生物制药思考题

第一章绪论

1.生物技术的定义与内容

生物技术是指应用自然科学和工程学的原理，依靠生物作用剂的作用将物料进行加工以提供产品或为社会服务的技术。

生物技术内容：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程等。

生物技术的一个主要目标就是生物物质的高效生产。

2.什么是生物药物？生物药物可分为哪些类型？

生物药物：利用生物体的初级或次级代谢产物、生物组织或整个生物体来生产用于预防、诊断或治疗疾病的医用品。

生物药物的分类（按来源与性质分类）

1. 天然生物药物：天然存在于动物、植物、微生物以及各种海洋生物等生物体内，直接通过提取、分离和纯化获得的有效的药理成分；

2. 重组药物：重组多肽、蛋白质

3. 基因药物：核酸类药物（基因治疗剂、基因疫苗、反义药物等）

4. 合成与半合成的生物药物

生物药物按功能与用途划分为：

1. 治疗药物

2. 预防药物（主要预防传染病，疫苗、类毒素）

3. 诊断药物（速度快、灵敏度高、特异性强）

3. 了解和熟悉一些常见的基因工程肽类药物。

细胞因子（cytokine）：细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白质的统称。在很多情况下，多种免疫细胞间的相互作用是通过细胞因子介导完成的。干扰素类(interferon，IFN)，白细胞介素类（interleukin，IL），集落刺激因子类（colony-stimulating facor, CSF)，表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF），神经生长因子（nerve growth factor，NGF ），肿瘤坏死因子类（tumor necrosis factor，TNF），红细胞生成素（erythropoietin，EPO），凝血因子VIII、IX。

激素:胰岛素(insulin)，生长激素（growth，GH），降钙素（calcitonin ），心钠素（atrial natriuretic factor, ANF ）。

药用酶及其他蛋白药物：链激酶（streptokinase,SK），尿激酶（urokinase），葡激酶（staphylokinase），组织型纤溶酶原激活剂（tissue-type plasminogen activator，t-PA ），超氧化物岐化酶（superoxide dismutases，SOD）。

第二章基因工程制药

1、写出基因工程的基本要素及制备基因工程药物的基本过程。

基因工程基本要素：工具酶，目的基因，载体，宿主

制备基因工程药物的基本过程

2、列出4种获取目的基因的方式。

1、构建基因文库。适合于无内含子的原核生物。

2、构建cDNA文库。适合于真核生物基因克隆。

3、PCR方式。

4、化学合成。已知基因或蛋白质全长序列，合成短的寡核苷酸片断，拼接为长的DNA片断，再用连接酶连接成完整基因。

3、了解常用的外源基因表达系统。

1、原核表达体系

（1）大肠杆菌：目前采用最多的原核表达体系。

（2）枯草芽孢杆菌

（3）链霉菌

2、真核表达系统

（1）酵母

（2）丝状真菌。近年来在30种以上丝状真菌中建立了DNA转化体系。

（3）昆虫细胞表达体系。以昆虫细胞为表达宿主。

（4）哺乳动物细胞表达系统

4、写出大肠杆菌表达系统的优势和缺点。

大肠杆菌：目前采用最多的原核表达体系。革兰氏阴性菌

优势：遗传背景清楚，基因组序列已确定；生长迅速，平均20~30min繁殖一代；易于培养，生产成本低，适合大规模培养；外源基因表达水平高，可达总蛋白的5~30％以上；有大量可供选择利用的克隆和高效表达载体。

缺点：缺乏翻译后加工修饰系统，缺少糖基化功能；没有有效释放蛋白到培养基中的分泌机制；表达的外源蛋白多形成包涵体，蛋白的复性较困难；翻译目的蛋白N端常多一个甲硫氨酸残基（AUG编码）。

5、写出融合表达优点和缺点。

融合表达具有多方面的优点：

1、能使外源基因得到有效转译，防止包涵体的形成，促进蛋白质的正确折叠，限制蛋白酶

解，利于检测与纯化。

2、成功应用的融合担体蛋白：谷胱甘肽S-转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白（MBP）以及硫氧还蛋白（Trx）等。

3、融合表达一般都有方便的纯化方法（GST 融合蛋白可采用谷胱甘肽-sepharose亲和柱进行纯化，带组氨酸标签的融合蛋白采用金属螯合层析纯化）。

缺点：对融合蛋白进行位点特异性裂解。

6、质粒不稳定有哪两类？

1、分裂不稳定性：工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌。

相关因素：（1）质粒的丢失率（宿主菌、质粒特性和培养条件）；

（2）含质粒菌与不含质粒菌的生长速度差异

2、结构不稳定：DNA从质粒上丢失、质粒上序列发生重排等。

7、画出基因工程药物分离纯化的流程。

8、什么是包含体？包含体形成的原因是什么？包含体表达的优点和缺点是什么？常用哪些试剂溶解包含体？包含体复性的方式有哪些？

包含体（Inclusion Body）：外源基因在大肠杆菌中高水平表达时通常形成的一种由目的蛋白构成的不溶的、无活性的蛋白聚集体。

包含体表达的优点：表达量高；密度高（1.2-1.4g/mL之间），容易分离；抗蛋白酶；对宿主毒性小。

包含体复性方法：稀释复性；透析复性；层析复性。

影响复性的操作参数：蛋白浓度、温度、pH、离子强度。

提高蛋白复性率的策略：复性添加剂如PEG、表面活性剂；分子伴侣

常用半胱氨酸之间形成二硫键方法：

1. 空气氧化法。在碱性条件下通空气，氧化时可以加入二价铜离子加快反应速度，能够取

得更好的效果，缺点是不易控制氧化还原电势，而且二硫键的氧化形成速度慢；

2.氧化还原对重排体系。常用氧化还原对有氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽和胱氨酸/半胱氨酸，通过调整氧化还原两种物质的比例可以控制较精确的氧化还原电势，对二硫键反应进行控制，其二硫键形成速率快于空气氧化法。

9、对基因工程药物进行质量控制时需要做哪些项目分析？

目标产品的质量控制：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性、一致性。

1.生物活性测定：活性、比活

2.产品的鉴定

（1）相对分子量：SDS-PAGE、凝胶过滤，允许10%误差。必要时采用质谱准确测定。（2）等电点：等电聚焦测定，等电点常不均一，每批测定结果应一致。

（3）紫外吸收光谱：特征型吸收，每批一致

（4）氨基酸序列测定：送检中试头三批产品，N端15个氨基酸序列，C端1～3个氨基酸残基。

（5）氨基酸组成分析

（6）免疫印迹（western blot）

（7）圆二色光谱

（8）肽图：一般用胰蛋白酶或CNBr裂解，再用RP-HPLC或SDS-PAGE分析

（9）二硫键分析

3.蛋白纯度分析：必须采用非还原SDS-PAGE和HPLC进行检定，其他检测方法包括CE（毛细管电泳）等。

4.杂质检测

（1）内毒素：家兔法、鲎试剂法

（2）宿主细胞蛋白：免疫分析

（3）宿主细胞残余DNA：核酸杂交，100pg/剂量

（4）细菌、酵母、真菌、支原体、病毒：微生物学方法

（5）其他物质：抗生素，牛血清；采用了抗体亲和层析，检测小鼠IgG含量。

5.稳定性检测：在不同温度下保存，定期取样检测生物活性及其他特性的变化。

6.一致性：各批次产品均符合标准规格。

第三章动物细胞工程制药

1、动物细胞可应用于哪些药物的生产？

动物细胞作为一种重要的宿主细胞，可用以下药物的生产：病毒、疫苗、其他的各种重组蛋白、单克隆抗体

2、请根据哺乳动物的形态对其进行分类。

离体培养的动物细胞主要为哺乳动物细胞。

根据是否需要帖附于支持物上生长的性质，可将动物细胞分为贴壁依赖型和悬浮型两类。1、贴壁依赖型。绝大多数细胞在培养时必须贴附在某一固相表面才能生存和生长。按培养细胞的贴壁的形态主要分为4类：

（1）成纤维细胞型。形状与体内成纤维细胞形状相似而得名，细胞大致呈梭形或不规则三角形。

（2）上皮细胞型。形状为扁平的不规则多角型。

（3）游走细胞型。在支持物上分散生长，不连接成片，呈活跃的游走和变形运动。

（4）多形性细胞。形态不规则。

2、悬浮型。少数细胞在培养时呈悬浮生长，来源于血液、淋巴组织的细胞、某些肿瘤细胞、

杂交瘤细胞、转化细胞为悬浮型。形态常为球形，可悬浮培养。

3、兼性贴壁细胞。不严格的依赖支持物，某些情况下可在培养基中良好悬浮生长。

3、写出动物细胞的生理特征。

动物细胞的生理特征:

1. 细胞分裂周期长（12~48h ）

2. 细胞生长需贴附基质，存在接触抑制

3. 正常二倍体细胞生长寿命有限

4. 对周围环境十分敏感

5. 对培养基要求高：氨基酸、维生素、无机盐、细胞生长因子、贴壁因子、血清等。

6. 对蛋白合成途径和修饰与细菌不同（糖基化）

4、简要了解生产用动物细胞的种类及细胞库的类型。

动物细胞种类：

1原代细胞：直接取自动物组织、器官，经粉碎、消化得到的细胞悬液。特点：需要大量动物，例：鸡胚细胞、原代兔肾或鼠肾细胞、血液淋巴细胞。

2. 二倍体细胞系：通过筛选、克隆从原代培养细胞中获得的具有某种特征的有限细胞株。特点：有限增殖、2n、贴壁、接触抑制。例：MRC-5、WI-38

3、转化细胞系：通过某个转化过程形成，常由于染色体断裂成为异倍体。特点：自发形成，啮齿动物细胞多发；病毒感染后转化；直接从动物肿瘤组织中建立的细胞系。转化细胞具有无限生命力，一般倍增时间短、对培养条件和生长因子要求较低。

4、融合细胞系：细胞融合：两个或两个细胞合并成一个细胞的过程。主要为杂交瘤细胞。

5、重组工程细胞系：构建含目的基因的真核细胞表达载体（病毒载体、质粒载体）导入动物细胞，通过选择标记筛选工程细胞。

细胞库类型：

1、原始细胞库（master cell bank，MCB）：二倍体细胞：群体倍增水平尽可能低的细胞（传代次数尽可能少的细胞），记录详细档案

2、工作细胞库（working cell bank，WCB）：生产用细胞库（manufacturer’s working cell bank，MWCB）

5、动物细胞培养所用合成培养基主要成分包括哪些？培养基中添加血清的作用是什么？

合成培养基成分明确、组分稳定，主要由成分包括：

1、氨基酸必需氨基酸、半胱氨酸、酪氨酸及其他种类氨基酸；

2、维生素

3、能源物质（葡萄糖、谷氨酰胺）

4、无机盐

5、缓冲体系

6、其他成分如核酸前体物质（腺苷、鸟苷等）、脂类物质等

血清作用：

1、提供细胞生长所需的各种生长因子和激素

2、提供细胞生长所需的贴附因子和伸展因子

3、提供可识别金属离子、激素、维生素、脂质的结合蛋白

4、提供细胞生长所必须的脂肪酸和微量元素。

6、动物细胞培养采用无血清培养基有何优点？无血清培养基中需要

在合成培养基的基础上加入哪些成分？

无血清培养基的优点：提高了细胞培养的重现性、减少了血清带来的污染问题、供应充足、产品易于纯化。

在合成培养基中添加一些特殊成分而成：

1、激素和生长因子(胰岛素和表皮生长因子等)

2、结合蛋白（铁传递蛋白、白蛋白）

3、帖附和伸展因子（纤维结合蛋白胶原、一些多肽）

4、其他有利于细胞生长的因子和元素（谷胱甘肽、硒等）

7、了解动物细胞大规模培养的培养方法。

动物细胞大规模培养方法：

1、悬浮培养：适用于非贴壁依赖性细胞，如杂交瘤细胞。适应于兼性贴壁细胞。

2、贴壁培养：细胞贴附在固体表面生长以单层膜的形式生长，适用于贴壁依赖性细胞与兼性贴壁细胞。

3、假悬浮培养（微载体培养、微囊化培养）：

微载体培养指将细胞贴附在微载体上进行悬浮培养。

微囊化培养指将动物细胞包裹在亲水的球状半透性薄膜形成的微囊内。营养成分能透过，但细胞不能出来。适用于贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞。

包埋培养采用各种凝胶进行包埋后培养，主要的凝胶载体为海藻酸凝胶、琼脂糖等。动物细胞包埋后细胞活性不高，很少采用。

结团培养某些结团生长的细胞本身作为贴附基质,可加入直径较小的颗粒（20um）促进结团。很少采用。

9、什么微载体培养？微载体培养有何优点？优良的微载体需要具备哪些特性？

微载体培养：指将细胞贴附在微载体上进行悬浮培养。微载体为直径为100~250um，适用于贴壁细胞生长的球状颗粒。

优点：

1、培养体系的比表面积大，可随载体浓度的改变而改变，细胞培养密度较高

2、培养体系均匀，培养重复性好

3、培养基的利用率高

4、取样后很容易通过显微镜观察载体表面的细胞生长状况

5、收获细胞和细胞产物简单

6、放大容易

7、对人工和空间的需求低

优良的微载体一般要具有以下特性：

1、载体表面与细胞相容性良好，带较低的正电荷，适于细胞的附着和生长

2、微载体的相对密度略大于培养基，在1.03~1.05之间，轻度搅拌就能时载体悬浮起来，停止搅拌很很快沉淀

3、颗粒粒度分布均匀，表面光滑利于细胞铺展

4、载体透明，容易用显微镜直接对细胞观察

5、材料无毒性

6、载体材料为非刚性材料，避免培养过程中相互碰撞损伤细胞

7、可以高温灭菌

8、惰性，不吸收或少吸收培养基组分

9、能重复使用，价廉

10、写出组织型纤溶酶原激活剂的作用机理。

作用机理：

1、游离t-PA对纤溶酶原亲和力很低，不产生激活作用。

2、t-PA对血栓中纤维蛋白有很强亲和力，与纤维蛋白结合后的t-PA能够激活纤溶酶原，形成纤溶酶，纤溶酶在血栓部位水解纤维蛋白，使血栓溶解。

3、少量进入血液的纤溶酶能可被α2-抗纤溶酶作用失活。

11、决定蛋白糖基化糖链的因素有哪些？

决定糖链的主要因素：肽链的不同；细胞内糖基化酶的不同；细胞培养环境的影响。

第四章抗体制药

1.什么是单克隆抗体？单克隆抗体有何不足？

单克隆抗体：仅识别单一抗原决定簇，由同一细胞产生，高度特异性、均一性、来源稳定可大量生产。

McAb 在免疫导向疗法中存在的问题（障碍）：

A、鼠源性，产生人抗鼠抗体，排斥反应，半衰期短，难维持有效药物作用靶组织时间；

B、相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。

2.杂交瘤细胞技术中杂交瘤细胞HAT选择培养的原理是什么？

培养原理：动物细胞核苷酸合成两条途径：全合成途径、补救合成途径：氨基喋呤（Aminopterine，A）为四氢叶酸的结构类似物，能够和二氢叶酸还原酶（能够将二氢叶酸还原生成四氢叶酸）发生不可逆结合，阻止了四氢叶酸（核苷酸生物合成的甲基供体）的生成。从而阻断了阻断GMP、TMP的生物合成。

GMP、TMP的补救合成途径：GMP可以在HGPRT（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）的作用下由次黄嘌呤（hypoxanthine，H）合成。TMP可以在TK(胸苷激酶)的作用下，由胸腺嘧啶（thymine, T）合成。

3.列出人源化抗体的种类，并简要说明其制备原理。

人源化抗体种类：

1、嵌合抗体：将鼠源单克隆抗体可变区和人抗体恒定区连接起来的抗体。免疫原性大幅度降低。保留抗原结合特异性。

2、改形抗体：抗原结合区域：H和L链V区中的互补性决定区；将鼠源性单克隆抗体的

CDR以外序列替换人Ig分子中的序列，可基本消除免疫原性。改型抗体也称CDR移植抗体。

3、镶面抗体：抗体可变区表面暴露的氨基酸残基位置和数量非常保守，不因种属和型别改变。为免疫原性主要来源，将鼠抗可变区表面暴露的骨架区氨基酸残基改为相应的人源残基，使可变区表面人源化。消除异源性，保持单抗特异性和亲和力。

4.了解小分子抗体的种类。

小分子抗体种类：

1、Fab片断：完整轻链和重链Fd段（单价），完整抗体的1/3，木瓜蛋白酶水解抗体，重组方式生产，抗原特异性、制作简单

2、Fv与单链抗体

（1）Fv （可变区片断）：V L、V H非共价键结合（单价）；完整抗体的1/6；基因工程重组生产；易解离

（2）ScFv：常用连接肽：(Gly4Ser)3

3、单域抗体：V H或V L；；仍保留了抗原结合活性；亲和力低

4. 分子识别单位：单个CDR区；亲和力相当低

5.什么是抗体库技术？写出噬菌体抗体库技术的优点。

抗体库技术：克隆全套抗体重链和轻链可变区基因，重组到特定原核表达载体中，转化大肠杆菌表达有功能的抗体分子片断，通过亲和筛选得到特异性抗体可变区基因的技术。

噬菌体抗体库技术的优点：

1、能包含B细胞全部克隆，库容量大，可筛选到各种抗体

2、避开了人工免疫和杂交瘤技术，直接获得抗体基因

3、可获得高亲和力的人源化抗体

4、筛选得到的抗体更易于在大肠杆菌中表达

6.噬菌体展示的基本原理，噬菌体展示过程中辅助噬菌体的作用。

原理：外源基因插入在特殊的质粒，即噬菌粒上，噬菌粒含质粒和噬菌体的复制起始点，但需要辅助噬菌体提供产生单链所必需的蛋白。噬菌体颗粒中单链DNA主要来自于带外源基因的噬菌粒。

作用：噬菌体的繁殖需要野生型P3、P8蛋白，也由辅助噬菌体提供，野生型的P3(或P8蛋白)和P3融合蛋白(或P8融合蛋白)共同组装到噬菌体颗粒的表面。

7.了解噬菌体抗体库的构建与筛选过程。

噬菌体抗体库的构建：

1、扩增全套抗体可变区基因：从人外周血获取B细胞，提取B细胞mRNA，RT-PCR扩增全套抗体可变区基因。

2、构建合适的噬菌体表面展示载体：Fab抗体库展示载体；scFv抗体库展示载体

3、转化大肠杆菌

筛选过程：

8.什么是血清学鉴定，其基本原理是什么？

血清学鉴定：用已知抗体来鉴定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌诊断和血型鉴定。基本原理：抗体与抗原之间的凝集反应

9.免疫标记技术用的抗体类试剂有哪三种？

荧光抗体诊断试剂；酶免疫测定用抗体诊断试剂；放射免疫用抗体诊断试剂

10.ELISA 的基本方法有哪些？了解生物素-亲和素放大ELISA

ELISA基本方法：夹心法，间接法，竞争法

11.简要了解抗体治疗药物的种类。

1. 放射性同位素标记抗体药物

2. 抗癌药物偶联的抗体药物

3. 毒素偶联或融合的抗体药物

4. 细胞因子偶联或融合的抗体药物

5. 与药物代谢酶相连的抗体药物

6. 双特异性抗体

第五章植物细胞制药

1.植物次级代谢产物有何特征？写出植物细胞培养生产次级代谢产物优势和缺点。

次级代谢产物（与生长无关，如生物碱、黄酮、萜类等）特征：

（1）缺乏明确的生理功能

（2）在生长的一定阶段才合成

（3）有明显的分类学区域界限

植物细胞培养生产次级代谢产物优势：适用于生产结构复杂、化学合成困难的成分；适用于生产天然植物资源匮乏的药物（自然分布少，生产速度慢等）；工厂生产可以避免不利气候条件、病虫害影响和地理环境的限制

缺点：生产成本高，只适合一些价格昂贵的次级代谢产物的生产

2.植物细胞培养有何特征？

1、植物细胞尺寸大，悬浮培养时会形成很多细胞聚集在一起的细胞团，细胞数在2～200个；

2、植物细胞对剪切力（搅拌）非常敏感；

3、易沉降；

4、生长缓慢，一般倍增时间为1～2天以上，分批培养要2～3周，半连续或连续培养要2～3个月以上；

5、植物细胞对营养的要求比微生物高的多，比动物细胞简单，培养基费用高

6、易染菌

7、植物细胞生长与次级代谢产物的合成无显著关系

8、次级代谢产物多数为胞内产物，少数为胞外产物。

第六章酶工程制药

1.什么是酶的固定化，简述固定化酶的优缺点及固定化方法分类。酶的固定化是指将酶限制或固定在一定空间的方法。

固定化酶优点：可以重复多次使用；酶与底物及产物容易分开；反应条件易控制，可连续化生产；稳定性提高

缺点：固定化过程中会引起酶的失活；固定化提高了酶的生产成本；酶固定化后底物及产物传质阻力增加，只能用于可溶底物，适于小分子底物，不适于大分子底物

2.酶的生产方法可分为哪几种？其中哪种方法为酶生产的主要方法，并简述该方法优点。

酶的生产方式：动植物提取，微生物发酵生产酶，化学合成

酶的主要生产方式：微生物发酵

优点：

（1）微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎都能从微生物中得到

（2）微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可以通过控制培养条件来提高酶的产量（3）微生物具有较强的适应性，异变异，通过各种遗传变异的手段，能培养出新的高产菌株

3.酶的生产菌应符合什么要求？

应用于生产的菌种应具备以下条件：

1、酶产量高

2、容易培养，能利用廉价原料，繁殖快

3、产酶性能稳定，不易退化，不易受噬菌体感染

4、最好是胞外酶，有利于酶的分离

5、安全，非致病菌

4.什么因素可导致固定化酶最适pH发生改变，并简述其影响。

载体电荷性质的影响：带负电的载体由于静电作用会使固定化酶微环境中H＋浓度升高，导致固定化酶周围的pH值比整个溶液要低。为了使抵消这一影响，必须调高溶液的pH值，才能使固定化酶达到最高速度。因此，带负电荷的载体往往导致固定化酶最适pH向碱侧偏移。同理，带正电荷的载体使固定化酶最适pH降低。不带电荷的载体最适pH可能不变

5.了解酶分子修饰的方式；大分子结合修饰的作用有哪些？

修饰的方法：

一、金属离子置换

二、大分子结合修饰

三、肽链的有限水解

四、酶蛋白侧链基团修饰

五、氨基酸置换

六、物理修饰

七、其他修饰方法

酶分子修饰的作用：

1、改变酶学特性（提高酶活力；改变最适pH、最适温度、对底物的特异性等）

2、增加酶的稳定性（热稳定性、抗蛋白酶水解等）

3、消除或降低酶的抗原性

6.写出非水相酶反应的特点。

非水相酶催化特点：

1、大多数有机化合物在非水系统中溶解度高于水溶液

2、一些在水中不能进行的反应，可以在非水系统中进行

3、条件适当时，酶在非水系统中有较高的稳定性

4、从非水系统中回收产物比水相容易

5、非水系统酶不溶，容易回收和反复使用