反义RNA技术原理及在疾病治疗中的作用
反义RNA技术及其在抗癌治疗中的应用
反义RNA技术及其在抗癌治疗中的应用作为一种新兴的基因治疗技术，反义RNA（antisense RNA）在近些年来得到了越来越广泛的关注和应用。
它在基因调控、细胞增殖和分化、信号传导、免疫应答等方面都发挥着重要的作用。
在抗癌治疗中，反义RNA技术已经显示出很大的潜力，对于遗传病变和癌症的治疗有重要的启示意义。
反义RNA技术的原理反义RNA技术是利用RNA分子上互补碱基配对的特性，通过合成与目标基因mRNA相互补合的基因产物，抑制特定基因的表达。
一般来说，反义RNA分子都是单链的，由20-30个核苷酸组成，与作用靶点的mRNA具有完全或部分互补的序列。
反义RNA分子与mRNA形成二级结构，遮蔽目标mRNA的翻译起始位点，从而抑制目标蛋白的转录和翻译。
这种技术相对应于常规药物靶点的药理作用，实现了对靶点基因的精准干预，减小了对组织的损害。
反义RNA技术在抗癌治疗中的应用在抗癌治疗中，反义RNA技术已经得到了广泛的应用。
目前，已经有多项临床试验证实，反义RNA技术可作为抑制特定癌细胞生长和转移的一种有效策略。
例如，通过对肿瘤细胞中逆转录酶（reverse transcriptase）的反义RNA进行干预，可以抑制癌细胞的增殖、侵袭和转移，从而达到治疗的效果。
癌症患者往往是由于癌细胞不断分裂、侵袭、转移，最终导致器官衰竭而死亡。
因此，针对癌细胞这个因素来研究治疗方法，可以为癌症治疗提供更加精准的方法，帮助患者尽早获得愈合。
在癌症治疗中，患者往往会接受化疗、放疗等方法，但是这些方法会对身体造成很大的创伤，而且效果并不总是很好。
与之相比，反义RNA技术的干预作用更加针对靶点基因，具有更好的精确性和副作用较小的特点。
因此，反义RNA技术在未来的抗癌治疗中具有很大的应用前景。
结语反义RNA技术在癌症治疗中的应用是一种创新的疗法，可以为癌症的治疗提供更加精准的方法，同时也为遗传病变等的治疗提供了新的思路。
虽然目前该技术还处于研究阶段，但是其在治疗癌症等方面的应用已经取得了一定的成果，为人们治疗疾病提供了一种全新的治疗策略。
反义RNA的原理及其应用
反义RNA的原理及其应用反义RNA（antisense RNA）是与特定信使RNA（mRNA）互补碱基配对的一类人工合成或天然存在的RNA分子。
反义RNA的原理是通过与目标mRNA序列互补配对，形成双链结构，从而干扰目标mRNA的转录或翻译过程。
这种干扰机制可以通过不同方式实现，具体包括1）诱导mRNA降解；2）阻断mRNA与翻译机器的结合；3）改变一些RNA结构的特定特性等。
反义RNA技术已经被广泛应用于生物医学研究和药物开发领域。
1.原理1.1干扰mRNA转录与翻译双链RNA形成后，可以由核酸酶识别并降解目标mRNA，从而阻断其进一步转录和翻译的过程。
这种机制基于RNA降解途径，被称为“RNA静默”。
一些RNA降解复合物（如Dicer）可以识别双链RNA，并将其切割成较短的片段，随后这些片段在RNA的修剪和降解过程中被进一步降解。
此过程的关键是确保反义RNA与目标mRNA形成稳定的双链结构，而且目标mRNA具有反义RNA的完全互补序列。
1.2阻断mRNA翻译双链RNA的形成可能会阻断mRNA与翻译机器（例如核糖体）结合，从而抑制目标蛋白质的合成。
RNA结构和翻译效率密切相关，双链RNA的形成可能会导致目标mRNA的折叠结构改变，使其无法与翻译机器发生作用。
此外，双链RNA还可以通过与mRNA靶标上的翻译起始区或其他调节序列特异性结合，从而直接阻断翻译的开始。
2.应用2.1功能研究通过合成反义RNA来靶向抑制或过表达特定的目标基因，可以帮助研究人员研究这些基因在生物体系中的功能。
这种方法可以通过控制基因的表达水平，从而观察到特定基因或蛋白质对细胞、组织或整个生物的影响。
这项技术在基因组学、生理学、病毒学和发育生物学等领域中得到了广泛应用。
2.2治疗方法反义RNA技术在治疗疾病方面具有很大的潜力。
例如，通过合成反义RNA来靶向抑制特定基因的转录或翻译，可以抑制疾病相关基因的表达。
这种方法可以用于治疗常见的遗传性疾病，如肌萎缩性侧索硬化症（ALS）和囊性纤维化（Cystic fibrosis），以及一些癌症等。
反义RNA技术在病毒学与癌症治疗中的应用
反义RNA技术在病毒学与癌症治疗中的应用反义RNA技术（antisense RNA technology）是一种利用互补配对原理来抑制特定基因表达的新颖技术。
它指的是将反义RNA引入细胞内，成对结合到目标mRNA的互补序列上，从而“靶向”控制蛋白质合成的技术。
由于许多疾病的发生与相关基因的异常表达有关，这种技术被广泛应用于疾病的治疗。
本篇文章主要阐述反义RNA技术在病毒学与癌症治疗中的应用。
一、反义RNA技术在病毒学中的应用1. 病毒复制过程中RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）是合成病毒基因组RNA的关键酶。
经过多年的研究发现，呋喃醇核苷（Favipiravir）、磷酸丙酚（Remdesivir）等RNA聚合酶抑制剂能有效地抑制多种RNA病毒的感染。
而且，对于新冠病毒（SARS-CoV-2）的治疗，也已经有许多研究证明了这些药物的有效性。
由此可以看出，RNA聚合酶是RNA病毒生命周期的关键酶，研究其新的抑制方法非常必要。
2. 反义RNA技术可以通过靶向RNA病毒的RNA聚合酶mRNA，达到抑制RNA病毒复制的效果。
由于RNA病毒的基因组RNA相对较短，所以靶向同源序列的反义RNA表达量较低时仍能对目标mRNA形成高效的酸解 spliceosome 激活剂，从而起到一定的治疗效果。
3. 除了直接靶向RNA病毒复制相关的基因，反义RNA技术还可以通过调控宿主细胞的基因表达来控制RNA病毒的感染。
例如，在腺病毒感染细胞时，通过靶向细胞因子γ受体（IFN-γ receptor）的反义RNA，可以有效地抑制IFN-γ的信号通路，从而抑制病毒在宿主细胞内的复制。
二、反义RNA技术在癌症治疗中的应用1. 在癌症治疗中，由于癌症的发生与细胞基因组的异常表达有关，所以反义RNA技术可以通过调控癌症细胞的基因表达来治疗癌症。
例如，靶向KRAS基因的反义RNA已被用于治疗肺癌等多种恶性肿瘤。
反义RNA技术的研究与应用
反义RNA技术的研究与应用反义RNA技术是指利用反义RNA分子针对目标RNA进行专一性抑制的技术。
这种技术在基因调控、药物研究和基因治疗等领域有着广泛的应用前景。
反义RNA技术的基本原理是设计合适的反义RNA分子，使其与目标RNA分子上的相关序列互补配对，引发RNA降解、阻断翻译或其他途径而达到抑制目标RNA功能的效果。
这种技术具有高度的专一性，可以准确定位目标RNA，不会对其他分子造成不良影响，因此得到了广泛的关注。
在基因调控方面，反义RNA技术可以用于探究基因功能以及开发新的治疗方法。
例如，在某些遗传病和肿瘤等方面，反义RNA技术可以用来抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。
同时，还可以通过抑制基因表达来研究基因功能和相关信号通路，为开发新的基因治疗方法提供重要的理论和技术支持。
在药物研究方面，反义RNA技术可以用来开发新的药物靶点。
例如，通过设计特定的反义RNA分子来抑制特定的基因或蛋白质表达，可以开发出新型的治疗药物。
此外，反义RNA技术还可以用来研究药物的作用机制，并开发出更加安全和有效的药物。
在基因治疗方面，反义RNA技术可以用来针对遗传病等进行基因修复。
例如，通过设计适当的反义RNA分子来修复基因突变所造成的影响，可以达到基因治疗的效果。
此外，反义RNA技术还可以用来修复或替换受损的基因，从而实现针对性治疗。
总的来说，反义RNA技术具有广泛的应用前景，不仅可以用来探究基因调控和药物研究，还可以用来进行基因治疗等。
随着相关技术的不断发展和完善，相信反义RNA技术一定会在未来的生物医学领域发挥越来越重要的作用。
反义RNA技术在疾病治疗的应用
反义RNA技术在疾病治疗的应用随着基因组学、转录组学、蛋白质组学等生物技术的迅速发展，反义RNA技术也开始引起广泛关注和研究。
反义RNA技术是一种利用RNA分子对特定基因达成靶向、特异性抑制的技术，它能够抑制基因的转录和翻译，从而达到治疗相关疾病的目的。
反义RNA技术的原理是设计并合成一种特异性针对某一基因的RNA分子，在靶向的基因序列上结合并诱导RNA降解酶的降解，最终抑制该基因的表达。
在临床上，反义RNA技术已被应用于多种疾病的治疗，特别是一些难以治愈的肿瘤疾病及增殖性疾病等。
以下是反义RNA技术在疾病治疗中的应用。
1、肿瘤疾病治疗肿瘤是临床上非常常见的一种疾病，治疗难度大。
现有的治疗手段如化疗、放疗等抑制正常细胞增殖的同时也会对人体造成伤害。
通过反义RNA技术针对某些致癌基因进行治疗，能够通过特异性识别注射到病变处，并阻断癌症细胞生长和增殖，从而达到治疗目的。
例如，在肺癌、乳腺癌等实验证明，靶向致癌基因HER2的反义RNA可以显著抑制肿瘤细胞的增殖和转移，并且这一治疗方法不会损伤正常细胞，也不会对病症早期的转移产生不良作用，所以是一种很有效的治疗手段。
目前，该技术已经进入了临床试验阶段，可供遴选的靶向基因也越来越多。
2、病毒感染治疗针对病毒感染的治疗在临床上也变得越来越重要。
目前，已经有一些反义RNA技术被研制出来，用于治疗乙型肝炎病毒、艾滋病病毒等病毒感染疾病。
研究人员在靶向病毒的核酸序列上设计反义RNA分子，进而抑制病毒繁殖，治疗感染。
而且，相比传统的治疗方式，反义RNA技术在治疗的过程中不影响正常基因表达，因此无效信息处理发生的概率也降低了。
3、免疫疾病的治疗随着免疫疾病的发病率不断上升，市面上的药品却很有限。
反义RNA技术在治疗某些免疫疾病中的应用也受到了研究人员的关注。
例如，通过靶向细胞表面的免疫受体，在控制免疫系统发挥的同时达到治疗免疫疾病的效果。
目前，反义RNA技术在治疗某些自身免疫疾病方面的研究还处于初级阶段，但在未来有望成为治疗这些疾病的有效方法之一。
反义RNA技术及其在疾病治疗中的应用
反义RNA技术及其在疾病治疗中的应用反义RNA技术是一种新型的RNA干扰技术，可以利用RNA链的互补配对抑制靶标RNA的表达，从而实现基因沉默。
相对于传统RNA干扰技术，反义RNA技术具有更高的特异性和稳定性。
因此，反义RNA技术在疾病治疗中具有广泛的应用前景。
反义RNA技术的基本原理反义RNA技术的基本原理是通过反义合成一条与靶标RNA互补的RNA链，使其与靶标RNA结合形成双链RNA，并引起RNA干扰，从而抑制靶标RNA的表达。
与传统的RNA干扰技术不同，反义RNA技术可以利用互补配对使RNA双链更加稳定，进而提高RNA干扰的效率。
此外，反义RNA技术还可以通过调整反义RNA链的长度和结构，以及靶标RNA的结构和序列，进一步调节RNA干扰的特异性和效果。
反义RNA技术在疾病治疗中的应用反义RNA技术在疾病治疗中具有广泛的应用前景。
具体而言，它可以应用于以下领域：1.基因治疗反义RNA技术可以用于针对一些由单个基因突变引起的遗传性疾病的治疗。
例如，囊性纤维化是一种由于CFTR基因编码缺陷引起的遗传性肺病，反义RNA技术可以通过抑制异常CFTR基因的表达来治疗这种疾病。
2.肿瘤治疗反义RNA技术可以针对肿瘤细胞中的癌基因进行治疗。
例如，癌基因BCL2在多种肿瘤中都高表达，而抑制BCL2表达可以诱导肿瘤细胞凋亡。
因此，通过反义RNA技术抑制BCL2的表达，可以成为一种有效的治疗肿瘤的手段。
3.病毒治疗反义RNA技术可以用于治疗一些病毒感染疾病，例如艾滋病和丙型肝炎等。
反义RNA链可以与病毒RNA序列互补，从而阻断病毒的复制和繁殖，从而治疗感染病毒的疾病。
总体而言，反义RNA技术在疾病治疗中具有很大的潜力。
虽然目前该技术仍面临着一些挑战，例如如何提高RNA干扰的效率和特异性、如何有效地传递反义RNA到靶细胞等问题，但随着技术的不断进步和发展，相信这些问题终将得到有效解决，反义RNA技术会成为一种有效的疾病治疗手段。
反义RNA技术在基因治疗和基因表达调控中的应用
反义RNA技术在基因治疗和基因表达调控中的应用随着基因学研究的深入，反义RNA技术越来越受到科学家的重视。
反义RNA 是一种反链RNA，其序列与目标mRNA（信使RNA）相互补，并活跃于细胞核内或胞质内。
由于反义RNA在配对时与目标mRNA互补，从而部分或完全地抑制了目标mRNA的转录、翻译或稳定性，因此反义RNA技术被广泛应用于基因治疗和基因表达调控领域。
反义RNA技术在基因治疗中应用广泛。
目前，针对许多疾病的反义RNA已经被研究开发出来，用于基因治疗。
比如，反向转录病毒（retrovirus）介导的anti-HIV-1 shRNA可以有效地抑制爱滋病病毒的复制。
针对常见的遗传性疾病如囊性纤维化、乳腺癌、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症等，科学家们也在研究和开发反义RNA技术，以期望最终能够将其用于基因治疗。
反义RNA技术在基因表达调控中也发挥了关键作用。
例如，大多数药物靶点基因表达调控都可以通过反义RNA技术实现。
由于反义RNA技术具有高度的特异性和低的非特异性，能够人为地减少或消除靶点基因的表达，从而减少或消除其对人体产生的影响。
除此之外，反义RNA技术还可以应用于基础研究、生物技术和药物开发等领域。
在基础研究中，利用反义RNA技术可以有效地研究基因功能。
通过制备特定的反义RNA，科学家可以选择地靶向调节目标基因，从而破坏假说基因或验证新假说的正确性。
在生物技术领域，反义RNA可以被用来作为生物广告牌（bioprobes），以实现对生物大分子的检测和定量。
在药物开发领域，反义RNA 技术可用于发展新的基因靶点药物，或者改进已有药物的疗效和安全性。
在反义RNA技术的应用中，有效的设计和构建反义RNA序列至关重要。
反义RNA序列的设计需要基于目标mRNA的特定序列，以确保完美互补，同时避免与其他基因的序列结合，从而降低非特异性的影响。
针对不同的生物学问题，科学家们设计的反义RNA序列也会有所不同，例如，有些反义RNA序列可能在细胞核内产生作用，而另一些则可能在胞质内更加活跃。
反义rna的原理及应用
反义RNA的原理及应用1. 反义RNA的定义反义RNA（antisense RNA）是指与特定mRNA序列互补的RNA分子，它们通过互补序列结合到目标mRNA上，从而干扰其转录或翻译过程。
2. 反义RNA的工作原理反义RNA通常通过以下几种方式起作用：2.1 转录调控反义RNA可以与目标mRNA的启动子或调控因子结合，从而抑制或激活转录过程。
它们可以通过二级结构或序列特异性与目标序列相互作用，改变染色质状态或阻断转录因子的结合，从而影响基因的表达水平。
2.2 翻译调控反义RNA与目标mRNA的编码区结合，形成双链结构，从而阻断翻译复合体的结合或使其解体。
这种干扰作用可以通过两种机制实现：一是通过RNase H介导的降解作用；二是通过RNAi介导的切割作用。
2.3 RNA修饰反义RNA还可以通过与目标RNA序列互补结合，介导特定的RNA修饰。
例如，通过合成与目标RNA互补的短小干扰RNA (siRNA)，可以诱导RNA干扰途径，从而实现基因沉默。
3. 反义RNA的应用领域反义RNA在生物医学研究和药物治疗中具有广泛的应用前景，以下列举了几个典型的应用领域：3.1 基因功能研究反义RNA技术可以用于基因敲除或沉默，从而研究目标基因在生物体内的功能。
例如，通过合成与靶基因互补的反义RNA，可以抑制或减弱靶基因的表达，从而观察到相关的表型变化。
3.2 疾病治疗反义RNA技术可以用于干扰特定基因的表达，从而实现疾病的治疗。
例如，通过合成与病理基因互补的反义RNA，可以抑制病理基因的表达，达到治疗疾病的效果。
3.3 肿瘤治疗反义RNA可以用于肿瘤治疗，通过干扰促进肿瘤生长的基因的表达，抑制肿瘤的发展。
通过选择性地合成与肿瘤相关基因互补的反义RNA，可以实现靶向治疗。
3.4 抗病毒研究反义RNA技术可以用于抗病毒研究，通过干扰病毒基因的表达，抑制病毒的复制和感染。
例如，合成与病毒基因互补的反义RNA，可以结合病毒基因序列，阻断病毒复制的关键步骤。
反义RNA技术原理及在疾病治疗中的作用(精)
反义RNA技术原理及在疾病治疗中的作用摘要:反义RNA技术是利用反义RNA能够与特异靶RNA通过配对碱基间氢键作用而互补配对,从而在基因复制、转录和翻译3个不同水平上参与基因表达的调控,来治疗各种遗传性或病毒感染性疾病的一项技术。
本文在讨论反义RNA技术的作用机制和与反义寡核苷酸技术的比较的基础上,拟概述反义RNA的作用机制、技术方法与特点、技术运用和存在的问题。
相信随着对基因功能研究的广泛开展及基因治疗研究的深入,反义RNA技术必将成为一种有力的工具,在疾病治疗中起到重要的作用。
关键词:反义RNA;基因表达调控;基因治疗反义核酸技术是继基因克隆和重组技术后分子生物学领域兴起的一种全新的技术。
该技术由于其核苷酸具有与DNA意义链相同的序列且可以选择性地抑制特定基因的表达而得名。
广义的反义核酸技术包括:①反义寡核苷酸技术(antisense oligonucleotides,ASOD,即直接应用一段人工合成的寡聚核苷酸,通过碱基配对与细胞内核酸结合,特异的调节基因表达。
②反义RNA技术(antisense RNA,是利用基因重组技术,构建表达载体,使其离体或在体内表达出反义的RNA。
③核酶技术(ribozyme核酶是一种可自我催化的特殊的反义RNA,能与靶序列结合并使之裂解,从而对特定基因的表达进行调控。
反义RNA(antisense RNA是一种本身缺乏编码能力,但能与特异靶RNA(主要是mRNA互补的RNA分子,它可通过配对碱基间氢键作用与靶RNA的特定互补区域结合形成双链复合物,抑制靶RNA的功能,从而调控基因的正常表达[1]。
反义RNA技术的基本原理是利用自然存在的或人工合成的反义RNA,通过基因重组技术反向插入到合适的表达载体形成重组DNA,然后转染受体细胞,则这一反向插入的序列就会随细胞周期产生大量反义RNA,对基因的表达进行调控,从而抑制、封闭或破坏靶基因的表达。
选择具有明显的生物学效应的靶序列后,反义RNA即通过和相应的RNA互补而达到阻断其功能的目的。
反义RNA技术原理及其应用
反义RNA技术原理及其应用反义RNA技术（Antisense RNA technology）是一种通过合成反义RNA序列来抑制目标基因表达的技术。
通过引入合成的反义RNA序列，与目标基因的mRNA互补配对并形成双链结构，从而阻断或降低目标基因的翻译过程，进而达到抑制目标基因表达的目的。
反义RNA技术具有特异性、高效性和可逆性的优点，它可以被广泛应用于基因功能研究、药物开发和治疗等领域。
反义RNA技术的原理是将与目标基因对应的mRNA序列进行反向互补配对，形成稳定的双链结构，从而阻断mRNA上的翻译复合体的组装，阻碍目标蛋白的合成。
具体而言，阻断翻译的机制包括障碍聚体与核糖体的结合、诱导核糖体释放、导致核酸降解等。
反义RNA技术可通过两种方法实现：直接引入合成的反义RNA分子或直接注射的反义RNA基因表达载体。
合成的反义RNA分子可以通过外源递送系统引入细胞，或通过转染、转化等方法直接设法将其导入细胞。
反义RNA基因表达载体通常是通过表达载体将反义RNA基因导入细胞内，使其在细胞内转录和转译成反义RNA分子。
反义RNA技术的应用非常广泛。
在基因功能研究方面，它可以通过抑制目标基因表达，观察目标基因敲除或功能缺失对细胞、组织、发育和疾病模型等的影响，从而揭示目标基因的功能和作用机制。
在药物开发方面，反义RNA技术可以通过设计和合成特异性的反义RNA序列来抑制疾病相关基因的表达，从而实现基因靶向治疗。
例如，反义RNA技术已被用于癌症治疗，通过抑制癌细胞增殖和侵袭相关基因的表达来阻止癌细胞的生长和扩散。
此外，反义RNA技术还可以用于抑制病毒基因表达，从而达到阻断病毒复制的目的，如抗艾滋病病毒（HIV）和乙型肝炎病毒（HBV）的治疗。
反义RNA技术的优点之一是其高效性和特异性。
由于反义RNA与目标mRNA的序列完全互补，所以能够达到高效的敲除效果。
此外，反义RNA 技术还能够选择性地靶向抑制目标基因表达，减少对其他非目标基因的影响。
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反义RNA技术原理及在疾病治疗中的作用摘要：反义RNA技术是利用反义RNA能够与特异靶RNA通过配对碱基间氢键作用而互补配对，从而在基因复制、转录和翻译3个不同水平上参与基因表达的调控，来治疗各种遗传性或病毒感染性疾病的一项技术。
本文在讨论反义RNA技术的作用机制和与反义寡核苷酸技术的比较的基础上，拟概述反义RNA的作用机制、技术方法与特点、技术运用和存在的问题。
相信随着对基因功能研究的广泛开展及基因治疗研究的深入，反义RNA技术必将成为一种有力的工具，在疾病治疗中起到重要的作用。
关键词:反义RNA；基因表达调控；基因治疗反义核酸技术是继基因克隆和重组技术后分子生物学领域兴起的一种全新的技术。
该技术由于其核苷酸具有与DNA意义链相同的序列且可以选择性地抑制特定基因的表达而得名。
广义的反义核酸技术包括：①反义寡核苷酸技术(antisense oligonucleotides,ASOD)，即直接应用一段人工合成的寡聚核苷酸,通过碱基配对与细胞内核酸结合,特异的调节基因表达。
②反义RNA技术(antisense RNA),是利用基因重组技术,构建表达载体，使其离体或在体内表达出反义的RNA。
③核酶技术(ribozyme)核酶是一种可自我催化的特殊的反义RNA，能与靶序列结合并使之裂解，从而对特定基因的表达进行调控。
反义RNA(antisense RNA)是一种本身缺乏编码能力，但能与特异靶RNA(主要是mRNA)互补的RNA分子，它可通过配对碱基间氢键作用与靶RNA的特定互补区域结合形成双链复合物，抑制靶RNA的功能,从而调控基因的正常表达[1]。
反义RNA技术的基本原理是利用自然存在的或人工合成的反义RNA，通过基因重组技术反向插入到合适的表达载体形成重组DNA,然后转染受体细胞，则这一反向插入的序列就会随细胞周期产生大量反义RNA,对基因的表达进行调控,从而抑制、封闭或破坏靶基因的表达。
选择具有明显的生物学效应的靶序列后,反义RNA即通过和相应的RNA互补而达到阻断其功能的目的。
近20多年来,反义RNA技术已在病毒病、癌症、遗传性疾病等疑难疾病的基因治疗、动植物品种的改良以及生物研究方法的改进方面取得了令人瞩目的成就。
本文在讨论反义RNA技术的作用机制和与反义寡核苷酸技术的比较的基础上,拟概述反义RNA的作用机制、技术方法与特点、技术运用和存在的问题。
1反义寡核苷酸技术与反义RNA技术1.1反义寡核苷酸技术1978年,Zamecnik首先应用一种13个碱基的寡核苷酸抑制Rous肉瘤病毒,取得一定效果[1],此后,随着对其作用机制、特异性及药理作用等研究的深入,其应用范围不断扩大。
由于ASOD的易降解性,在实验中通常要对其进行修饰,硫代反义寡核苷酸作为第一代反义寡核苷酸的代表,由于在细胞毒性、细胞吸收率等方面存在众多问题,Agrawal等设计了第二代混合骨架的反义寡核苷酸(mixed-backbone oligonucleotides ,MBO),MBO含有至少两种不同的化学修饰,在结构上可以是任意两种或多种修饰的不同排列组合。
MBO 不仅保持了核酸酶抗性,而且具有很好的靶序列杂交特异性和相对较低的毒副作用[2]。
近年来以2-氨基乙基甘氨酸为基本单元的多肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)由于可与互补的RNA或DNA形成稳定的PNA/DNA(RNA)杂合链并且具有较强的蛋白酶、核酸酶抗性而预示了其作为反义抑制剂的用途,被称为第三代反义核酸[3],但细胞对PNA的吸收效率较低的问题一直没有得到很好解决。
并且,由于寡核苷酸的半衰期较短,有必要反复应用ASOD。
事实上,以上三代寡核苷酸较高的制备成本也是妨碍其广泛应用的因素之一。
同时,在反义寡核苷酸的设计上还较盲目,要设计出高效的反义寡核苷酸并非易事。
相对而言,包含反义RNA的重组质粒则相当于具有生物兼容性和生物降解性的长期释放装置。
2 反义RNA作用机制与ASOD方法相比,设计反义RNA时一般不需要目的基因的详细的调控知识,人们普遍应用由翻译起始位点延伸0.5kb～3.0 kb的片段作为重组质粒的(逆向)插入序列。
而全长的cDNA序列一般认为没有必要,尤其当目的基因较长时。
另外,互补于3′端非翻译的序列也往往具有很好效果[4]。
在真核生物中,一般认为对应5′非编码区的反义RNA优于针对编码区的反义RNA。
包含反义核酸的重组质粒在细胞内转录出反义mRNA,发挥抑制基因表达的作用。
目前,具体的作用机制尚不甚清楚,人们推测可能有: 反义RNA的作用机制主要表现在DNA复制、转录和翻译3个水平上。
2.1DNA复制中的作用反义RNA作为DNA复制的抑制因子,与引物RNA结合或作用于引物前体而抑制DNA 复制,从而降低DNA的复制效率。
E.coli的colE1质粒复制的前提是合成适当的RNA(RNA Ⅱ),它自动折叠后与DNA模板结合形成DNA复制的引物,从复制起始点上游—445bp 处开始,以另一DNA为模板反向转录的RNAⅠ正好与RNAⅡ的结合,阻止了正常引物的产生,从而干扰复制的进行。
2.2转录及转录后水平的作用反义RNA与mRNA 5′末端互补结合,阻断帽子结构形成;作用于外显子和内含子的连接区,阻碍前mRNA剪接;作用于polyA形成位点,阻碍mR-NA的成熟及其向胞浆转运。
在crp基因的ticRNA(transcription inhibitory complementary RNA)负向自我调控中,ticRNA 与crp mRNA的5′端结合,形成类似于RNA聚合酶识别的转录终止信号的二级结构,以反式作用对转录过程本身进行调控[5]。
2.3翻译水平的作用反义RNA可直接与mRNA的SD序列(含RBS)或编码区(主要是AUG)结合,从空间上直接阻止核糖体的正常结合或可直接降解靶mRNA。
反义RNA与mRNA在SD序列配对形成吻触复合体或在互补区段结合形成RNA- RNA双链结构,从而调控翻译的进行。
在真核生物细胞中有许多RNA在翻译水平上表现反义RNA的功能。
如鸡胚胎肌浆中存在的富含U的小分子RNA称为tcR-NA,它们可以与肌球蛋白重链的RNA的polyA尾杂交而抑制正常的翻译过程。
Audrey等[6]的研究表明FGF- AS RNA在翻译过程能有效地抑制FGF- 2在哺乳动物细胞中的表达。
反义RNA的重组DNA中只有启动子及终止子,当转染细胞后,重组DNA能自动表达反义RNA,并且重组DNA自身可以整合到宿主的基因组DNA中,或作为“附加体”长期存在。
在原核细胞中,反义RNA以针对SD序列效果最好,而在真核细胞中以5′端非编码区为标靶最有效。
3 反义RNA技术方法3.1反义表达载体的构建一般应用RT-PCR技术克隆出部分目的cDNA,并在两端加上限制性酶切位点倒向插入真核表达载体中,载体一般要含有下游的polyA尾以保证转录产物的稳定。
为确定插入方向可应用限制性内切酶酶切或直接测序,曹国栋等人曾介绍一种PCR鉴定重组体DNA插入方向及转染的方法[7],可有效解决酶切困难或无适当位点可供选择的问题。
下面是一些常用的真核表达载体:应用较广的是含SV40(simian virus 40)、RSV(Rous sarcoma virus)或CMV (cytomegalovirus)的启动子/增强子的质粒载体。
尤其CMV的早期启动子/增强子元件可有效的应用于各种人及鼠源的肿瘤细胞系。
含EBV(Epstein-Barrvirus)复制起点的载体,可编码核抗原(EBV nuclear antigen),可以以“附加体”形式在细胞中复制,避免了整合入染色体基因组所带来的位置效应。
在应用反义RNA 技术研究原癌基因在细胞生长、分化及凋亡的调控机制时,人们发现反义RNA对一些原癌基因表达抑制的同时抑制了细胞的生长,从而不利于转化子的筛选[8]。
一种解决办法是选择可诱导型的表达载体,使得筛选后在诱导物的诱导作用下表达出反义RNA并发挥反义作用。
1982年,Karin等构建含金属硫蛋白-Ⅱ型(MT-Ⅱ)启动子的可诱导型载体,在适当诱导条件下(如Zn2+、Cd2+等)才能启动下游基因的转录[9]。
应用此类载体进行转染已取得良好效果。
构建此类载体时要注意的是诱导物对生物体可能产生的生物学效应,尤其是毒副作用。
近年来出现了一类高效且诱导剂生物效应较小的双载体系统,如pVgRXR/pIND(Invitrogen),pTet/pTRE (Clontech),其原理是第一种质粒能够表达能与诱导剂结合的蛋白,细胞在稳定转染了第一种质粒后,再转染第二种含目的基因片段或反义片段的质粒,而第二种质粒的表达受控于能被第一种质粒所表达的蛋白所激活的转录启动子。
pTet/pTRE载体系统已成功地应用于细胞培养及转基因小鼠[10]。
但对于某些细胞系,四环素结合蛋白的高表达对其有一定的毒副作用。
3.2基因的导入(转染)磷酸钙法、电转法、基因枪是体外实验中DNA转染真核细胞的常用方法。
脂质体不仅常用于体外实验中载体DNA对细胞系的转染,也用于体内实验中的转染过程。
脂质体能提高分裂细胞和非分裂细胞对核酸的摄取,并保护其不被降解。
优点是操作简单,细胞吸收较好。
缺点是包埋的DNA量不确定,体内实验中发现在特定组织如肝脏吸收的倾向性,及对某些组织如脑有一定毒性。
在此基础上人们逐渐开发出具有一定良好特性的转染试剂如pH-敏-脂质体。
各类受体介导的转染试剂往往使转染更接近自然的生理过程(如基于转铁蛋白受体介导的核酸转染试剂),不仅可能降低毒副作用还可因受体的特异分布而具有转染的组织或细胞特异性。
另一种转化策略是以病毒作为载体,同时利用了病毒的转染特性。
rAAV-AS(AAV, adeno-associated virus,腺病毒辅助性病毒)以其安全、高效而广泛应用于反义RNA技术及基因治疗。
它几乎可以转染所有哺乳动物,但对其他动物,如家禽,目前尚未建立起其AAV系;并且,由于它的转染是细胞膜上受体介导的,哺乳动物的AAV不能用于家禽的转染[11]。
逆转录病毒在快速分裂的细胞中转染效率也相当高,这使它常被作为载体应用于肿瘤的治疗中,它可应用于哺乳动物及禽类。
其不足是它只在快速分裂的细胞中起作用,这使它的应用范围受到一定限制[11]。
一般认为体内的转染需要借助基因的导入系统(gene deliver system),Wolff和Malone等人于1990年用表达β-gal及荧光酶基因的质粒分别对小鼠肌肉进行直接体内注射,在注射区域的肌细胞检测到该基因的表达[12]。
直接注射法仅对骨骼肌细胞有效,人们推测可能与骨骼肌的多细胞核、存在胞环流等结构特性有关。