Time-resolved two-photon excitation fluorescence spectroscopy and microscopy using a high repeti
荧光共振能量转移(FRET)的定量检测及其应用
荧光共振能量转移(FRET)的定量检测及其应用张建伟;陈同生【摘要】荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)技术被广泛应用于活细胞中生物大分子构象变化和分子间动态相互作用的实时研究.针对光谱串扰和供体受体间的浓度比等困扰FRET效率定量检测的两大难题,已经发展了多种定量检测FRET效率的方法.作者结合自己的研究结果介绍了多种FRET 效率定量检测技术在细胞信号转导机制研究中的应用.%Fluorescence resonance energy transfer (FRET) is the most widely used technology to study the protein - protein real - time dynamic interactions and the change of macromolecular conformation in living cells. Spectral cross - talks and acceptor - to - donor concentration ratio are the tissues harassing the quantitative measurement of FRET efficiency. Many different methods to quantitate FRET efficiency, such as FLIM - FRET, spectral FRET, acceptor photobleaching FRET and sensitized emission FRET methods, have been proposed. In this report, we introduce some quantitative FRET methods to study the mechanism of cell signal translation.【期刊名称】《华南师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(044)003【总页数】6页(P12-17)【关键词】荧光共振能量转移(FRET);FRET效率;定量检测;荧光蛋白【作者】张建伟;陈同生【作者单位】华南师范大学生物光子学研究院生命科学教育部重点实验室,广东广州510631;华南师范大学生物光子学研究院生命科学教育部重点实验室,广东广州510631【正文语种】中文【中图分类】Q631荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)是依赖于供体和受体分子间距离的光物理进程，处于激发态的荧光团通过偶极子间的相互作用将能量以非辐射的方式转移给邻近的受体分子[1-2], 从而导致供体荧光淬灭和受体荧光发射的增加. 供体和受体之间的FRET效率(E)与分子间的空间距离(r)满足6次方的关系[3]：FRET效率是依赖于供体与受体间的距离r和Forster距离R0的. R0由下式给出[3-4]：已知主要有2个因素影响FRET效率的定量检测：一个是光谱串扰, 包括供体荧光串扰到受体通道(发射光谱串扰)和激发供体时直接激发受体(激发光谱串扰)[7-8]. 由于有机荧光团的光物理特性, 绝大数现有的FRET供体受体对都存在光谱串扰. 在定量检测FRET效率时必须消除这些串扰, 选择2个发射光谱分离较大的供体受体对, 能够减小串扰, 但同时J()会减小. 影响FRET定量检测的另一个因素是参与FRET作用的供体与受体对所占整个荧光基团的比例[9-10]. 自由的供体与受体相互作用时, 往往不是所有的供体或受体分子都参与相互作用. 参与相互作用分子的百分数难以知晓, 因此, 各种FRET效率的定量检测方法对有自由的供受体存在时都不能完全地反映FRET效率, 只能测量表观FRET效率. 另外, 活细胞中荧光蛋白表达水平和背景噪音等其它因素也可能影响FRET效率的定量检测.绿色荧光蛋白(green fluorescent proteins, GFP)是从维多利亚水母中分离出来的,受紫外或蓝光激发而发出绿色荧光[11]. 与GFP融合的蛋白在细胞中仍然能够行使正常的功能, 因此GFP成为了检测蛋白质分子间相互作用的报告分子. 近年来又发现了GFP的多种变体, 与迅速发展的荧光显微镜技术结合极大地改善了活细胞成像和FRET技术在活细胞中的应用,使得FRET技术在细胞生物学和化学方面的应用得到了质的飞跃. 基于荧光蛋白的FRET(FPs-FRET)技术已被广泛应用于活细胞实验研究中,极大促进了生物学的发展[12]. 利用基因转导技术和共聚焦荧光显微成像可以在活细胞中研究蛋白质定位、信号的传递、蛋白质分子间的相互作用和蛋白质分子的构象变化. 将荧光蛋白(FPs)接到感兴趣的蛋白质分子上, 可以对细胞进行实时动态检测, 也可视化监测细胞内蛋白质与蛋白相互作用的生理过程[13]. FPs-FRET 传感器主要可以分为3类: 分子内的FRET传感器、双分子FRET传感器和基于双分子荧光互补传感器(BiFC)[13]. FPs-FRET传感器已经成为在活细胞中实时检测钙离子浓度、pH值、各种激酶活化、蛋白质磷酸化以及蛋白质分子间相互作用等动态过程的重要技术[13-14].FRET定量检测的常用方法有寿命成像(FLIM-FRET), 光谱成像(spectral FRET), 受体光漂白(acceptor photobleaching FRET)和敏化发射测量(sensitized emission FRET)等方法, 下面介绍FRET技术在细胞信号转导机制研究中的应用.FLIM方法主要是通过测量受体存在和不存在时的供体分子的荧光寿命 D和 DA来确定FRET效率E[5],FLIM方法检测的结果一般作为其他FRET定量检测方法的对照标准. 要求供体通道选择性探测供体荧光, 而且FLIM系统价格昂贵, 同时也需要熟练的操作人员进行操作, 这些都限制了FLIM方法的推广应用. 事实上用时间相关单光子计数(TCSPC)进行精确地拟合时可能带来了其他的方法没有的复杂问题[10], 尤其是复杂的光物理性质增加了寿命法分析的困难[15, 17]. 为了精确地对分子的荧光寿命进行多指数拟合, 在每个像素点上需有大量的光子[18], 这将大大延长成像时间, 使得FLIM方法不适合于活细胞中的实时动态检测[19-20].每一个荧光团都有各自的激发和发射光谱, 不同于采用荧光通道获得数据的强度测量方法和寿命测量方法的是光谱法获得的分别是供体、受体和供体与受体样本的发射光谱. 通过供体和受体的光谱对供体-受体样本的光谱进行拟合得到FRET效率. THALER等人[21]提出了一种利用光谱成像的FRET效率定量测量方法. 存在FRET 时混合光谱Fcomplex包括3个部分：供体的荧光、受体的荧光和从供体转移到受体的那部分荧光：Fcomplex=d×(1-E)×Fd+a×Fa+d×E×(Φa/Φd)×k()×Fa,本研究小组最近也提出了一种基于荧光光谱拟合的FRET定量分析方法[22]. 该方法通过测量细胞内供体-受体对的荧光发射谱, 然后按照供体和受体的荧光发射谱进行拟合得到FRET效率. 该方法有效地解决光谱串扰问题, 可用于检测蛋白质之间的相互作用. 最近, LEVY等[23]提出了基于2种不同激发光条件的发射光谱测量FRET效率的方法, 该方法能够测量很小的FRET效率和参与作用的供体与受体摩尔比, 而且能够通过仔细的校准来消除自发荧光和背景光的影响.sFRET方法是测量FRET效率最为灵敏的方法, 在目前已知的方法中只有光谱法能够探测出小于5%FRET信号. sFRET方法能够有效地解决光谱串扰问题, 也能够很好地消除背景光和自发荧光的影响, 因此sFRET方法可以用于测量蛋白质分子间弱的FRET信号. 但是sFRET方法对于数据采集要求很高, 因为较小的干扰就可能对结果造成较大影响, 所以须对数据要进行严格的校正, 特别是须对背景光和自发荧光进行严格校正.光漂白方法(Pb-FRET)通过检测光漂白受体前后供体的荧光强度来获得FRET效率, 光漂白受体会导致供体的荧光强度上升. 光漂白方法分为完全光漂白方法和部分光漂白方法.供体和受体发生FRET时, 供体的荧光减少, 即供体荧光会产生淬灭, 而受体的荧光增加. 一般采用最大的受体激发光完全漂白掉受体后, 供体就不再把能量传递给受体, 导致供体的荧光增加. 通过测量完全光漂白受体前后供体的荧光强度和就可以得出FRET效率[24]：ELDER等[20]提出了一种通过检测部分受体光漂白前后供体的荧光强度和受体光漂白程度来测量FRET效率的部分受体光漂白方法,受体光漂白方法(Pb-FRET)操作简单, 在共聚焦显微镜上也很容易实现. Pb-FRET方法测量FRET效率既不依赖于系统参数，也不依赖于供体与受体的量子产率和消光系数, 只依赖于受体光漂白前后供体的荧光强度变化. 但是, 受体光漂白会对生物体造成的损伤, 不利于在单细胞中进行多次测量, 也不能在细胞中进行实时动态检测[20, 27]. 必须注意的是：受体光漂白过程中用最大的光强的受体激发光也可能漂白掉供体分子,最近发现在光漂白过程中YFP分子可以光转换成CFP分子[28].敏化发射测量(SE-FRET)方法被广泛应用于活细胞中FRET效率的动态检测[20, 27]. SE-FRET既可以在共聚焦显微镜上实现, 也可以在宽场显微镜上实现. 传统的SE-FRET方法是利用3个滤光块组的方法, 每个滤光块组都是采用一个激发带宽滤光块来选择性激发供体或受体, 并用发射滤光块来收集供体或受体发射的荧光. 可是, 受体敏化发射荧光包括直接激发受体的荧光和供体串扰到受体通道的荧光, 其串扰路径如图1.在实际的实验中, 除了测量待测FRET样本实验外, 还需增加对3个参考样本来对系统进行串扰校正：只有供体荧光团的供体对照样本, 只有受体荧光团的受体对照样本和已知FRET效率的校正样本. 增加的供体对照样本测量供体发射串扰(图1中path2), 受体对照样本测定直接激发受体发射串扰(图1中path1), 已知FRET效率的校正样本获得给定条件下成像系统的校正因子G[27]. 也有文献报道用2个化学计量比为1∶1且FRET效率差别较大的参考样本来获得校正因子G[29].SE-FRET方法具有无损伤的特性, 成为在活细胞中最为适合于动态监测的方法[20, 26], 而且能够较好对光谱串扰和系统参数进行校正. 但是, SE-FRET方法也有其自身的限制，需要利用对照样本(至少3个)对光学检测系统以及荧光基团的光学性质进行事先校正，一旦校正完成,后续实验不能再改变任何系统参数, 且每次实验都要重新校正, 极大地增加了SE-FRET实验的工作量和难度, 也限制了该方法的推广应用. SE-FRET实验必须同时转染4个样本, 其中的任何一个样本没有转染成功, 都会导致实验的失败.FRET技术已经成为在活细胞中研究蛋白质之间相互作用和蛋白质分子构象变化的广泛应的工具. 本研究小组近几年利用FRET技术在活细胞中研究了细胞增殖和细胞凋亡过程中的分析调控机制[30-34]. 通过构建基于GFPs的FRET质粒，利用共聚焦荧光显微镜在单个活细胞中研究各种诱导刺激条件下细胞凋亡的分子调控机理[32-36].FRET技术在生物上的重要应用是通过实时检测荧光蛋白之间FRET的效率变化来研究荧光蛋白标记蛋白质分子间的相互作用. 利用FRET技术并结合共聚焦显微成像技术，本研究小组证明了在碱性条件下诱导细胞凋亡过程中Bid被切割成tBid 并转位到线粒体上，并且证明凋亡过程中Caspase-3活化[31]. 为了在活细胞中实时研究Caspase-3的动态活化过程，筛选了稳定表达SCAT3的细胞系，在此基础上通过检测细胞凋亡期间SCAT3 FRET效率的动态变化，实现了在单个活细胞中实时检测caspase-3的动态活化过程[32].利用ECFP标记Bax蛋白和EYFP标记PUMA蛋白，本实验室利用FRET技术在活细胞中首次证明了在紫外诱导的细胞凋亡过程中PUMA可以直接促进Bax的活化和转位，并抑制Bcl-XL蛋白活化[37]. 本研究小组还证明了低功率激光辐照能够通过GSK-3β未活化的机制来抑制Bax转位的上游过程[38]，以及P53不依赖于PUMA转录因子而是通过Akt/FOXO3a介导的Bax活化和细胞凋亡[39].FRET技术已被广泛应用于活细胞中蛋白质之间相互作用和蛋白质分子构象变化的动态研究. 影响FRET定量检测的因素主要有光谱串扰和供体与受体的浓度比. GFP 及其变种的发现以及显微荧光技术的发展使得FRET技术在活细胞中的应用更加广泛. 本文介绍了寿命测量法、光谱法、部分受光漂白方法和敏化发射等几种常用的FRET定量检测方法，并对上述各种方法在定量检测FRET效率上进行了简单的评述.【相关文献】[1] LAKOWICZ J R. Energy Transfer: In Principles of Fluorescence Spectroscopy[M]. New York: Plenum Press, 1983.[2] CLEGG R. 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单分子成像技术的发展现状
单分子成像技术的发展现状单分子成像技术是一种能够观察分子活动、探究生化机制的高分辨率成像技术。
其作用不仅仅局限于生物科学领域，还涉及到物理学、化学、材料学等多个学科领域。
技术的发展也离不开诸多学科的交叉与融合。
一、引言单分子成像技术最早的出现可以追溯到20世纪80年代，主要通过荧光显微镜（Fluorescence Microscopy）的方法对单个荧光分子进行成像。
由于技术的限制，当时对于荧光信号的检测和信号处理还存在很大的问题。
然而，随着科技的飞速发展，扫描探针显微镜、光学共振散射显微镜、双光子激发荧光显微镜、强制调制近场显微镜等各种单分子成像技术相继问世，单分子成像技术的分辨率不断提高，对生命科学研究的价值也越来越受到重视。
二、扫描探针显微镜扫描探针显微镜（Scanning Probe Microscopy，SPM）指的是一种用于观察界面的显微镜，它是通过用尖锐的金属探针在表面扫描来实现成像的。
该技术在生物化学等领域具有重要应用，可以实现对生物分子、蛋白质等的高分辨率成像。
同时，扫描探针显微镜在其它领域中也有诸如高材料的表面分析等多种应用。
三、光学共振散射显微镜光学共振散射显微镜（Optical Resonance Scattering Microscopy，ORS）是一种非荧光单分子成像技术。
相比于荧光显微镜，ORSM 技术不需要染色，不会造成光破坏，同时在信号的收集和处理上也更加灵敏。
因此，该技术具有对生物活体进行高效成像、建立生物分子与细胞之间的相互作用模型等独特的优势。
四、双光子激发荧光显微镜双光子激发荧光显微镜（Two-Photon Excitation Fluorescence Microscopy，TPE-M）是一种低光破坏，不需分子标记，对深部成像也能取得相较于传统显微镜的优越成像效果的技术。
TPE-M主要利用激光器中特定波长的激光对分子进行双光子激发，使得光子处在高能激发态，产生荧光现象。
二次谐波_双光子激发荧光显微成像技术定量评估非酒精性脂肪性肝病小鼠模型肝纤维化的价值 王晓晓
长，肝小叶内脂肪变形成，纤维化逐渐加重。 分别基于造模不同时间点和不同肝纤维化分期，选出 ２６ 和 ２７ 个参数；进一步采用
ＳＶＭ 模型分析筛选出 ７ 个共同参数（ ＃ＳｔｒＣＶ、＃ＳｈｏｒｔＳｔｒＣＶ、＃ＴｈｉｃｋＳｔｒＣＶ、＃ＳｔｒＰＴＡｇｇ、＃ＳｔｒＰＳＡｇｇ、＃ＬｏｎｇＳｔｒＰＳＡｇｇ 和 ＳｔｒＬｅｎｇｔｈＰＳＡｇｇ） 并进
王晓晓，等． 二次谐波／ 双光子激发荧光显微成像技术定量评估非酒精性脂肪性肝病小鼠模型
肝纤维化的价值
１７８７
（ ） （ ） ＡＵＣ ｏｆ ０． ８５７ － ０． ９２３ Ｐ ＜ ０． ０５ ｉｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｄ ａｎ ＡＵＣ ｏｆ ０． ８２３ － ０． ９７６ Ｐ ＜ ０． ０５ ｉｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ
参数动态变化，找出并建立适合蛋氨酸胆碱缺乏饲料（ ＭＣＤ） 诱导的 ＮＡＦＬＤ 小鼠的自动化定量评估参数，为 ＳＨＧ ／ ＴＰＥＦ 显微成像技
方法 术应用于临床提供实验依据。 获取 ＭＣＤ 饮食小鼠不同时间点（０、４、８、１２、１６、２０ 和 ２４ 周） 的肝组织标本，行 ＨＥ、Ｍａｓｓｏｎ 和天
ｔｉｔａｔｉｖｅ ｍａｎｎｅｒ ｉｎ ｔｈｉｓ ｍｏｄｅｌ．
： ； ； ； ， Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｎｏｎ － ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｍｉｃｅ ｉｎｂｒｅｄ Ｃ５７ＢＬ
， ， ， （ ’ ， ； ； ＷＡＮＧ Ｘｉａｏｘｉａｏ ＺＨＡＯ Ｊｉｅ ＬＩ Ｘｉａｏｈｅ ｅｔ ａｌ． Ｐｅｏｐｌｅ ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｋｅｙ ， ， ） Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００４４ Ｃｈｉｎａ
同步辐射技术在生物学中的应用
同步辐射技术在生物学中的应用同步辐射技术(Synchrotron Radiation, SR)是一种高亮度、强偏振、连续谱和低时间展宽的光源，由于其在物理、材料科学和化学等领域的应用，被广泛认识和使用。
除此之外，SR技术在生物学中也有着广泛的应用，从微观到宏观，从结构到功能，都可以为生命科学研究提供重要的信息。
一、 X-射线结晶结构学晶体学是研究晶体内部结构的学科，而X-射线衍射技术是现代晶体学的核心技术之一，该技术能够解析分子内部结构，探究分子间相互作用，对于研究生命体系的结构和功能至关重要。
同步辐射技术能够提供更强的X-射线衍射光束，使得晶体衍射数据的精度更高，同时也缩短了数据收集时间和样品需求量，这对于高通量结晶筛选和结构解析等方面都具有很大的帮助。
二、倍频特征光谱学倍频特征光谱学(Two-Photon Excitation Fluorescence, TPEF)是利用倍频特性产生的激发光在生物样品中激发荧光分子，通过检测激发荧光来进行样品成像。
同步辐射技术提供了高亮度和高偏振的光束，使得TPEF成像的信噪比更高，分辨率更高，并且使得荧光标记材料的选择更加广泛。
三、 X-射线荧光光谱学X-射线荧光光谱学(X-ray Fluorescence, XRF)是利用X-射线在样品中产生的荧光来分析样品成分和组成的一种分析技术。
同步辐射技术提供了高能量、高亮度、高偏振和高纵向空间聚焦的X-射线光源，可以实现高分辨率、高灵敏度和元素选择性较高的XRF 方法。
该技术在生物地质化学、环境生态、生物医学等领域中具有较为广泛的应用。
四、 X-射线吸收光谱学X-射线吸收光谱学(X-ray Absorption Spectroscopy, XAS)是一种研究原子和分子内部结构、化学状态和相互作用的评价方法，是确定生命科学系统中特异性金属离子结合位置和键合情况的关键技术之一。
同步辐射技术的狭缝束和线探测器使得XAS信号的采集速度更快、精度更高，同时也能够探测到更低浓度的元素。
四波混频相互作用方式
四波混频相互作用方式
四波混频相互作用方式是指在物理中存在着四个波的相互作用方式。
这种相互作用方式主要有以下四种：
1. 双光子吸收（Two-photon absorption, TPA）：两个光子被共同吸收并相互作用。
这种过程可以用来产生高能量的激发态或者光学非线性响应。
2. 光折变（Optical parametric amplification, OPA）：在非线性材料中，光子可以通过与压缩光波或者拉伸光波相互作用，使得一个光子被分裂成两个较低能量的光子。
3. 光学双光子激发（Two-photon excitation, TPE）：两个光子被共同吸收，并且可以用来激发分子的高能激发态。
4. 光学参量振荡（Optical parametric oscillation, OPO）：当在非线性光学晶体中注入一个光泵浦波时，会产生一个激光输出波和一个较低频率的副波。
这种过程可以用来产生较宽的频率输出范围。
双光子激发截面
双光子激发截面双光子激发截面技术（Two-PhotonExcitationCross-Section，缩写为TPECS），又称双光子散射截面，是一种用于测量物质特性的技术。
这项技术主要用于测量各种物质分子的双光子散射截面，从而研究其光学性质，特别是同质或质化合物分子的双光子散射截面。
双光子激发截面技术，顾名思义，是指物质分子在受到两个相同波长的光子激发冲击时，会发生双光子激发反应，从而产生一种特殊的双光子散射效应。
双光子激发反应的特性决定了双光子激发截面的测量有着非常重要的意义。
双光子激发散射截面的测量有很多饱受争议的方法。
这些方法大致可以分为三类：第一类是用于测量自发双光子激发截面（Spontaneous Two-Photon Excitation Cross-Section，缩写为STPECS）的方法；第二类是用于测量非自发双光子激发截面（Non-Spontaneous Two-Photon Excitation Cross-Section，缩写为NSTPECS）的方法；第三类是用于测量双光子散射截面（Two-Photon Scattering Cross-Section，缩写为TPSCS）的方法。
不同的双光子激发截面测量方法都有其特定的优势和缺点，因此，在实际的应用中，利用多种方法来测量双光子激发截面是最可行的。
其中，STPECS和NSTPECS方法主要用于测量分子电磁学特性，TPSCS 方法则是用于测量分子构造和电子动力学行为的。
从理论上讲，双光子激发截面的测量可以用原子和分子模拟，用以获得关于分子性质的信息，这包括电磁特性及电子动力学行为等。
原子和分子模拟可以自动测量双光子激发截面，根据在分子结构上改变各种参数，可以轻松地测量出某个特定分子的双光子激发截面。
双光子激发截面的测量有很多应用。
在微纳米技术领域，双光子激发截面的测量是用来研究器件表面的特性，比如表面的光散射特性和电磁特性等。
活细胞成像技术的研究进展
活细胞成像技术的研究进展细胞是生命的基本单位，细胞内部发生的诸多过程也是生命活动的重要组成部分。
因此，对细胞内部活动的实时观察和研究显得极为重要。
近年来，随着活细胞成像技术的日益发展，人们可以实时观察细胞内部事件的发生，加深对生命科学的认识。
本文将从技术的发展历程、成像技术的种类、应用领域及前景等方面，全面阐述活细胞成像技术的研究进展。
一、技术的发展历程活细胞成像技术可以追溯到上个世纪中期。
20世纪50年代，对细胞的显微成像已经开始应用。
1953年，人类首次成功地观察到细胞内部的染色体结构和运动状态，进而推动了活细胞观察技术的发展。
60年代，出现了用荧光分析分子分布、交换、转移过程的追踪方法，成为细胞分子参与机制研究的重要手段之一。
随着计算机、数字成像技术等的发展，使得活细胞成像技术的观察精度和时间空间分辨率越来越高。
二、成像技术的种类1. 荧光共聚焦显微镜技术荧光共聚焦显微镜技术（confocal laser scanning microscopy, CLSM）是一种较为常见的活细胞成像技术，能够对生物样品进行非破坏性成像，在X-Y方向和Z方向上进行高分辨成像和立体成像。
该技术利用激光发出聚焦点，通过横向扫描样本，同时因厚度导致的散焦造成的模糊影响也被消除了。
适用于对细胞动态反应的实时成像、融合蛋白的二维和三维重建等。
2. 光片可控制镜技术光片可控制镜技术（spinning disk confocal microscopy, SDCM）是一种快速成像技术，样本成像速度快，能够用于快速成像大量细胞。
通过旋转大量的光学排列成的光片，甚至可以每秒钟旋转超过10000转对样品进行成像观察。
3. 双重共聚焦显微镜技术双重共聚焦显微镜技术（two-photon excitation fluorescence, TPEF）采用预聚焦技术，激发荧光物质由双重光子吸收，提高单点的荧光信号量，从而弱化了样品的对光损伤的效应，对于对细胞有损伤的样本有很好的应用。
次氯酸双光子荧光探针的合成及其在生物成像中的应用
次氯酸双光子荧光探针的合成及其在生物成像中的应用中文摘要双光子吸收技术自问世以来一直受到了广泛的关注。
与单光子吸收材料相比，双光子吸收材料在分辨率、穿透深度具有显著的优势，可以用于显微成像、微纺织技术、三维数据存储、光限幅、上转换发光、光动力学治疗以及药物靶向释放等诸多领域。
特别是双光子显微技术，以近红外的激光为光源对生物样品进行成像，具有穿透性强，空间分辨率高，背景荧光干扰小，以及对生物样品的光损伤较小等优点，在生物医学领域具有广阔的应用前景。
然而，传统的双光子材料常常具有大共轭结构，水溶性差、细胞穿透能力差、生物毒性也较大，并不适用于生物成像。
因此，设计合成具有较高双光子吸收截面的有机小分子用于生物体内细胞、血管、组织成像，具有重要的研究价值。
本文设计合成了两种具有双光子吸收特性的荧光小分子，对其发光性能进行了系统的研究，探索它们在生物成像中的应用。
具体的研究内容包括：1、设计合成了一类以寡聚苯乙烯为骨架的双光子次氯酸荧光探针OPV-HOCl，并将其应用于活细胞及组织内的双光子成像。
在寡聚苯乙烯骨架上引入次氯酸识别基团——氧硫杂环戊烷，通过1H-NMR、13C-NMR、HRMS 对其结构进行了表征，并通过紫外光谱、荧光光谱等进一步研究了该探针对次氯酸的响应性能，测定了其双光子吸收截面。
加入次氯酸以后，探针分子末端的氧硫杂环戊烷基团被氧化，并生成醛基。
由于分子内强烈的电荷转移导致产物的双光子吸收截面提高了近15倍（从78.9GM提高到1131.5GM），因此OPV-HOCl可以作为一个双光子“turn-on”型次氯酸荧光探针。
此外，该探针还具有反应速度快、选择性好、pH适用范围宽等优点。
MTT实验表明该探针具有较小的细胞毒性。
由于该探针优异的次氯酸响应性能和较小的生物毒性，我们成功地将其用于小鼠胶质瘤细胞BV-2中次氯酸的检测，研究表明该探针可以透过细胞膜，并对细胞中外源性次氯酸和脂多糖诱导产生的内源性次氯酸具有高选择性的快速响应。