_榄香烯抗肿瘤作用和抑制微管蛋白体外聚合的研究_顾洪丰

〔收稿日期〕2004—12—13〔基金项目〕湖南省自然科学基金课题(jjy2003)。

〔作者简介〕顾洪丰(1972-),男,湖南邵阳人,硕士,讲师,主要从事肿瘤药理学研究。

β榄香烯抗肿瘤作用和抑制微管蛋白体外聚合的研究顾洪丰1,瞿延晖2,伍参荣2,徐锡萍3,李新凤3(1.南华大学,湖南衡阳421001;　2.湖南中医学院,湖南长沙410007;3.中南大学湘雅医学院,湖南长沙410008) 〔摘要〕目的探讨β—榄香烯对微管蛋白体外聚合作用的影响,阐明其抗肿瘤的作用机制。

方法采用MTT 法测定β—榄香烯对体外培养的A549、WI38细胞增殖、生长的抑制作用;用浊度法测定β—榄香烯对提取的牛脑微管蛋白体外聚合的抑制作用。

结果β—榄香烯能明显抑制A549、WI38细胞增殖、生长,其抑制作用呈浓度与时间依赖性;对A549、WI38细胞增殖的半数抑制率(IC50)分别为2.73μm ol /L 、3.53μm ol /L 。

β—榄香烯明显抑制体外微管蛋白的聚合,并与药物浓度呈一定的线性关系,对微管蛋白体外聚合的半数抑制率(IC50)为5.12μm ol /L 。

结论β—榄香烯对A549、WI38细胞增殖、生长有明显的抑制作用,β—榄香烯抑制微管蛋白的聚合是其抗肿瘤作用的重要机制之一,并与微管蛋白稳定剂紫杉醇的作用机理不同。

〔关键词〕β—榄香烯;微管蛋白;A549;WI38;IC50〔中图分类号〕R 258.5　〔文献标识码〕A 〔文章编号〕1000—5633(2005)03—0016—03An Experimental Study on the E ffects of β2E lemene on TubulinPolymerization and Antitumor in VitroG u H ongfeng ,Q u Yanhui ,Wu C anrong ,et al(Nanhuan University ,Hengyang 421001) 〔Abstract 〕Objective T o study the mechanism of β2E lemene in antitum or by analyzing the polymeriza 2tion of tubulin in vitro.Methods The inhibition of β2E lemene on proliferation and growth of cultivated cells A549and WI38were determined with MTT and the inhibition of β2E lemene on polymerization of tubulin is o 2lated from bovine was determined with turbidimetry.R esults Both proliferation and growth of cultivated cells A549and WI38and the poly werization of fubulin is olated from bovine were inhibited evidently.The IC50for the former were 2.73μm and 3.53μm and for the latter 5.12μm.Conclusions β2E lemene can inhibite the proliferization and growth of cultivated cells A549and WI38;the inhibitory effect on tubulin polyrneriza 2tion may be one of the onechanisms of antitum or.〔K ey w ords 〕β2E lemene ;Tubulin ;A549;WI38;IC50 β—榄香烯(elemene )是从中药温莪术根茎提得的有效单体,是榄香烯3种成分之一;该药为广谱抗肿瘤药,对各种恶性实体瘤如胃癌、子宫肌瘤、肝癌、乳腺癌等有明显疗效,对白血病、恶性淋巴系统肿瘤疗效尤为显著。

β—榄香烯抗肿瘤疗效高、基本无毒副作用,是一种安全广谱的抗肿瘤药。

本研究主要探讨β—榄香烯体外抑瘤作用和对微管蛋白聚合的影响,报道如下。

1　材料与方法1.1　材料1.1.1　细胞株　人肺癌细胞株(A549)、人乳腺癌细胞株(WI38),均由中国典型物培养中心提供。

61湖南中医学院学报Journal of TCM Univ.of Hunan2005年6月第25卷第3期Jun.2005V ol.25N o.31.1.2　药物　β—榄香烯,纯度为99.8%,由大连金港制药厂提供;长春新碱(VCR)、紫杉醇(T ax ol),纯度为99.8%,由中国科学院昆明植物研究所提供。

1.1.3　试剂　RPMI1640培养基,美国G I-BC OBR L公司提供;MES、MTT LI3-(4,5)—双甲基-2-唑塞-(2, 5)-二甲基澳化四氮唑蓝,均由美国S igma公司提供; EG T A,湖南湘中化学试剂厂提供;小牛血清,大连生物制剂厂提供。

1.1.4　U-2501自动恒温紫外分光光度计,日本岛津公司产。

1.2　方法1.2.1　细胞培养　将A549、WI38分别以RPMI1640培养基(含15%小牛血清,青霉素100μg/L,链霉素100μg /L),置37℃,5%C O2培养箱中培养。

1.2.2　微管蛋白制备　将新鲜牛脑匀浆,再经两次解聚-聚合循环获得[1];并用Lowry’s[2]测定蛋白含量;将所得微管蛋白置于-70℃液氮中保存。

1.2.3　β—榄香烯细胞毒性测定MTT法[3]　取对数生长的细胞株分别以1.0×105/m L加入到96孔培养板中,培养24h,实验组设5个不同浓度组:0.75μm ol/L、1.5μm ol/L、3μm ol/L、12μm ol/L、24μm ol/L;空白组加入等体积的溶剂DMS O(二甲基亚砜)。

每孔加入MTT,作用4h后,加入DMS O(二甲基亚砜),孵育30m in,在酶标仪620nm处测定吸光度。

按公式:肿瘤细胞生长抑制率=1-实验组吸光值对照组吸光值×100%计算药物的IC50(IC50表示化疗药物的细胞毒作用,即细胞抑制率达50%时的化疗药物浓度),并对结果进行q检验。

1.2.4　β—榄香烯对体外微管蛋白聚合的抑制作用测定　采用浊度法[4]。

取冷冻微管蛋白溶液,快速用常温水冲其壁,使之融化,放入冰浴,用MES缓冲液稀释至所需浓度(2～3mg/m L),加入ATP至1mm ol/L。

以从冰浴中马上取出的微管蛋白溶液在分光光度计350nm 处调定为“0”点。

然后将比色杯在37℃温度下测定微管蛋白溶液的OD值,连续20～30min,记录温度—吸光值曲线(T—OD曲线),在带有自动恒温装置的紫外分光光度计按上述操作分别测定T ax ol、VCR、β—榄香烯3种药物对微管蛋白聚合与解离曲线。

T ax ol浓度为1.25μm ol/L;VCR设5个不同浓度组:0.25μm ol/L、0. 75μm ol/L、1.5μm ol/L、3μm ol/L、6μm ol/L;β—榄香烯设5个浓度组:0.75μm ol/L、1.5μm ol/L、3μm ol/L、12μm ol /L、24μm ol/L;空白组加入等体积的DMS O,分别测定各药各组吸光值、绘制T—OD曲线,本实验重复3次,按下式计算出抑制率。

抑制率(%)=对照管“OD”值-加药管“OD”值对照管“OD”值1.3　统计学处理计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,组间两两比较采用方差分析及q检验。

所有资料经SPSS11.0进行统计处理。

2　结果2.1　β—榄香烯对体外培养A549、WI38细胞的细胞毒性(MTT法)β—榄香烯对A549、WI38细胞的增殖、生长有明显的抑制作用,且其抑制作用随浓度的增加而增加,其抑制率与药物浓度呈线性相关。

用直线回归方程统计,结果显示IC50分别为2.73、3.53μm ol/L。

且同一浓度β—榄香烯对体外培养的A549、WI38细胞的增殖抑制率不同;3μm ol/L的β—榄香烯对A549、WI38细胞的增殖抑制率比较,二者有非常显著性差异(P<0.01),结果见表1。

表1　β—榄香烯对体外培养A549、WI38细胞的抑制作用(n=5,x±s)组　别浓度(μm ol/L)抑制率(%)A549WI38 空白组00 0β—榄香烯0.75 1.6±0.010.4±0.0131.59.4±0.02 1.1±0.0533346.2±0.089.1±0.011280.8±0.0369.6±0.012496.8±0.0192.6±0.01 注:β—榄香烯对体外培养A549、WI38细胞的抑制作用分别进行组内比较,P<0.05。

3与33比较,P>0.05。

2.2　β—榄香烯对微管蛋白体外聚合的影响(浊度法)β—榄香烯、VCR对微管蛋白体外聚合的抑制率无显著性差异(P>0.05),说明β—榄香烯为微管蛋白聚合抑制剂,其对微管蛋白的抑制作用与药物浓度呈线性关系,直线回归方程统计结果示β—榄香烯的IC50为5.12μm ol/L。

见表2。

3　讨论微管是存在于所有真核细胞中的由微管蛋白组装成的长管状异二聚体细胞结构,并依赖于微管蛋白二聚体对其不断地聚合与解聚而处于一种装配与去装配的动态平衡中。

微管是细胞骨架的重要组成成分,参入了细胞运动,细胞增殖、分化和凋亡等的调控[3];微管的聚合和解聚对微管的动力学进行着最基本的调71第3期顾洪丰,等　β榄香烯抗肿瘤作用和抑制微管蛋白体外聚合的研究表2　β—榄香烯和VCR对微管蛋白体外聚合的抑制率(n=3,x±s)组　别浓度(μm ol/L)抑制率(%)IC50(μm ol/L)空白组β—榄香烯组长春新碱组0　000.750.058±0.0291.50.157±0.01630.265±0.028 5.12±0.31 120.538±0.016240.824±0.0290.250.049±0.0170.750.149±0.0321.50.225±0.017 3.56±0.31 30.634±0.04160.772±0.019 注:β—榄香烯组与长春新碱组比较,P>0.05,二者IC50无显著性差异。