2. 载玻片可不打底，裱片后，立即用电吹风吹干。
3. 如不马上染色，可密封后-20℃保存。
4. 染色前用冷丙酮在4℃固定10-20分钟。
5. PBS 洗2次,每次5分钟,(必要时应用0.1%柠檬酸钠+0.1%triton打孔既抗原修复)。
6. 3% H2O2灭活内源性过氧化物酶,20分钟,避光。
7. 用PBS 洗2次,每次5分钟。
8．正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分（保持组织呈湿润状态）,滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15 分钟。
9．滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃2 小时（也可置于4℃冰箱过夜）。
10．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床）。
11．滴加二抗（辣根过氧化物酶标记）， 37℃，40 分钟。
12．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床）。
15．DAB显色，镜下观察，适时终止（自来水冲终止）。
16．自来水（细水）充分冲洗。
17．苏木素复染，室温，1-5min，自来水冲洗。
（时间可调节，最好在镜下观察，核染上就好不要过染）。
18．自来水冲洗返蓝，15 分钟。
(可调节)19．梯度酒精脱水：80%，2 分钟 95%，2 分钟 100%，2 次，5 分钟。
20．二甲苯透明：I，II（二甲苯）各5 分钟21．封片：加拿大树胶（或中性树胶）封片。
备注：若用DAB呈色，可经酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。
若用AEC，则不能用酒精脱水，用吸水纸去周围组织多余的水份，直接将水溶性封片剂（例如明胶甘油）封片。
冰冻切片免疫组化
冰冻切片免疫组化步骤
1.从-20°取出片子平衡到室温
2.PBS洗2min 3遍
3.0.3%H2O2 10min（避光）--用PBS将30% H2O2稀释100倍
4.PBS洗2min 3遍
5.10%FBS封闭30-60min（室温）；可以配置10%FBS约10ml，用PBS稀释
6.一抗（10%FBS配置），60min，室温孵育（注意封闭后不用洗！）
7.PBS洗2min 3遍
8.1‰链霉素（带HRP）30min 室温孵育，同样链霉素用10%FBS稀释；若为二抗则也是
用10%FBS稀释，接着孵育半小时。
9.PBS洗2min 3遍
10.将玻片擦拭干净，带组织部分保持湿润，DAB显色（bufferA 1ml + bufferB 1滴），用1ml
枪加在载玻片后，进行镜下观察，待特异性蛋白显色适当时，用PBS洗去DAB。
11.苏木素2min （待染色效果改变颜色）
12.1‰盐酸乙醇分化（迅速刷三次）
13.PBS水中洗净有机溶剂
14.75%、80%、95%、100%酒精脱水
15.二甲苯2min
16.二甲苯2min
17.中性树脂封片
Ps:盖玻片先用盐酸乙醇刷一下，然后用水洗干净，最后泡在二甲苯里，在封片前用无尘纸头擦干净，再封片。
说明一抗配置，如果一抗为100ug（RD）则可以加入100ul的pbs，使浓度在1ug/ul，同时分装抗体。
冰冻切片免疫组化染色步骤
冰冻切片免疫组化染色步骤引言冰冻切片免疫组化染色是一种常用的实验方法，用于研究细胞和组织的分子表达。
它结合了冷冻样本的切片技术和免疫组织化学染色的原理，能够可视化特定分子在组织中的位置，从而帮助我们理解生物过程和疾病机制。
本文将介绍冰冻切片免疫组化染色的步骤和注意事项。
步骤一：样本制备1.收集组织样本，根据需要进行切割和处理。
2.快速冷冻组织样本，可用液氮或乙醚等方法冷冻，并保存在低温环境中。
步骤二：切片制备1.取出冷冻样本，将其置于切片机或切片冷冻器中。
2.进行组织切片，通常厚度为5-10微米，利用切片刀或者切片冷冻器的微调装置。
3.将切片收集在清洁的载玻片上，可以使用专门的载玻片来增强切片与载玻片间的附着力。
步骤三：固定和脱水1.将载玻片上的切片放入4%的中性缓冲福尔马林缓冲液中固定细胞和蛋白质。
2.固定15-30分钟后，用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将福尔马林去除。
3.将切片脱水，使用逐渐浓度的乙醇和脱水溶液，如70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇。
步骤四：抗原修复1.对于有些抗原，如细胞核抗原，需要进行抗原修复。
这可以通过热、酸或酶消化等方法进行。
2.一种常用的抗原修复方法是将切片置于高温或高压下进行热诱导抗原修复。
步骤五：阻断和孵育1.使用蛋白质阻断剂，如牛血清蛋白、BSA等，在切片上进行孵育，以防止非特异性结合。
2.孵育时间通常为30分钟至1小时。
步骤六：一抗孵育1.加入一抗，即特异性抗体，与切片上的靶分子结合。
2.一抗浓度和孵育时间根据实验需要和抗体质量进行优化。
步骤七：洗涤1.使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的一抗去除。
2.洗涤时间和次数根据实验要求和抗体特性进行优化。
步骤八：二抗孵育1.加入荧光标记的二抗，与一抗结合形成复合物。
2.二抗可以识别一抗的种类，常见的二抗有荧光标记的抗鼠IgG、抗兔IgG等。
步骤九：洗涤1.使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的二抗去除。
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免疫组化方法（冰冻切片）
A. 所需溶液和试剂
1.二甲苯
2.无水乙醇（100% 和95%，变性无水乙醇，组织学级）
3.苏木精（可选）
4.固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。
a.10%中性福尔马林
b.丙酮
c.甲醇
d.3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X
PBS中。
5.10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma
base ，C4H11NO3）和80 g 氯化钠（NaCl）。
用浓盐酸将pH调节到7.6。
6.漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。
100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。
7.甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。
保存在-20°C。
8.封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。
9.配制时，将500 µl山羊血清和30 µl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。
10.检测系统：根据厂家说明书使用。
已有的检测系统*。
11.DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。
B. 切片
1.对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。
这可以避免切
片时样品断裂。
2.将样品切成大约6-8 µm厚，铺在带正电性的玻片上。
3.固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。
（这有助于切片贴紧玻片）
C. 固定
注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂
1.玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。
a.10%中性福尔马林：室温10分钟。
立即进行染色操作。
b.冰丙酮：-20°C 10分钟。
风干。
立即进行染色操作。
c.甲醇：-20°C 10分钟。
立即进行染色操作。
d.3%甲醛溶液：室温15分钟。
立即进行染色操作。
e.3%甲醛/甲醇：先在室温下3%甲醛中固定15分钟，然后在-20°C的
甲醇中固定5分钟（中间不漂洗）。
立即进行染色操作。
D. 染色
1.切片用漂洗液洗两次，每次5分钟。
2.室温下，浸泡在3% H202/甲醇中孵育10分钟
3.用漂洗液洗两次，每次5分钟。
4.在切片上滴加封闭液，室温封闭1小时。
5.按抗体说明书的推荐比例将抗体稀释在封闭液中。
6.去掉切片上的封闭液，每个切片上加100-400 µl稀释的一抗。
4°C孵育过夜。
7.去掉抗体。
用漂洗液洗3次，每次5分钟。
8.根据厂家说明书，用合适的检测系统*检测。
9.用漂洗液洗3次，每次5分钟。
10.加入100–400 µl DAB或合适的底物，近距离检测染色进展。
11.一旦切片染色成功，立刻将玻片浸入水中。
12.如有需要，将切片泡在苏木精溶液中复染，按照产品说明进行。
13.切片用蒸馏水洗两次，每次5分钟。
14.切片脱水：
a.在95%乙醇中孵育两次，每次10秒。
b.在100%乙醇中孵育两次，每次10秒。
c.在二甲苯中孵育两次，每次10秒。
15.加上盖玻片。