甾体化合物RSA的11β-羟基化反应
醛固酮合酶基因多态性与原发性高血压的研究进展
醛固酮合酶基因多态性与原发性高血压的研究进展彭博，李娟*(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154003)[摘要]醛固酮在调节电解质和水的体内平衡以及维持血压方面起着重要作用。
在醛固酮的生产中特别重要的是醛固酮合酶(CYP11B2)，其催化该激素合成中的最后三个反应。
许多研究表明，醛固酮合酶基因变异，尤其是-344 C/T多态性，与高血压病有关。
本文是对评估醛固酮合酶基因的-344 C/T多态性对高血压病发展的影响的研究的简短综述。
本文还提供了有关醛固酮产生的分子调控基础信息。
[关键词]醛固酮合酶、基因多态性、原发性高血压[中图分类号]TQ [文献标识码]A [文章编号]1007-1865(2021)05-0087-01Research Progress of Aldosterone Synthase Gene Polymorphism and EssentialHypertensionPeng Bo, Li Juan*(First Hospital Affiliated to Jiamusi University, Jiamusi 154003, China)Abstract: Aldosterone plays an important role in regulating the homeostasis of electrolytes and water and maintaining blood pressure. Particularly important in the production of aldosterone is aldosterone synthase (CYP11B2), which catalyzes the last three reactions in the synthesis of this hormone. Many studies have shown that mutations in the aldosterone synthase gene, especially the -344 C/T polymorphism, are related to hypertension. This article is a brief review of studies evaluating the impact of the -344 C/T polymorphism of the aldosterone synthase gene on the development of hypertension. This article also provides basic information about the molecular regulation of aldosterone production.Keywords: Aldosterone synthase；gene polymorphism；essential hypertension1 CYP11B2基因中的344C/T多态性的生物学特性内分泌系统肾素-血管紧张素-醛固酮(RAA)是控制人体水和电解质平衡以及血压的最重要系统之一。
甾体化合物的生物转化
O
O
孕酮
根霉菌
O HO
O
11-羟基孕酮
O
HO
OH
O
皮质醇
O OH
O
OH
O
皮质酮
内容
1、概述 2、酶催化和微生物催化的反应类型 3、甾体生物转化的主要反应 4、代表性实例 5、结束语
1、 概述
生物转化（Biotransformation）是指利用生物体系以及它们所 产 生 的 酶 对 外 源 化 合 物 （ exogenous substrate, foreign substrate, xenobiotics compound）进行结构修饰而获得有价 值产物的生理生化反应，其本质是利用生物体系本身所产生的酶对 外源化合物进行酶促催化反应。生物转化具有反应选择性强（位置 选择性 regio-selectivity 和立体选择性 stereo-selectivity）、 高效率、反应条件温和、副产物少、不造成环境污染、后处理简单 等优点 。迄今，在生物转化研究领域已取得了很大的进展。生物 转化不仅应用于有机合成的研究中，而且还应用于植物次生代谢产 物的结构修饰、活性先导化合物的寻找及药物构效关系的探索等研 究中，被称为“绿色化学，green chemistry”，用于药物开发、 环境净化等科学领域，有着重要的理论意义及实际应用价值。
COOH O -呋喃甲酸
(4)
OH
O
C
C
H
乙酸杆菌属
OH
O
环戊酮
(5)
CH3
CHO
CH3 假单孢菌
CHO
OH
OH
4-羟 基苯 甲 醛
(6)
CH3
COOH
甾类激素药物的生产
发酵：将玉米浆、酵母膏、硫酸铵、葡萄 糖及水投入发酵罐中搅拌，用氢氧化钠溶 液调整物料pH值到5.7～6.3，加入0.03%豆 油，灭菌温度120℃，通入无菌空气，降温 至27～28℃，接入犁头霉孢子悬浮液，维 持罐压0.6kg/cm2，控制排气量，通气搅拌 发酵28～32小时。用氢氧化钠溶液调pH值 到5.5～6.0
投入底物氧化：发酵液体积0.15%的莱氏化合物S， 氧化48小时后，取样作比色试验检查反应终点。 提取：到达终点后滤除菌丝，滤液用树脂吸附， 然后用乙醇洗脱，洗脱液经减压浓缩至适量，冷 却到0～10℃，过滤、干燥得到粗品，熔点195℃， 收率46%左右 或用醋酸丁酯多次提取，合并提取液，减压浓缩 之适量，冷至0～10℃，过滤、干燥得粗品，熔点 为195℃，收率为46%左右
2、工艺过程
种子培养：将梨头霉菌接种到土豆斜面培 养基，28℃培养7～9d，成熟孢子用无菌 生理盐水制成孢子悬液后。 种子培养的条件：培养基为葡萄糖、玉米 浆、硫酸铵等配制，pH为5.8～6.3，接入 孢子悬液后，在通气搅拌下28℃培养 28~32h。待培养液菌浓度达到35%以上， 无杂菌污染，即可转入发酵罐。
四、甾核及边链的选择性降解机理
具有生理活性甾体类药物的基本母核目前 都是从高等动植物中获得 首先必须有选择性地对其边链进行降解。 化学法选择性差，产率低。目前，多采用 微生物转化法。
甾体药物的天然资源
薯蓣皂苷元（约占60%） 豆甾醇（约占15%） 胆甾醇 β-谷甾醇
甾核边链的选择性降解的应用
3、混合培养进行反应是将具有1，2脱氢能力 和11β-羟化能力的微生物并用进行转化反 应。
甾体微生物转化C_11_羟基化的研究进展
化物的含量较低。在这一过程中, 最有效的甾体 C11 羟基化菌是新月弯孢霉( Curvularia lunata) VKM F
644 和 VNICFI 两株菌, 它们对 RS 和 RSA 呈现了最 高的 C11 羟基化活性, 积累的转化产物量达到 50% ( RS 为底物) ; HC 与副产物 14 羟基 RS 的数量比在 2!1~ 2 5!1 的范围内; 对 RSA 的转化过程, 这两株 菌均 能 生 成 C11 羟 基 化 产 物 HC, 数 量 分 数 为
37 5% , 副产物 14 羟基 RS 为 25% , 主副产物之比 为 1 5!1; 尚存留 20% ~ 25% 的底物 RSA。可见, 以 RSA 作为转化产物, 都要经菌丝培养物的脱乙酰化 ( 水解) 生成 RS, RS 再被液体菌丝培养物的 C11 羟化
酶系催化生成相应的甾体羟化产物, 即目标产物 HC 和副产物 14 羟基 RS。
进行了研究, 也表明新月弯孢霉 C11 羟基化的转化 能力[ 14] 。曾本秀等对新月弯孢霉对甾体 C11 羟基 化的研究也作了部分研究工作, 对菌丝体的培养、底 物的添加浓度及时间、转化条件等进行了一些试验 研究[ 15] 。本实验室通过对新月弯孢霉 AS3 4381 菌 株的选择, 发酵工艺的改进, 提高了投料浓度及总甾 体量的回收率, HC 产率较现有的蓝色犁头霉显著提 高, 有望投入工业化开发[ 6 7] 。
羟基化的研究进展及应用作一评述。
1 甾体 C11 羟基化生物化学反应的机理
甾体的羟化酶都是细胞色素 P450 依赖型单加氧 酶, 是 P450 末端氧化酶, 其利用分子氧而且需要一个 NADPH 提供 电子 转移 系统。RH + O2 + NADPH + H+ ROH+ H2O + NADP+ 。
甾体类化合物及药物的酶催化合成
微生物酶促转化制备甾体药物
微生物酶促转化植物甾醇 制造的甾体类药物的重要中间体 AD， ADD，9a-OHAD，HBC
甾体药物微生物酶促转化的主要反应
立体选择性羟基化
酮基不对称还原
区域选择性脱氢
微生物酶促转化的立体选择性羟化
11β、11α、9α、7β ，19, 25位 进行羟基化后产物价值大幅度提升
初创阶段 1940之前
动物组织中分离
起步阶段 1940-1960
化学合成及薯蓣皂素-双烯”半合成体系
成熟阶段 1960-1980
薯蓣皂素产量提升，半合成工业体系随之成熟
转型升级阶段 1980-now
微生物转化植物甾醇取代薯蓣皂素，
微生物细胞转化植物甾醇的代谢途径
植物甾醇的微生物天然代谢途径最终生成 丙酰CoA和丙酸盐 改造微生物代谢途径后可以制备 甾体重要中间体 AD， ADD，9a-OHAD，HBC
甾体从头合成细胞工厂的创建与优化
酶系
3-酮基 甾体-Δ1-脱氢酶（ Rieske 型7（8）位脱氢酶
微生物酶促转化区域选择性脱氢 目前的问题及对策
1. 脱氢后的化合物极易被宿主细胞中的酶进一步代谢消耗 对策：敲除宿主后续代谢相关酶系，积累产物
2. 异源表达难度较大 对策：MBP融合表达，调整表达宿主（昆虫系统表达）
3. 羟化酶系选择性和活性较低 对策： 蛋白质工程改造提高区位选择性及活力
4.羟化酶还原酶未知或电子传递效率较低 对策： 在原菌株中进行高效表达
微生物酶促转化的酮基还原
区域选择性脱氢概述
脱氢位置 3 17 3,7,12
产物 黄体酮， 雌二醇 胆酸类
酶系 3-HSD 17-HSD SDR
工业微生物学 重点
1.真核细胞与原核细胞构造的异同；
2.酵母菌的繁殖方式、生活史；
3.霉菌菌丝体的功能和特化形式、繁殖方式、生活史。
本章主要教学要求：此章为本课程的重点内容之一，要求学生了解和掌握原核生物与真核微生物的主要区别，酵母菌和霉菌的形态、结构与功能、培养特征、繁殖方式和生活史等基本理论知识，了解食品发酵和制药工业中常见的酵母菌和霉菌。
第二章原核生物的形态、构造与功能
第一节细菌
第二节放线菌
第三节蓝细菌
第四节支原体、立克次氏体和衣原体
教学基本内容：
1.细菌：主要介绍细菌的形态和大小、原核生物的细胞结构和功能、细菌的繁殖方式、细菌的菌落特征及工业上常见的有益菌和有害菌，如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）用于生产α-淀粉酶（BF7658）蛋白酶(中性蛋白酶，AS1.398)醋酸杆菌，醋酸发酵：恶臭醋杆菌（AS.1.41），巴氏醋酸菌（沪酿1.01）保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）（改名：德氏乳杆菌保加利亚亚种）酸奶发酵剂；嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）酸奶发酵剂；北京棒杆菌（Corynebacterium pekinese）谷氨酸发酵；大肠埃希氏菌（Escherichia coli）生产谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸、天冬酰胺酶食品卫生重要指示菌，作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量；肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）右旋糖酐（代血浆）和葡聚糖（sephadex）；双歧杆菌（Bifidobacterium）能在肠道定植的益生菌；苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）细菌杀虫剂；.丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）丙酮，丁醇；荧光假单胞杆菌（Pserdomonas fluorescens）降解苯酚等。
甾体化合物的性质
酶解法条件温和，选择性好，产率高，在强心苷生 成中有很重要的作用。
甾醇和碱的作用
C2H5ONa
5α-胆甾烷-3α-醇
5α-胆甾烷-3β-醇
C2H5ONa 5β-粪甾烷-3β-醇 5β-粪甾烷-3α-醇
3位羟基半径较大，处于a键时与C1、C5的氢有排斥力，即1,3-二 直立键相互作用，同时与C1、C5有两个邻交叉型相互作用。当羟 基位于e键时与C1、C5的氢无排斥力，与C1、C5有两个对交叉型 相互作用，较稳定。平衡有利于e键羟基。
将25%的三氯醋酸乙醇液和3%氯胺T水溶液 以4:1混合，喷在滤纸上与强心苷反应，干后90℃ 加热数分钟，于紫外光下观察可显黄绿色、蓝色、 灰蓝色荧光。
强心苷α，β-不饱和内酯的显色反应
Kedde反应:
将样品点在滤纸上，滴加3，5-二硝基苯甲酸 试剂，显紫红色斑点。
强心苷2-脱氧糖的显色反应
Keller-Kiliani反应：
消去反应
POCl3-吡啶
POCl3-吡啶
POCl3-吡啶
POCl3-吡啶
由产物的稳定性（超共轭效应）可知反式双a键位置时容易发生 消去反应。
加成反应
中性KMnO4（冷） 或OsO4 胆甾醇 5α，6α-二羟基产物
含有双键的甾体化合物易发生加成反应，由于角甲基为β型，所 以加成时从位阻较小的α面向双键进攻。
KMnO4
t-BuOH,K2CO3,35℃
还原反应
1.LiAlH4 2.H2O
羰基还原时常用LiAlH4、NaBH4等作还原剂，由于甾环的特殊结 构，羰基还原后常得到一种构型为主的产物。
Brδ+-Brδ-
Br-
10d后
双键加溴产物中两个溴在反式双a键位置，不稳定，易发生消 去反应，放置10d后可转化为粪甾烷系二溴产物。
氢化可的松的合成研究进展
氢化可的松的合成研究进展【摘要】氢化可的松是哺乳动物主要的肾上腺皮质激素类药物和重要的甾体药物合成的中间体。
本文简要综述了其全化学合成、半合成法及全生物合成方法、路径的国内、外现状及相关进展情况，并对其发展方向进行了评述和展望。
【关键词】氢化可的松；甾体药物；化学合成；半合成法；生物合成ABSTRACT Hydrocortisone is the major glucocorticoid and an important intermediate in steroid drug synthesis. The main synthetic approaches and progresses including total chemical synthesis, semi-synthesis andwhole-cell bioconversion for hydrocortisone manufacture in domestic and other countries were briefly reviewed. Prospective and evaluation of hydrocortisone synthesis were also discussed.KEY WORDS Hydrocortisone; Steroid agents; Chemical synthesis;Semi-synthesis; biosynthesis氢化可的松(hydrocortisone，HC)的化学名称为11β，17α，21-三羟基孕甾-4-烯-3，20-二酮，属肾上腺皮质激素类药，是激素类药物中产量最大的品种，其结构式如图1所示。
目前中国、英、美、日、法等国及欧洲药典均有收载。
5体HC是哺乳动物肾上腺皮质分泌的主要糖皮质激素，其药理作用是通过弥散作用于靶细胞，与其受体相结合，形成类固醇-受体复合物，激活的类固醇-受体复合物作为基因转录的激活因子，以二聚体的形式与DNA上的特异性顺序链结合，调控基因转录，增加mRNA的生成，并以此为模板合成相应的图1 氢化可的松结构示意图蛋白，这些蛋白在靶标细胞内实现类固醇激素的生理和药理效应;HC能影响糖代谢，具有抗炎、抗病毒、抗休克和抗过敏等作用。