开题报告(范例)

军曹鱼抗菌肽hepcidin的克隆与表达

1、立题依据（包括研究目的、意义，国内外研究现状和发展趋势）：

抗菌肽(antimicrobial peptides)是具有抗菌活性的肽类的总称，是在诱导条件下，生物机体免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质。它们大多是由20～60个氨基酸组成的多肽，分子量在2000～7000 Da左右。抗菌肽具有广谱抗菌，热稳定性，一些肽类100℃加热10～15 min仍能保持其一定的活性；多数抗菌肽的等电点在8.9～10.7之间，表现出较强的阳离子特性，对较大的离子强度和pH值均具有较强的耐受性。

此外，部分抗菌肽能够耐胰蛋白酶或胃蛋白酶水解（Zasloff，2002），某些抗菌肽还可以抗病毒、抗真菌、抗肿瘤、刺激单核细胞趋化性和促进伤口愈合等特点，而且不易产生耐药性。因此被认为是生物体内的主动防御肽，它不仅能在机体受到感染时发挥保护作用，调节控制一系列肽类的表达，还能够影响蛋白质翻译后加工过程。目前已发现的抗菌肽广泛存在于细菌、真菌、昆虫、被囊动物、两栖动物、甲壳动物、鸟类、鱼类、哺乳动物直至人类，以及植物在内的所有生命中。

1972年瑞典科学家Boman等首先在果蝇中发现抗菌肽并发现其具有免疫功能，后用蜡状芽孢杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕(Hyalophora cecropia)蛹，在1975年产生了世界上第一个抗菌活性多肽——天蚕素，目前已发现的抗菌肽有近1000种（Ganzt，2003）已被测序的抗菌肽达数百种。

鱼类抗菌肽数量和种类繁多，在同一种鱼体内不同组织可能产生不同的抗菌肽；在不同鱼类中，其分子结构和作用机制差异较大。从已有报道的鱼类抗菌肽氨基酸序列来分析，同源性低，结构上具有一定的共性，如分子带正电，含有较多精氨酸、赖氨酸和疏水氨基酸，分子内易形成α螺旋结构等。

鱼类抗菌肽其结构和组成复杂多样，依据不同的蛋白质序列组成和结构特点，可以把它们简单分成4种基本类型：

第一类，不含半胱氨酸，可以折叠成疏水或双亲性α螺旋结构的抗菌肽。此种类型的抗菌肽由于富含一些碱性氨基酸而带正电荷，在与细菌细胞膜相互作用时可以折叠成有利于穿膜的疏水或双亲性α螺旋结构，能选择地作用于细菌外层细胞膜的某些组分(如带阴离子的磷脂)，增大其渗透性而杀死或抑制细菌的生长。

此种类包括从虹鳟血清分离的salmocidin（Douglas ＆Gallant等，2001）、八目鳗小肠

HFIAPs(hag fish intestinal antimicrobial peptides)（Gorka，2002）、泥鳅misgurin（Parkcb ＆Leejh等，1997）、杂交斑纹鲈鱼piscidins以及分离自美洲黄盖鲽pleurocidins和豹鳎皮肤粘液pardaxins等。

第二类，含多对二硫键，多个半胱氨酸，可形成β折叠结构的环形抗菌肽。该类抗菌肽与哺乳动物中发现的corticostatin或defensin具有相似性。

这一种类包括虹鳟hepcidin，七鳃鳗LCRP(1amprey corticostatin-related peptide)等。其中hepcidin由61个氨基酸残基组成，内含6个半胱氨酸；LCRP与鼠corticostatinR4和兔corticostatinR1结构相似，其19个氨基酸残基组成的成熟肽也含有6个半胱氨酸，其中Cys1-5、Cys2-4，Cys3-6分别形成3对二硫键，这种配对方式与哺乳动物中β-defensinl、LAP(lingual antimicrobial peptide)，TAP(tracheal antimicrobial peptide)等defensin相同（Conlonjm ＆Sowersa，1996）。

第三类，组蛋白样抗菌肽(histone-like proteins，HLPs)。分子结构与组蛋白高度相似，因而被称为组蛋白样蛋白。

这类肽在水生动物中仅在鱼类中有发现，其它如虾类、贝类中尚未见报道。如从鲶鱼（Park ＆Park，1998）、斑鱼（Qu XD ＆Harwig 等，1997）、斑纹鲈鱼、银大麻哈鱼和鲑鱼等皮肤粘液、鳃、血液和肝脏组织中分离的parasinⅠ、HLPs和SAM等，氨基酸序列和质谱分析表明，它们与组蛋白H2A、H2B或H1非常相似。其中，parasinⅠ来源于鲶鱼皮肤粘膜上皮细胞其氨基酸序列与组蛋白H2A的N端完全一致。

第四类，经酰胺化、糖基化修饰的抗菌肽。这些肽由核糖体合成以后在高尔基体浓缩、加工时，在相关酶的作用下脱掉C端一个或多个氨基酸，或再与一些糖基结合而变成有活性的成熟肽。从鲤鱼体表粘液中分离的分子量为27 kD的疏水蛋白和从丁鲷、鳗鲡皮肤粘液中分离的分子量分别为65 kD、49 kD和45 kD的3种抗菌肽，也是经糖基化修饰的多肽（Ebran ＆Julien 等，1999）。

研究表明，鱼类抗菌肽是机体非特异性免疫系统的第一道防线，在抵御外来病原微生物和消除体内异常细胞过程中发挥着重要作用。大量试验研究表明，当机体受到损伤或病原微生物侵袭时，能迅速产生抗菌肽以预防和抵御病原微生物的入侵，并且抗菌肽具有合成速度快，在体内扩散迅速、灵活的特点，这些特点是其它大分子免疫蛋白(如抗体等)和免疫细胞所不具备的。

近年来，水产养殖业面临着一系列迫需解决的问题，如由于大量使用抗生素导致抗性病原菌的产生，危害人类健康；高密度和集约化的生产模式带来的养殖水体自净能力下降；各

种细菌性和病毒性疾病频发等。同时鱼类养殖中经常使用抗生素导致了部分病原生物产生一定的抗药性，部分水产品含有一定的药物残留，于是出现了食品安全问题。关于抗生素的使用问题，人们的讨论越来越多。抗菌肽的发现与研究为抗生素提供了很好的替代品。抗菌肽作为鱼类动物先天性防御系统重要的组分之一，具有广谱抗菌、抗病毒和抗肿瘤等作用。调动和激活鱼类各种抗菌肽基因的表达，对于维持鱼类健康，实现可持续发展和开发新型抗菌药物具有重要的现实意义。

目前,国内有关水生动物抗菌肽基因方面的研究主要集中在甲壳动物，如中国对虾和贻贝，鱼类则较少。研究层次大多集中在抗菌肽基因的cDNA克隆方面。而鱼类抗菌肽基因研究主要是对仿生鲶抗菌肽基因序列克隆以及海水鲈鱼抗菌肽基因的分离。

鱼类抗菌肽的研究能够为人们进一步加深对生物非特异性免疫系统的认识，为日益严重的渔业养殖病害的防治开辟新的途径，同时可能利用基因工程改良出新型抗病性品种。鱼类抗菌肽将在未来新型饲料添加剂、甚至新型抗菌类药物的研发中起到重要作用。

2、研究内容（说明课题的具体研究内容，独创及新颖之处，重点解决的问题）：

2.1研究内容：

2.1.1军曹鱼hepcidin抗菌肽基因的克隆

从军曹鱼免疫基因库中选出hepcidin抗菌肽基因，然后设计引物获得hepcidin的中间片段，通过Race技术获得全长克隆。

2.1.2 hepcidin抗菌肽基因重组蛋白的体外表达、纯化及鉴定

对hepcidin抗菌肽基因构建表达载体，并转化，进行体外表达，获得重组蛋白；利用重组蛋白进行动物免疫实验。

2.1.3 hepcidin抗菌肽多克隆抗体的制备

2.1.4 hepcidin基因在染色体的定位

2.2 重点解决问题：

2.2.1 RACE-PCR及RT-PCR的条件摸索。

2.2.2 体外重组表达载体的构建及在原核生物中的诱导表达。

2.2.3 重组蛋白的抗菌功能研究

2.3 独创及新颖之处

本实验通过一系列实验操作，最终获得hepcidin基因重组蛋白，并将其同军曹鱼病原菌相互作用，确定重组蛋白的抗菌功能。

3、研究方案设计（包括：实验材料与方法、技术路线）：

3.1实验材料：军曹鱼脾脏

3.2实验方案：

3.2.1 双链cDNA的合成：

用Trizol提取军曹鱼头肾或脾脏的RNA，反转录，合成双链cDNA。

3.2.2中间片段克隆：利用选定的基因序列设计若干对引物进行PCR筛选，直到获得中间片段，然后克隆测序。

3.2.3 cDNA全长的获得：

根据中间片段序列设计免疫球蛋白的特异引物，分别与3＇锚定引物（oligo-dT）和5＇加尾引物（oligo-dG）配对，采用RACE技术获得5＇和3＇末端，然后根据重叠序列进行组装获得全长cDNA序列。

3.2.4 hepcidin基因重组蛋白的体外表达、纯化及鉴定：

从获得的hepcidin基因序列上重新设计引物，提取RNA进行cDNA的合成并进行PCR 扩增，电泳检测PCR产物并回收目的片段，将目的片段连接到载体中构建重组质粒，进行双酶切，并克隆入表达载体，经鉴定和测序确认重组表达载体的构建。用SDS-PAGE对表达产物进行大量诱导表达和Western Blot分析重组蛋白并进行重组蛋白的纯化。

3.2.5 hepcidin多克隆抗体的制备

将纯化的重组蛋白免疫家兔以获得多克隆抗体。

3.2.6 重组的hepcidin抗菌功能研究：

通过将重组蛋白同军曹鱼病原菌相互作用，确定重组蛋白的抗菌功能。

3.2.7 hepcidin基因在染色体的定位

通过荧光原位杂交（FISH）来探索hepcidin基因的在染色体上的定位。

3.3 技术路线

4、实验进度安排和预期达到的结果：

4.1 实验进度安排：

2009.9-2010.1 克隆hepcidin基因全长的cDNA。

2010.1-2010.9 完成hepcidin的体外重组与纯化及整理相关数据。

2010.8-2010.10 染色体定位。

2010.10-2011.1 撰写论文初稿。

2011.2-2011.5 完成论文定稿。

2011.6 论文答辩

4.2 预期达到的结果：

4.2.1 hepcidin基因的克隆获得全长序列。

4.2.2建立hepcidin基因体外高效表达载体，获得重组蛋白，并探讨其生物学功能。

4.2.3发表2-3篇高质量的研究性论文。

5、本课题的研究基础和可行性分析：

5.1本实验室已经做过的研究工作：

对于军曹鱼免疫的研究，主要进行了免疫器官的发生发育、环境胁迫对免疫因子的影响、几种免疫方式的探讨等等。

在军曹鱼病原菌方面我们已经保有3株经过感染试验和鉴定的病原菌，对于研究免疫系统功能中病原生物的的需求方面没有问题。

5.2 研究基础：

5.2.1 已获得其它鱼类hepcidin基因在多种鱼类中的最新研究进展，为本试验提供了重要的参考资料。

5.2.2 本实验室拥有各种先进设备仪器，为试验的顺利进行提供了物质保证。

5.2.3 本试验为中国水产科学研究院南海水产研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目部分研究内容，经费充足。

5.3可能存在的问题：

5.3.1 PCR最优反应条件需要重复摸索。

5.3.2 所构建的载体在大肠杆菌中表达量的优化。

5.3.3 抗体制备过程的优化。

5.4 解决措施：

广泛涉猎国内外相关文献，试验过程中，针对容易出现问题的环节，不断改进方法和条件，摸索出最优反应条件。

参考文献：

Bomanhg,Nilssoni,Rasmusonb.Inducible antibacterial defence system in drosophila[J].Nature, 1972,237(5352):232-235.

Conlonjm,Sowersa.Isolation of a peptide structurally related to mammlian corticostatins from the lamprey Pet romyzon marinus[J].Comp Biochem Physiol Biochem Mol Biol,1996,114(2):133-137

Douglas SE,Gallant JW,Gong z,et o1.Cloning and developmental expression of a family of pleuroeidin-like antimicrobial peptides from winter flounder,Pleuronecter americanus(wa1-baum) [J].Dev Comp lmmunol,2001,25(2):137.

Ebran N,Julien S,Orange N,etal Pore-forming properties and antibacterial activity of proteins extracted from epidermal mucus of fish[J].Comp Biochem Physiol.1999,122(Part A):181. Ganzt.Defensins:antimicrobial peptides of innate immunity [J].Nature Rev Immunol,2003,3:710- 720.

Gorka Basanez Ann E.Shinnar Interaction of hagfish cathelicidin antimicrobial peptides with model lipid membranes[J].FEBS Letters,2002,(532):l15-120.

Park I Y,Park C B,Kim M S,etal. Parasin I an antimicrobial peptide derived from histone H2A in the catfish,Parasilurus asotus.Febs Lett,1998,437(3):258-262.

Parkcb,Leejh,Parkiy,etal.A novel antimicrobial peptide from the loach,Misgurnus anguillicaudat us[J]. FEBS Lett,1997,14;411 (2-3) :173-178.

Qu XD, Harwig SSL, Sharer WM, etal.Protogrin structure and activity again Nesseria gonorrhoeae[J].Infection Immunity,1997,65:636.

Zasloff M.Antimicrobial peptides of multicellular organisms [J].Nature,2002,415(6870):389-395.