环境微生物样品真菌群落BIOLOG分析方法
Biolog ECO 步骤及数据分析方法
Biolog ECO 步骤生态板（ECO）（示例）一鉴定步骤①土壤样品的采集，将土壤样品加入到灭菌水里接种。
30 min后，用移液枪取1 mL污泥到1．5mL离心管中。
②在10 000 r／min下离心20 min，弃去上清液，加1 mL生理盐水，在振荡器上振动5 min使之混匀；再于10 000 r／min下离心20 min，重复2次，除去其中的碳源；弃去上清液，加1 mL生理盐水，在振荡器上振动5 min使之混匀，于2 000 r／min下离心1 min。
③取上清液倒人装有20 mL已灭菌生理盐水(NaC1，0．85％)的试管中，并使其OD590维持在0．13±0．02。
④将上述稀释液加入Biolog ECO微平板中，(150µ L／孔)，然后在20℃下培养，每隔12 h用Biolog细菌自动读数仪读取数据，连续测定10 d。
二数据处理方法（采用SAS，统计软件进行多样性指数差异显著分析和主成分分析）○1采用Biolog微平板培养120h的数据进行数据统计，采用Shannon指数、Shannon均匀度、Simpson指数、Mclniosh 指数和Mclniosh均匀度各种多样性指数来反映细菌群落代谢功能的多样性。
○2Biolog ECO 平板反应一般采用每孔颜色平均变化率(AWCD)来描述。
计算公式为：{AWCD=[Σ(Ci—R)]／31}。
其中，Ci是除对照孔外各孔吸光度值，R是对照孔吸光度值。
○3通过主成分分析(PCA)将Biolog 生态板(ECO) 平板的31种碳源的测定结果形成的描述细菌群落代谢特征的多元向量变换为互不相关的主元向量（PC1和PC2是主元向量的分量），在降维后的主元向量空间中可以用点的位置直观地反映出不同细菌群落的代谢特征。
BIOLOG微平板技术检测农田土壤微生物群落结构的方法比较
供试 土 壤 利 用 多 点 混 合 法 采 集，来 源 于 湖 北 省
程度上取ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ于微生 物 的 种 类，该 系 统 能 同 时 测 定 微 荆州市和黄冈市农田区０～２０ｃｍ 表层土，去掉根系 生物对不同单一碳 源 的 利 用 能 力，依 据 这 一 原 理 可 等杂物后保存于４℃备用 。 ［６］ 同时将土壤样品称 取
第３６卷 第３期 ２０１７ 年 ５ 月
华 中 农 业 大 学 学 报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｖｏｌ．３６ Ｎｏ．３ Ｍａｙ ２０１７，７～１２
ＢＩＯＬＯＧ 微平板技术检测农田土壤 微生物群落结构的方法比较
彭彩娟 黄巧云 陈雯莉
华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉 ４３００７０
８
华中农业大学学报
第 ３６卷
５ ｍＬ）、２００μＬ 枪 头、１ ｍＬ 枪 头、５ ｍＬ 枪 头、三 角 Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｔｒｏｕｇｈ，并使其 Ｄ５９５维持在０．１３± 瓶（２５０ ｍＬ，１５０ ｍＬ）、１．５ ｍＬ ｍｉｃｒｏ ｔｕｂｅ、Ｌｉｑｕｉｄ ０．０２。将上述稀释 液 加 入 ＢＩＯＬＯＧ ＥＣＯ 微 平 板 中
孔 ３ 个 重 复 组 成 ，各 重 复 包 括 ３１ 个 含 不 同 单 一 碳 源 孔 和 １ 个 不 含 碳 源 对 照 孔［３］。ＢＩＯＬＯＧ 原 理 是 基
１ 材料与方法
于测定微生物对单一碳源利用程度的差异来表征其 １．１ 材 料
生理特性［４］，而微 生 物 对 不 同 碳 源 的 利 用 能 力 很 大
Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｔｒｏｕｇｈ、生理盐水（０．８５％ ，ｍ／Ｖ）、无菌水 （１５０μＬ／孔），然后在 ２０ ℃ 下 培 养，每 隔 １２ｈ 测 定 （４５ ｍＬ），无菌的磷酸缓 冲 液 （ＰＢＳ，称 取 ８ｇ ＮａＣｌ、 Ｄ７５０和 Ｄ５９５并记录。
Biolog使用手册1
Biolog使用手册目录1 启动................ (4)1.1 系统需要................ . (4)1.2 安装软件和数据库 (4)1.3 软件配置................ (4)2 系统介绍................ .. (5)2.1 原理................ (5)2.2 鉴定程序................ . (5)2.3 使用简单的软件 (5)2.4软件背后的数学 (5)2.5 鉴定微生物和管理数据 (6)3 进入系统................ (7)3.1 限制性进入模式....................... (7)3.2 创建使用者列表 (7)3.3 使用记录................ . (7)3.4 改变进入模式 (7)4 准备样品................ (8)4.1 分离一个纯培养物 (8)4.2 革兰氏染色 (8)4.3 Wet Prep................ (8)4.4 定义好氧菌特征 (8)4.5 定义厌氧菌特征 (8)4.6 定义丝状真菌和酵母菌特征 (9)4.7 培养................ (9)4.8 准备接种物................ (9)4.9 革兰氏阳性产芽孢杆菌的处理 (9)4.10 丝状真菌的处理 (9)4.11 接种鉴定板................ (9)4.12 培养鉴定板................ .. (9)4.13 厌氧鉴定板的处理 (10)4.14 丝状真菌的准备 (10)4.15 GN，GP，AN的准备 (10)5 读结果................ (11)5.1 登录................ . (11)5.2 选择人工，读数仪或文件输入模式 (11)5.3 选择打印方法................ (11)5.4 人工读结果................ (11)5.5 用读数仪读结果 (11)5.6 从文件读结果 (11)5.7 设置一个工作表 (11)5.8 设置保存文件................ (11)5.9 使用工作表来读多个平板 (11)5.10 人工调整域值 (11)5.11 选择数据库................ (12)5.12 退出................ .. (12)6 结果解释................ (13)6.1 读结果................ . (13)6.2 评估鉴定结果的准确性 (13)6.3 解释不好的鉴定结果的可能原因.. (13)6.4 种的比较................ . (14)6.5 查找并评估种的信息 (14)6.6 使用真菌的宏观和微观图片 (15)6.7 查看更多的种................ (15)6.8 评估原始OD值 (15)7 数据管理和编辑数据库 (16)7.1 文件备份................ . (16)7.2 文件合并................ . (16)7.3 文件浏览和编辑 (16)7.4 自定义数据文件 (16)7.5 输入/输出ASCII数据 (17)7.6 输出为ACCESS (17)7.7 群落分析 (17)8 技术注解 (19)8.1 材料列表 (19)8.2 培养基和接种液准备 (19)8.3 特殊用途的微孔板 (22)9 经常问到的问题 (23)10 故障处理 (25)10.1 革兰氏染色 (25)10.2 培养微生物 (25)10.3准备接种物 (26)10.4接种微板 (26)10.5培养微板 (26)10.6 读数仪 (27)11 术语表 (28)12 附录 (30)附录1 微孔板的数据统计.附录2 样品准备的流程表附录3 真菌样品准备的流程表附录4 数据库表及特性附录5 结果打印输出的格式附录6 危险病原菌数据库附录7 产品注册表1 启动1.1 系统需要计算机（Windows95,98,2000或NT, 有光驱和软驱），显示器，鼠标，键盘，读数仪，浊度仪，菌落放大灯，八头电动加液器，系统软件。
Biolog微生物鉴定步骤
Biolog微生物鉴定步骤一检测原理Biolog微生物鉴定系统测试的是微生物在鉴定板中利用或氧化化和物的能力。
测试会产生特征性的紫色孔模式，组成代谢指纹。
所有必需的营养物质和生化试剂都预先加进96孔板中，四唑紫是一种氧化还原染料，指示碳源的利用情况。
.鉴定步骤非常简单，纯化分离到的菌株经扩大培养，再制成接种液加到鉴定板中。
在培养过程中，一些孔中的化学物质能被氧化并将显色物质成紫色，对照孔（A-1）和阴性孔仍然为无色。
鉴定板在相应的培养条件下培养4-6小时或16-24小时即可形成代谢模式。
系统软件自动和数据库对比，如果能找到合适的匹配，就可以得出一个鉴定结果。
二所需器材和消耗品：培养基、接种液、巯基乙酸钠、长棉签、接种棒、储液槽、八道移液器、移液器头、浊度仪、浊度标准品、控温培养箱和相应的鉴定板。
其中接种液自行配制，接种棒、储液槽可选用国产品牌代替。
三鉴定步骤：Biolog微生物鉴定样品处理步骤分离纯化培养基BUG+B通用培养基加羊血BUA+B厌氧培养基加羊血BUY酵母培养基2%ME2%的麦芽汁提取物革兰氏染色和菌落菌株形态观察革兰氏染色结果革兰氏阴性革兰氏阳性厌氧菌酵母菌丝状真菌确认实验氧化酶反应阳性氧化酶反应阴性、三糖铁实验A/A或K/A需在巧克力培养基上或需要6.5%CO2培养确认实验氧化酶反应阴性、三糖铁实验K/K或K/A w第一步：在用户自己的培养基上纯化菌株，如果菌株为冻干或冷冻样品，需要传代培养2-3代，让菌株恢复活力。
对纯化好的菌株做革兰氏染色，确定菌株是革兰氏阴性还是阳性。
观察菌落外部形态或用显微镜观察菌株形态，确定是酵母还是丝状真菌，是球菌还是杆菌。
如果是革兰氏阴性菌，还需要最终确认是肠道菌、非肠道菌或苛生菌。
方法是，氧化酶阳性或氧化酶阴性但三糖铁实验为K/K或K/A w，则该菌株为非肠道菌(GN-NENT)，氧化酶阴性以及三糖铁实验为A/A或K/A，则该菌株为肠道菌(GN-ENT)。
Biolog微生物鉴定步骤
氧化酶阳性或氧化酶阴性但三糖铁实验为K/K或K/Aw
则该菌株为非肠道菌(GN-NENT)
氧化酶阴性以及三糖铁实验为A/A或K/A
则该菌株为肠道菌(GN-ENT)
如果菌株①需要在巧克力培养基上或需要6.5% CO2培养
②在BUG+B培养基上生长非常差
形成针尖大小的菌落
那么可以认为这些菌是苛生菌(GN-FAS)
非肠道菌 GN-ENT
肠道菌 GN-FAS
苛生菌 GP-COCCUS-ROD杆球菌、GP-COCCUS球菌、GP-ROD杆菌 GP-ROD
（芽孢杆菌） AN
厌氧菌 YT
酵母菌 FF
丝状真菌 扩大培养基 BUG+B BUG+B 巧克力培养基 BUG+B BUG+M+T BUA+B BUY 2%ME 培养温度 30℃ 35-37℃ 35-37℃ 35-37℃ 30℃ 35-37℃ 26℃ 26℃ 培养气体 空气 空气 6.5% CO2 空气或6.5% CO2 空气 无氢气的厌氧环境 空气 空气 接种液类型 GN/GP-IF GN/GP-IF+T GN/GP-IF+T GN/GP-IF+T GN/GP-IF AN-IF 水 FF-IF 接种浊度/
应把鉴定板拿出冰箱
让鉴定板恢复到常温
因为有些菌种（如Neisseria ）对温度的快速变化很敏感
6. 仔细校正浊度计
接种菌悬液的浊度应在规定的范围内
7. 鉴定板中包含多种对温度和光照敏感的物质
如果个别孔出现棕黑色
说明碳源已经被降解
有时候
在保质期内或超过保质期不长的时间里
Biolog测定方法
1. Biolog生态板的应用原理Biolog ECO板上有32个微孔，每32个孔为1个重复，每板共计3个重复。
32个微孔中除对照孔外各个孔中都含有一种不同的有机碳源和相同含量的四唑紫燃料。
将微孔内的有机碳源作为微生物的唯一能量来源，微生物接种到微孔板的孔中后，若能利用碳源，即能够对其进行生物氧化，有电子转移，四唑紫燃料就能优先俘获电子而变成紫色。
颜色的深浅反映了微生物对相对碳源的利用能力。
通过Biolog系统的微平板读数器，测定ECO板在590nm 波长下的光密度值（OD值），完成数据的采集与存储。
运用主成分分析（PCA）或相似类型的多变量统计分析方法展示不同处理条件下微生物群落产生的代谢特征指纹。
其理论依据是Biolog代谢类型的变化与群落组成的变化相关。
2. Biolog测定方法（1）称取相当于10.0g干土的新鲜土壤放入三角瓶中，加入90ml灭菌的生理盐水（0.85% NaCl，W/V），用无菌棉花塞封口。
（2）震荡30min后，静置15min，用移液枪吸取10ml上清液，加入90ml灭菌生理盐水。
（3）按逐步稀释法，将土壤悬液稀释为10-3g/ml。
（4）在超净工作台中用移液器将制备好的土壤悬液接种到BIOLOG ECO板的各孔中，每孔150μL。
（5）将接种好的BIOLOG ECO板盖好盖子，放入25°C的培养箱中培养7天。
（6）每隔24h用BIOLOG读板仪在590nm下测定各孔的吸光度值。
图1 Biolog ECO板中碳源分布结合有机化合物化学官能团、微生物代谢途径和生态功能3个方面，将ECO板的31种碳源底物分为6大类：糖类、氨基酸类、羧酸类、胺类、酚酸类和聚合物类。
BIOLOG ECO微平板31种不同碳源糖类氨基酸类羧酸类胺类酚酸类聚合物类β-甲基-D-葡萄糖苷L-精氨酸γ-羟丁酸苯乙胺2-羟基苯甲酸吐温40D-木糖/戊醛糖L-天门冬酰胺α-丁酮酸腐胺4-羟基苯甲酸吐温80i-赤藓糖醇L-苯丙氨酸D-葡糖胺酸α-环式糊精D-甘露醇L-丝氨酸D-苹果酸肝糖N-乙酰-D葡萄糖氨L-苏氨酸D-半乳糖醛酸D-纤维二糖甘氨酰-L-谷氨酸丙酮酸甲酯α-D-乳糖衣康酸D-半乳糖酸γ-内酯D, L-α-磷酸甘油1-磷酸葡萄糖。
BIOLOG
9、许多Microlog1和Microlog2的用户用自己的酶标仪读数，是否可 行？读出的数据如何处理？ 答：用其它酶标仪读出的数据也是吸光度值，但必须通过一定的算 法转换。 也可根据A1孔的读数直接判断阴性或阳性。一般来说吸光度值 小于0.2则判断为阴性，大于0.2则判断为阳性，这是一种粗略的判 断方法，如需准确判断，应采用陈列图方法，确定边界值，将干扰 的反应排除，才能得到较佳的结果。 10、有些用户单独购买微孔鉴定板用于研究，对获得的数据如何进行分析？ 答：一般这类用户多用鉴定板做微生物群落分析和营养特性研究，其 接种的菌悬液甚至是混合菌液，如有BIOLOG的软件，可采用Cluster 分析功能模块，对不同试验的结果进行比较。也可用PCA软件(主要化 合物分析)或CLPP软件对数据进行分析，这两种软件由其它公司提供， 可以在网上找到，但需支付一定费用。
5、为什么一定要严格控制接种液的浊度？
答：BIOLOG的鉴定原理与氧含量关系较大，而菌悬液的浓度又决定 了氧的含量，而且其数据库是在一定的菌悬液浓度下建立的，为获得
准确的鉴定结果，务必严格控制接种菌悬液的浊度。
6、BIOLOG的浊度标准品是否与McFarland标准品有无可比性？
答：BIOLOG的浊度标准品与Mcfarlands浊度标准品无可比性，BIOLOG 标准品用于校准接种液的细胞浓度，它关系到鉴定结果的准确性。 7、非肠道菌和肠道菌分别在 30 ℃和35-37 ℃培养，可否用32-33℃ 的培养箱代替二者？ 答：微生物有其最佳的培养温度，如果采用上述方法，极可能得不 到好的鉴定结果。 8、手工读数时，如果有些微孔有些颜色，但不明显，如何判断？ 答：将颜色不明显的孔与A1孔比较，如明显深于A1孔，则判断为 阳性。或者将其判断为边界值，即在进行数据库比对时不予以考虑。
微生物分子生态学研究方法综述
环境微生物分子生态学研究方法综述摘要：对当前国内外环境微生物多样性的分子生态学研究方法进行了总结和探讨，包括微生物化学成分的分析的方法和分子生物学的方法，以目前比较成熟前沿的分子生物学的方法16S rRNA基因序列分析、变性梯度凝胶电泳(DGGE)/温度梯度凝胶电泳(TGGE)、限制性片段长度多态性(RFLP)和扩增核糖体DNA限制性分析(ARDRA)、末端限制性片段多态性(T-RFLP)、单链构象多态性(SSCP)为例。
在环境微生物多样性研究中，如果可能的话，需要将各种方法结合起来使用，方可掌握有关环境生物多样性的较为全面的信息。
更好的揭示环境变化现状和预示环境的变化趋势，为环境改善修复提供有利依据。
关键词：环境微生物；分子生物学；DGGE；ARDRA；T-RFLP1 引言环境微生物是指环境中形体微小、结构简单的生物，包括原核微生物(细菌、蓝细菌、放线菌)、真核生物（真菌、藻类、地衣和原生动物等）。
数量庞大、种类繁多的环境微生物是丰富的生物资源库[1]，也是环境中最活跃的部分，全部参与环境中生物化学反应，在物质转换、能量流动、生物地球化学循环及环境污染物的降解和解毒[2]过程中具有极其重要的作用，亦是评价各种环境的重要指标之一。
比如土壤微生物的数量分布，不仅可以敏感地反映土壤环境质量的变化，而且也是土壤中生物活性的具体体现[3]。
河道、湖泊中微生物量也可以反映该水体的健康状况。
微生物群落结构和多样性是环境微生物生态学研究的热点内容。
微生物群落结构的研究主要通过描述微生物群落的稳定性、微生物群落生态学机理以及自然或人为干扰对群落产生的影响，揭示环境质量与微生物数量和活性之间的关系[4]。
微生物群落多样性，是指土壤微生物群落的种类和种间差异，微生物群落多样性包括物种多样性、遗传多样性及生理功能多样性等[5]。
物种多样性是群落中的微生物种群类型和数量，其中丰度和均度是多样性指数中的两个组成部分，也是多样性分析中最直观、最容易理解的要素。
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第29卷第5期2009年5月生态学报ACTA ECOLOG I C A SI N I C A V o.l 29,N o .5M ay,2009基金项目:国家重点基础研究发展规划(973)资助项目(2006CB403306)收稿日期:2008 01 29; 修订日期:2008 06 10*通讯作者C orres pond i ng author .E m ai:l zs haoku@i yahoo .co m.c n环境微生物样品真菌群落BIOLOG 分析方法韩 蕙1,翟振华2,张燕燕1,王晓丹2,郑少奎1,*,李艳红2(1.北京师范大学环境学院水环境模拟国家重点实验室,北京 100875;2.首都师范大学生命科学学院,北京 100037)摘要:利用BI O LOG YT 、FF 微孔板分别考察了4个真菌群落代谢活性及群落间的代谢相似性,并与聚合酶链式反应 变性梯度凝胶电泳(PCR DGGE)结构相似性分析对比试图探讨代谢相似性与结构相似性的内在联系,探讨了超低温冻存法作为样品保存手段对真菌群落特征B I OLOG 分析结果的影响。
结果表明:两种微孔板所反映的代谢相似性聚类分析结果完全不同,FF 板所反映的代谢相似性聚类分析规律与PCR DGGE 提供的种群结构聚类分析规律一致;超低温冻存处理影响显著影响BI OLOG YT 代谢活性(P =0.023)和B I OLOG FF 多样性指数(H )(P =0.041),但对两种微孔板所反映的其它指数如代谢活性、丰富度指数(S )、多样性指数(H )分析结果均无显著性影响(P >0.05)。
关键词:B I OLOG;真菌群落;CLPP s ;PCR DGG E ;超低温冻存文章编号:1000 0933(2009)05 2368 06 中图分类号:Q145,Q938.1 文献标识码:ABIOLOG ana l ysis for fungal co mmunities i n environ m ental sa m plesHAN H ui 1,Z HA I Zhen H ua 2,Z HANG Yan Y an 1,WANG X iao Dan 2,Z HENG Shao Kui 1,LI Y an H ong 21S t a t e K e y La boratory of W a t er Env i ronm e n t S i m ulation,School o f Env ironm ent ,B ei j i ng N orma l Un i versit y,B eiji ng 100875,Ch i na2C olle ge of L i fe Sc i ence ,CapitalN orma l Un i versit y,B ei j i ng 100037,Ch i naAct a Eco l og ica Sini ca ,2009,29(5):2368~2373.Abstract :B I OLOG YT and FF m icr oplatesw ere used i n this study to i nvestigate the m etabolic activities and sm i ilarity of 4f ungal co mmunities i n env i ronmental sa m ples .Subsequent l y ,the BI OLOG metabolic sm i ilarity e xpressed by these t w o m icroplates w as li nked to str uctur a l sm i ilarity expressed by Po l y m erase Chai n Reacti on D e naturi ng G radie nt G el E lectrophoresis (PCR DGGE).I n additi on ,the effect of cr yopreservati on on B I OLOG analytic results ,i ncludi ng m etabolic activit i es ,richness index and d i versity i ndex ,w as also disc ussed .The f o llo w i ng conclusi ons have been dra wn :(1)BI OLOG FF m icr oplate expressed a m etabolic sm i ilarity relation a m ong 4fungal co mm unities abso l utely different fr o m that by BI OLOG YT m icroplate .(2)T he BI OLOG FF metabo li c sm i ilarity of 4f ungal co mmun ities nearly corresponded to the PCR DGGE structural sm i ilarity .(3)The cryopreservation had no si gnificant i nfl ue nce on BI OL OG richness i nde x ,BI OLOG FF metabolic activit i es and BI OOG YT d i versity i ndex (P >0.05).K eyW ords :BI OLOG;funga l co mmunity ;CLPPs ;PCR DGGE;cryopreservationB I O LOG 微生物分析系统自从1991年起被广泛应用与环境微生物群落分析[1],具有灵敏度高、分辨力强、无需分离纯种微生物、操作简便等优点[2]。
在微生物群落水平生理图谱(CLPPs)分析时通常采用GN 或ECO 板[3~6],它们通过微孔中四唑紫染料(MTT)显色反应来反映微生物代谢作用[7]。
由于许多真菌代谢过程不能使四唑紫染料显色[8],因此真菌群落CLPPs 不能在B I O LOG GN 或ECO 板上得到有效反映,而需要改用B I O LOG FF 或YT 板[9,10],这两种分别用于酵母菌和丝状真菌鉴定的微孔板[7]在表达方式上存在不同,其中FF 板因采用碘硝基四氮唑紫染料(I N T )使真菌代谢过程能够通过显色反映出来,而YT 板则通过前三排微孔的四唑紫显色反应和后五排微孔(无染料)的浊度变化来分别表达代谢作用和同化作用[7]。
然而,目前尚无人研究这两种微孔板表达方式和碳源组合的不同对同批环境微生物样品真菌群落相似性分析结果的影响。
由于基于r DNA 的聚合酶链式反应 变性梯度凝胶电泳(PC R DGGE)分析方法被认为能够直观地反映环境微生物样品群落特征[11,12]。
因此本文以PCR DGGE 所表达的4个环境样品间真菌群落相似性关系为对照,比较了B I O LOG FF 、YT 微孔板所表达的真菌群落相似性关系,并探讨了更准确地反映真菌群落相似性规律的微孔板类型。
此外,B I O LOG 微生态分析一般要求采用新鲜样品[13,14],这不利于野外取样分析。
针对这一普遍存在的问题,本文重点探讨了超低温冻存法作为样品保存手段对真菌群落特征B I O LOG 分析结果的影响。
1 材料与方法1.1 环境微生物样品用于B I OLOG FF 和YT 板CLPPs 分析和PCR DGGE 分析的污泥样品采自实验室废水处理装置不同运行阶段的曝气柱污泥,而超低温冻存预处理研究采用北京市高碑店污水处理厂A 2O 工艺曝气池污泥。
1.2 真菌群落的B I O LOG 分析污泥样品充分混匀后,采用无菌生理盐水离心清洗(10000r /m in ,10m in),再用无菌生理盐水稀释离心沉淀物(至浊度为0.3),分别接种100 l 菌液至BI OLOG YT 、FF 微孔板,并添加抗生素a m p icillin 和strepto m yc i n 使其最终浓度均为50 g /m l 以抑制细菌生长,将平板在25 C 下恒温培养,每隔12h 分别在590nm (YT 板)、490nm (FF 板)处检测吸光度值。
本文采用240h 时数据计算真菌群落平均每孔吸光度(AWCD )、BI OLOG 丰富度指数和代谢多样性指数,并作代谢相似性分析。
其中AWCD = (C i -R )/95,式中C i 是除对照孔外各孔吸光度值,R 是对照孔吸光度值;丰富度指数即被利用碳源总孔数或C i –R 值大于0 25的孔数[15];代谢多样性指数(Shannon W iener 指数)H =- (P i l n P i ),式中P i =(C i -R )/ (C i -R );代谢相似性分析采用简单匹配系数S S M 计算微生物群落的代谢相似性,利用算术平均的不加权成对分组方法(UPG MA )作聚类分析,建立距离树。
1.3 真菌群落的PCR DGGE 分析将微生物样品在M atri x E Tube 中(Q B i o gene)采用B io101FastDNA Spin K it for So il 试剂盒(Q B i o gene)提取基因组DNA,采用0.8﹪琼脂糖凝胶电泳检测提取效果。
PCR 过程采用真菌18S r DNA 特异性扩增引物FF390(CGA TAA CGA ACG AGA CCT)/FR1+GC (CCC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GC A CGG GCC GA I CC A TTC AAT CGG TA I T)[16]。
25 l PCR 反应体系为:2.5 l 10 PCR buffer ,5mm o l/L dNTP ,5 m o l/L FR1+GC ,5 m o l/L FF390,50ng DNA 提取物,2.5U Taq 酶,用dd H 2O 补足至25 l 反应体系。
PCR 反应程序为:95 预变性2m in ,95 变性30s ,55 退火30s ,72 延伸30s ,运行30个循环,最后72 延伸30m in 。
PCR 扩增产物先采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,然后采用Dcode TM 基因突变检测系统(B i o R ad)开展DGGE 分析。
DGGE 变性剂(甲酰胺)浓度范围为40%~55%,电泳条件为:1 TAE 电泳缓冲液(pH 约为8 5),130V 、60 分离6.5h 。