测定蛋白酶活力实验
蛋白酶活力测定实验报告
蛋白酶活力测定实验报告
实验目的：
通过测定蛋白酶的活力，了解其功能和活性。
实验原理：
蛋白酶是一类能够水解蛋白质的酶，可以将蛋白质分解为多肽和氨基酸。
蛋白酶活力是指单位时间内酶水解蛋白质的能力，通常以单位时间内水解的底物的量来表示。
本实验使用的方法是酶促反应测定法。
首先，将待测蛋白酶与底物混合，反应一定时间后，停止反应并添加淀粉溶液产生反应终止剂，最后用碘化钾溶液滴定反应产物。
实验步骤：
1. 预备试剂：制备蛋白酶和底物的工作液，制备淀粉溶液和反应终止剂，制备碘化钾溶液。
2. 实验装置：准备滴定装置和试管架。
3. 设置实验条件：保持温度恒定，控制pH值。
4. 实验操作：在试管中加入待测蛋白酶和底物工作液，反应一定时间后，加入淀粉溶液和反应终止剂，最后用碘化钾溶液滴定。
5. 记录数据：记录滴定所需碘化钾的体积，计算出酶活力。
实验结果：
根据实验数据，计算出蛋白酶的活力，通常以单位时间内水解的底物的量来表示。
实验讨论：
分析实验结果，比较不同条件下蛋白酶的活力差异，并讨论影响蛋白酶活力的因素。
实验结论：
通过分析实验结果，得出结论，总结蛋白酶活力与其他因素之间的关系，并提出可能的应用前景。
实验总结：
总结实验过程，评价实验结果及数据，提出改进意见，并对今后可能的研究方向进行展望。
参考文献：
列出所参考的文献。
实验四蛋白酶活力的测定
(先打开水浴锅，温度设置成40C) 一、实验目的 二、实验原理 三、器材仪器和主要试剂 四、实验操作 五、思考题 六、值日
一、实验目的
掌握定量测定蛋白酶活性的方法，了解本实验的酶、底 物和生成物的相关性，以及本反应的环境条件。
进一步理解酶活力和比活力的概念
Na2CO3 胰蛋白酶
四、实验操作
1、酪氨酸标准曲线的制作
管号
1
2
3
100g/ml Tyr (ml)
0
水（ml)
1.0
0.2
0.4
0.8
0.6
以酪氨酸的浓度（μg/ml）为
横坐标， A680nm为纵坐标，作 出标准曲线。
样品、对
4
5
6
照滤液 （各2支
试管）
0.6
0.8
1.0
每支管加 1ml
3．用分光光度计可以定量比较颜色深浅，测定酪氨酸生成量，根据生成物的含 量可以计算胰蛋白酶的活力。胰蛋白酶活力越高，生成的酪氨酸越多。
4. 蛋白酶活力单位定义：在40C，pH7.5的条件下，反应10min，以每min水 解酪蛋白产生1 g酪氨酸为1U。
三、器材仪器和主要试剂
可见光分光光度计 水浴锅 Folin –酚试剂 0.5% 酪蛋白 100 g/ml Tyr 溶液 三氯醋酸
3
40℃水 浴准确 保温10 分钟
三氯 醋酸 （ml）
3
------
酪蛋白 （ml）
-------
2
40℃水浴保温 10分钟，过滤 得滤液。
滤液各取1ml，进行显色反应(加Na2CO35ml+Folin-酚试剂 1ml，40 C保温15min)
（食品化学）实验四、蛋白酶酶活力的测定
实验四、蛋白酶酶活力的测定一、原理以酪蛋白为反应底物，令蛋白酶在其最适宜条件下反应一定时间，用三氯乙酸终止反应后过滤或离心得上清液，用Folin比色法测上清液中蛋白酶解物的浓度，计算蛋白酶活力。
蛋白酶活力定义：在一定的条件下，每分钟水解酪蛋白生成与1μg酪氨酸相当的三氯醋酸可溶物所需的木瓜蛋白酶的量，为1个酶活力单位（u）。
二、材料、仪器与试剂（一）材料：木瓜蛋白酶（二）仪器：可见-紫外分光光度计、水浴锅、天平、具塞刻度试管（10、15ml）、漏斗、滤纸、试管架，容量瓶、移液管（1、10ml）、烧杯（25ml）、玻璃棒。
（三）试剂：1福林试剂(Folin试剂)市场购买的Folin试剂。
此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释，即成已稀释3倍的福林试剂。
2、中性稀释液－pH7.2磷酸盐缓冲液称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至1000mL,即成0.2mol/L溶液(A液)。
称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol/L 溶液(B液)。
取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。
3、酪蛋白溶液2g恒重的酪蛋白，用0.5mol/LNaOH溶液润湿后加入80ml pH7.2磷酸盐缓冲液，沸水浴溶解，冷却后，用1 mol/L盐酸调至pH 7.0，再用磷酸盐缓冲液定容至100ml，得浓度为2%的酪蛋白溶液。
临用现配。
4、三氯醋酸溶液称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至1000mL，得0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液5、酪氨酸标准溶液精确称取精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g，逐步加入6mL 1N盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再用水稀释5倍，得到200μg/mL的酪氨酸标准溶液。
取200μg/mL的标准酪氨酸溶液，配成不同浓度的溶液（0、20、40、60、80、100μg/mL）6、样品溶液称取木瓜蛋白酶0.100g, 置于研钵中,加入相应的缓冲液定容至50mL,得到稀释500倍的酶液（当天配制、稀释）。
实验四蛋白酶活力的测定
实验四、蛋白酶活力的测定1.实验目的掌握用Folin-酚法测定蛋白酶活力的方法，与Azocasein（偶氮酪蛋白）法作为比较。
2.实验原理蛋白酶在一定的温度和pH下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在碱性条件下，将福林试剂还原，生成钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比，通过在660nm测定其吸光度，可得到酶解产生的酚基氨基酸的量，计算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的总酶活力。
酶活单位定义：在37℃、相应的pH条件下，在1min内水解酪蛋白底物，产生相当于1µg酚类化合物（由酪氨酸等同物表示）的酶量，为1个酶活单位。
3.主要仪器和试剂试剂：0.1mg/mL L-酪氨酸标准贮备溶液、0.55mol/LNa2CO3、福林试剂、Casein溶液、TCA 溶液仪器设备：恒温水浴锅、分光光度计、pH计，分析天平、秒表。
4.实验步骤（1）标准曲线绘制取三支试管（一支空白，两支样品管），分别向三支试管中准确加入5mLcasein基质液，将三支管放入37℃水浴中预热10min分别向两支样品管中加入1mL稀释酶液，准确计时，反应30min，取出迅速加入5mLTCA；空白管先加TCA预热30min再加稀释酶液，摇匀。
将三支试管继续置于37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。
三支试管中反应液用滤纸过滤。
另取三支试管（一支空白。
两支样品管），分别吸取上述相应的滤除液2mL，加入碳酸钠溶液5mL，稀Folin试剂1mL，摇匀，在37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。
以空白管为对照调仪器零点，在分光光度计波长660nm下，用比色皿分别测二支样品管中酶液的吸光度，取平均值，通过标准曲线求出生成的酪氨酸的含量。
5.数据处理。
蛋白酶酶活的测定方法(福林法)
蛋白酶酶活的测定方法（福林法）1. 酶单位定义: 1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以u /g（u/mL）表示。
2.原理蛋白酶在一定温度和pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝和钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。
3.试剂和溶液3.1福林试剂的准备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO4.2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4.2H2O）25g，水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（LiSO4）50g，水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷却后仍有绿色需要再加入溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，加水定容至1000mL，混匀，过滤。
制得得试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。
使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。
3.2碳酸钠溶液c（Na2CO3）=0.4mol/L称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，加水溶解并定容至1000mL。
3.3三氯乙酸c（CCl3.COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g,加水溶解并定容至1000mL。
3.4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。
3.5 盐酸溶液c（HCl）=1mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。
3.6 缓冲溶液a．磷酸缓冲液（pH=7.5），适用于中性蛋白酶。
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4. 2H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b．乳酸缓冲液（pH=3.0），适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80%~90%）10.6g，加水溶解并定容至1000mL。
乙液称取乳酸钠（70%）16g，加水溶解并定容至1000mL。
实验四蛋白酶活力的测定
四、实验操作
1、酪氨酸标准曲线的制作
管号
1
2
3
100g/ml Tyr (ml)
0
水（ml)
1.0
0.2
0.4
0.8
0.6
以酪氨酸的浓度（μg/ml）为
横坐标， A680nm为纵坐标，作 出标准曲线。
样品、对
4
5
6
照滤液 （各2支
试管）
0.6
0.8
1.0
每支管加 1ml
3．用分光光度计可以定量比较颜色深浅，测定酪氨酸生成量，根据生成物的含 量可以计算胰蛋白酶的活力。胰蛋白酶活力越高，生成的酪氨酸越多。
4. 蛋白酶活力单位定义：在40C，pH7.5的条件下，反应10min，以每min水 解酪蛋白产生1 g酪氨酸为1U。
三、器材仪器和主要试剂
可见光分光光度计 水浴锅 Folin –酚试剂 0.5% 酪蛋白 100 g/ml Tyr 溶液 三氯醋酸
样品管
1
对照管
1
2
----浴准确保3 Nhomakorabea-------
温10分钟
----
3
------
2
40℃水浴保温10 分钟，过滤得滤 液
2、蛋白酶活力的测定
按下表操作，然后测定滤液中的酪氨酸含量。
管号
1′号 (样品) 2 ′号 (对照)
酶液 （ml）
1
1
酪蛋白 （ml）
2
----
三氯 醋酸 （ml）
----
3. 酶活力计算
胰酶活力定义： 40 ℃ ， pH7.5 ，反应10min，每分 钟水解酪蛋白产生酪氨酸 1 微克为一个酶活力单位。
蛋白酶活性检验方法
蛋白酶活性检验方法1 定义1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和P H值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/ mL）表示。
2 福林法（第一法）2、1 原理蛋白酶在一珲的温度与P H条件下，水解底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光度法测定，计算其酶活力。
2、2 试剂和溶液2、2、1 福林试剂的制备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2Wo4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g、水700mL、85％磷酸50mL、浓盐酸100mL，水火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（Li2SO4）50g、水50mL和数滴浓溴水（99％），再微沸15min，以除去多余的溴（冷后人有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，见水定溶至1000ml。
混匀，过滤。
制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。
使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。
2、2、2 碳酸钠溶液c（Na2CO3）＝0.4mol/L称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
2、2、3 三氯乙酸c（CCl3·COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
2、2、4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。
2、2、5 盐酸溶液c（HCI）＝1 mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。
2、2、6 缓冲溶液a、磷酸缓冲液（P H＝7.5）适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b、乳酸缓冲液（P H＝3.0）适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。
蛋白酶比活力实验报告
蛋白酶比活力实验报告蛋白酶比活力实验报告引言：蛋白酶是一类能够水解蛋白质的酶，广泛存在于生物体内。
通过测定蛋白酶的比活力，可以评估其催化反应的速率和效率。
本实验旨在通过比较不同条件下蛋白酶的活力，探究影响蛋白酶活性的因素。
实验方法：1. 实验材料准备：- 蛋白酶溶液：从动物组织中提取的蛋白酶溶液，浓度为10 mg/mL。
- 底物溶液：使用明胶作为蛋白酶的底物，浓度为1%。
- 缓冲液：pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
- 试管：用于混合反应液的透明试管。
- 恒温水浴：用于控制反应温度的设备。
2. 实验步骤：- 步骤一：在不同温度下测定蛋白酶的活力。
- 将5 mL蛋白酶溶液和5 mL底物溶液混合，并放置于恒温水浴中，分别设置不同温度条件（如25℃、37℃、50℃）。
- 在反应开始后的1分钟、2分钟、3分钟等时间点，取出一定量的反应液，立即停止反应。
- 使用布拉德福法测定反应液中未被水解的底物浓度，计算蛋白酶的比活力。
- 步骤二：在不同pH条件下测定蛋白酶的活力。
- 在不同pH值的缓冲液中，重复上述步骤一的实验操作。
- 测定不同pH条件下蛋白酶的比活力，并比较其差异。
实验结果：1. 温度对蛋白酶活力的影响：- 在25℃、37℃和50℃下进行实验，测得蛋白酶的比活力分别为0.05 U/mg、0.1 U/mg和0.02 U/mg。
- 结果显示，蛋白酶的活力随着温度的升高而增加，但当温度过高时（如50℃），蛋白酶的活力反而下降。
2. pH值对蛋白酶活力的影响：- 在pH为7.4、8.0和9.0的缓冲液中进行实验，测得蛋白酶的比活力分别为0.08 U/mg、0.06 U/mg和0.04 U/mg。
- 结果显示，蛋白酶的活力在中性条件下（pH 7.4）最高，而在酸性和碱性条件下，蛋白酶的活力均降低。
讨论与结论：通过本实验，我们可以得出以下结论：1. 温度对蛋白酶活力有显著影响，适宜的温度可以提高蛋白酶的催化效率，但过高的温度会导致酶的变性，从而降低活力。
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测定蛋白酶活力实验
一、实验目的
1.加深了解酶活力的概念。
2.学习掌握测定蛋白酶活力的方法。
二、实验原理
酶活力指酶催化某一特定反应的能力。
其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。
酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。
本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg 酪氨酸所需的酶量。
实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。
产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。
因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力。
三、仪器和试剂
仪器:
恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。
原料
枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量L，磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡15分钟，使充分溶解，干纱布过滤，取滤液冰箱备用。
使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。
试剂
1. Folin-酚试剂：
在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4. 2H2O)100g，钼酸钠(Na2WoO4. 2H2O)25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL 以及浓盐酸100mL，充分混匀后，微火回流加热10小时。
再加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。
冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。
使用前用标准NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为2mol/L)，然后加水稀释至1mol/L，即可使用。
2. 0.2mol/L 盐酸溶液
3. L 氢氧化钠溶液
4. L 碳酸钠溶液
5. 10%三氯乙酸溶液
6. 磷酸缓冲液：
称取磷酸氢二钠(Na2HPO4 . 12H2O)7.16g，用水定容至100mL(A 液)；称取磷酸二氢钠(Na2HPO4.12H2O)3.12g，用水定容至100mL(B 液)。
取A 液84mL，B 液16mL 混合后，得到磷酸缓冲液，可长期存放。
临用时稀释10倍即可。
7. 标准酪氨酸溶液(50μg/mL)：称取以烘干至恒重的酪氨酸，用L 盐酸约30mL 溶解后，蒸馏水定容至250mL。
8. 酪蛋白溶液%)：称取1.25g 酪蛋白，用L 氢氧化钠溶液(20mL)溶解，再用磷酸缓冲液定容到250mL。
四、操作步骤
(一)酪氨酸标准曲线的制作
取6支试管(标号0，1~5)，按顺序分别加入，，，，和标准酪氨酸溶液，再用水补足到，摇匀后各加入L 碳酸钠，摇匀。
依次加入Folin—酚试剂，摇匀并计时，于30℃水浴锅中保温15min。
然后680nm 处测定吸光值(以0号管作对照)。
以酪氨酸含量(μg)作横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
(二)酶活力测定
1.酶反应：取一支试管，加入的酪蛋白溶液，于30℃水浴中预热5分钟，再加入已预热好的枯草杆菌蛋白酶液，立即计时，水浴中准确保温10min，从水浴中取出后，立即加入的10%三氯醋酸溶液，摇匀静置数分钟，干滤纸过滤，收集滤液(样品液)。
另取一试管，先加入已预热好的枯草杆菌蛋白酶液和的10%三氯醋酸溶液，摇匀，放置数分钟，再加入的酪蛋白溶液，然后于30℃水浴保温10min，同样干滤纸过滤，收集滤液(对照液)。
以上两过程，应各做一次平行实验。
2.滤液中酪氨酸含量的测定
取3支试管，分别加入水、A 液、B 液，然后各加入mL L 碳酸钠溶液和酚试剂，摇匀按标准曲线制作方法保温并测吸光度值。
根据吸光度值，由标准曲线查出A、B 液中酪氨酸含量差值，即可推算出酶的活力单位。
五、计算
A 样品—样品液的吸光度值
A 对照—对照液的吸光度值
K—标准曲线上A=1时对应的酪氨酸μg 数V—酶促反应液的体积(本实验为5mL) T—酶促反应时间(本实验为10min)
N—酶溶液稀释倍数。