细胞复苏的步骤
细胞培养的实验步骤
细胞培养的实验步骤细胞培养的实验步骤如下：1、细胞复苏：细胞培养条件2、复苏流程：（1）确认水浴锅的水清洁可用，方可提前打开37度预热。
（2）确认好复苏细胞的液氮罐中具体位置，并做好复苏登记。
（3）提前做好复苏准备，预热培养基。
（4）悬浮和贴壁细胞复苏参数：（5）将细胞快速放入37度水浴锅中迅速溶解，1.8ml时间大概1分30秒，1ml大概1min左右，需计时，其间不要老是拿起来观察，需要快速复溶，避免细胞受到损伤。
（6）贴壁细胞需离心，1000rpm，5min。
悬浮细胞直接加入预热的培养基中然后放入培养箱中（7）贴壁细胞离心后去除上清，用预热的培养基重悬细胞后加入T25方瓶，蕞后放入培养箱中培养。
（8）取小样计数观察，细胞活力在70%以上算正常。
低于70%活力可能细胞状态不太好，需要培养和恢复。
3、细胞传代培养1．悬浮细胞传代流程：（1）先将装有细胞的摇瓶从培养箱拿出，用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台。
（2）打开摇瓶瓶盖，用200ul移液器取100~200ul细胞放入1.5mlEP管中，瓶盖过火，拧紧，将培养瓶放回摇床。
（3）将200ul细胞混匀，取10ul细胞加入10ul台盼蓝，显微镜下计数。
根据细胞数决定下游实验。
（4）细胞需计数两次求平均值。
（5）悬浮细胞生长参数（6）根据不同细胞的生长曲线在合适的时间和密度给细胞接种传代。
以sf9细胞为例：细胞接种密度0.4x10^6个/ml,24h密度1x10^6个/ml,48h密度2.4x10^6个/ml,72h密度6x10^6个/ml，此时需要传代细胞。
要求留样100ml0.4x10^6个/ml具体操作如下：计算：需要母细胞体积=100*0.4/6=6.6ml需要培养基体积=100-6.6=93.4ml将上面体积的细胞和培养基加入摇瓶中，放回27度培养箱培养即可2.贴壁细胞传代流程：（1）显微镜下观察细胞状态和密度，80%汇合率以上需要传代。
（2）T25方瓶中加入0.5ml~1ml0.25%胰酶溶液（需37度预热），使瓶底细胞都浸入溶液中。
细胞复苏的基本过程
细胞复苏是指受损或受压力的细胞逐渐恢复正常功能和结构的过程。
下面是细胞复苏的基本过程：
感知和响应：细胞首先感知到外部环境的变化或内部损伤，通过细胞表面的受体和信号传导通路来传递信号。
防御和修复：细胞启动防御机制，抵御外部压力或损伤。
这可能涉及调节细胞内的代谢活动、释放抗氧化剂和抗炎因子，以及修复受损的细胞结构和功能。
能量调节：细胞为了适应恢复和修复的需要，调节能量代谢过程。
它可能增加能量产生的过程，如线粒体呼吸和ATP合成，以支持细胞复苏所需的能量需求。
蛋白质合成和修复：细胞增加蛋白质合成，以产生新的蛋白质来替代受损的蛋白质。
这可以通过启动细胞内的信号通路和转录因子来实现，促进相关基因的表达和蛋白质合成。
恢复平衡：细胞恢复内部环境的平衡，包括细胞内离子浓度、酸碱平衡和水分平衡等。
这可以通过细胞内的离子通道和转运蛋白来实现，调节离子的进出和维持正常的细胞内环境。
以上是细胞复苏的基本过程，不同类型的细胞和受损程度可能会有所不同。
细胞复苏的过程是复杂而精细的，需要多个细胞内和细胞间的相互作用来实现细胞的恢复和修复。
细胞复苏的操作方法有
细胞复苏的操作方法有
细胞复苏是一种实验室技术，用于使脱水、冷冻或干燥的生物样本重新恢复到活动状态。
以下是常用的细胞复苏操作方法：
1. 退火复苏法：将冷冻或干燥的细胞样本迅速放入含有保护性溶液或培养基的温暖环境中，使样本迅速恢复到正常温度。
这样可以防止细胞膜的破裂和细胞器的失活。
2. 液相复苏法：将冷冻样本悬浮在适当的培养基中，并在适当的温度和营养条件下培养恢复。
这种方法适用于以液体形式保存的细胞样本。
3. 干燥复苏法：将干燥的样本暴露在湿润的环境中，使其重新吸湿，并注入适当的培养基中进行培养。
这种方法适用于以干燥形式保存的细胞样本。
4. 渐进复苏法：渐进地增加冷冻样本的温度或湿度，以避免温度和压力的突变对细胞造成伤害。
这种方法适用于非常敏感的细胞。
5. 化学复苏法：使用化学物质或添加剂来促进细胞复苏，如聚乙二醇（PEG）或DMSO等。
这些化学物质可以提供保护性的作用，促进细胞膜的再生和细胞器的活性恢复。
需要注意的是，细胞复苏的操作方法可能因细胞类型、保存条件和实验目的等因
素而有所不同。
在进行细胞复苏实验前，建议查阅相关文献，了解适合您实验条件的最佳方法。
否则，可以咨询专业的实验室人员或领域专家，以获得更准确的指导和建议。
细胞复苏步骤和注意事项
细胞复苏步骤和注意事项
细胞复苏步骤与注意事项
细胞复苏是一种常用的技术，它能够重现细胞衰老和逆转部分死亡细胞状态，
从而使细胞可持续繁殖。
随着科技的进步，细胞复苏技术越来越受到重视，在许多生物研究中发挥着重要作用，因而也引起了广泛的关注。
基本的细胞复苏步骤：
（1）首先需要准备适当的文献和材料，并准备必要的实验仪器和设备；
（2）根据实验需要，从文献中收集和研究细胞恢复需要考虑的因素以及恢复过程
中可能产生的影响；
（3）绘制实验方案，以确定实验操作步骤；
（4）使用采集到的实验材料，在实验室中进行实验，按照设计的步骤进行细胞恢复；
（5）观察细胞复苏的结果，收集有用的数据，并使用相应的统计学方法进行分析；（6）根据实验结果作出建议，将细胞复苏结果应用到其他实验中；
（7）清理实验室，归还实验器材。
在细胞复苏过程中，必须遵守以下几项重要的注意事项：
（1）严格控制实验环境，确保细胞能够在适当的温度、湿度、PH值和光照条
件下正常活动；
（2）细胞恢复时，必须严格控制使用媒介的成分，细胞应处于其最适宜的环境中；（3）实验中应密切关注细胞的生长行为，以防细胞活力不足或出现异常反应；（4）细胞复苏过程中应注意动物实验的实施程序，避免实验过程中动物受到不良
影响；
（5）注意不同类型的细胞之间存在的差异，应根据细胞的特性，制定适合本型细
胞的实验操作步骤；
（6）细胞恢复实验有关的仪器和器材应注意保持清洁，同时务必保存实验记录，
以备以后参考；
（7）实验结束后，应行为有序，收好实验器材，并将实验记录收集整理，以备下
次使用。
细胞复苏是一种繁琐的技术。
细胞复苏的步骤
细胞复苏的步骤细胞复苏是指将处于休眠或低代谢状态的细胞恢复为正常的生长状态，通常是通过给细胞提供合适的营养和环境条件来实现的。
下面介绍细胞复苏的基本步骤：第一步：选择适当的培养基和条件在进行细胞复苏之前，需要选择适当的培养基和条件。
常用的培养基包括DMEM、RPMI-1640、MEM等，具体选择根据细胞种类而定。
在培养基中加入合适的血清、生长因子和抗生素等可以提高细胞复苏的成功率。
在培养条件方面，温度、湿度、CO2浓度等都需要根据不同的细胞进行调整。
一般情况下，细胞需要在37℃、5% CO2、95%湿度的环境下培养。
第二步：解冻和种植细胞将冻存的细胞取出后，迅速将管子放入37℃的水浴中，使细胞迅速解冻。
解冻后将细胞转移到预先准备好的培养基中，轻轻摇动管子使细胞均匀分散在培养基中。
第三步：细胞的适应期细胞解冻后需要一个适应期来逐渐适应培养条件。
在这个阶段，应该尽可能地减少不必要的干扰，避免频繁移动细胞和更换培养基等操作。
适应期的时间根据细胞的不同而有所不同，一般为1-3天。
第四步：细胞的培养和传代适应期结束后，可以开始正式地进行细胞培养和传代。
细胞在培养基中生长分裂，达到一定程度后可以进行传代。
传代过程中需要观察细胞的生长情况，及时更换新的培养基，以保持细胞的生长状态。
第五步：检测细胞是否恢复正常经过一段时间的培养，需要检验细胞是否已经恢复正常的生长状态。
常用的方法包括细胞计数、免疫荧光检测、PCR 等。
如果细胞已经恢复正常，则可以进一步进行细胞实验或研究。
总结细胞复苏是细胞培养中的一项基本技术，需要选择合适的培养基和条件来实现。
在实际操作中，需要注意解冻的速度和方法、适应期的时间、细胞的培养和传代等细节问题。
熟练掌握细胞复苏技术，对于细胞培养和相关研究具有重要的意义。
简述细胞复苏流程与注意事项
简述细胞复苏流程与注意事项
细胞复苏流程：
1、将冻存的细胞从液氮罐中取出，立即放入37°C的水浴中进行融化，轻柔晃动，加速融化，直到小瓶中只剩下一小块冰，时长应控制在1min 中；
2、用70%乙醇擦拭瓶外后转移无菌操作台中，打开瓶盖前，用酒精灯火焰对瓶口进行消毒；
3、将预加热的新鲜完全培养基滴入小瓶中。
缓慢用移液枪吸取瓶中液体至15ml离心管中，加入适量浓度和体积的完全培养基，轻柔混合均匀；
4、200 ×g左右细胞悬浮液离心5-10分钟。
实际的离心速度和持续时间因细胞类型而异。
弃掉上清，加入新鲜完全培养基重悬细胞，并将其转移到适当的培养容器和推荐的培养环境中。
注意事项：
1、液氮温度低，小心低温对人造成的伤害，在液相中储存的冷冻瓶在解冻时存在爆炸的风险，因此，取出冻存管的时候，要做好个人防护。
2、通常细胞集中储藏在液氮中，取出时应迅速，避免温差对其他冻存
细胞造成影响。
3、复苏细胞的核心技术，简而言之就是快融，将在37°C水浴中快速解冻冷冻细胞(< 1分钟。
4、解冻时，冻存管先放入无菌一次性PE手套中，再放入水中融化，避免污染也方便操作。
5、用预热过的培养基慢慢稀释解冻的细胞。
6、解冻细胞后，在培养皿中培养时，应尽量维持高密度，以提高细胞存活率。
7、注意无菌操作，避免细胞发生污染。
细胞复苏
细胞复苏步骤（以215为例）
1、从液氮罐中取出一支215细胞冻存管，放到37℃迅速溶解；
2、取一支50ml离心管，往其中加入适量的215细胞培养基（约30ml），将溶解的细胞加
到培养基中混匀；
3、离心800rmp，5min；
4、弃上清，打散细胞，再加入215培养基重悬细胞（约12ml），轻轻混匀后转移到培养瓶
中培养（注意不要产生气泡）；
5、镜下观察细胞状态，放入孵箱中培养，第二天换液。
（以后以1:3的比例传代）
PBMC的复苏
实验前准备的东西：水浴锅调到37℃，冰水、离心管架置入超净台紫外线照射半小时；R20、R10。
1、从液氮罐中取出一支215细胞冻存管，放到37℃迅速溶解；
2、取一支50ml离心管，将复苏细胞转移到50ml离心管中，边加入R20边摇，由慢到快，
开始一滴一滴地加，加到大约3ml可加快速度至每次0.5ml，R20加到7.5ml后开始加R10 7.5ml；
3、离心1800rmp，5min；
4、弃上清，打散细胞，加入1640培养基重悬。
细胞冻存
1、培养好的细胞用胰酶消化，再用培养基终止消化并重悬细胞，将细胞转移至15mL离心
管中离心，1000rpm，5min；
2、弃上清，加冻存液，用吸管轻轻吹打均匀，在分装到冻存管中，每管1mL，做好标记。
冻存液的配制：FBS（胎牛血清）：DMSO=9:1，一般75c㎡培养瓶长满有12×10^6个细胞，25 c㎡培养瓶长满有4×10^6个细胞，冻存最适细胞密度为5-8×10^6个/mL；
3、将冻存管置入4℃30min—﹣20℃40min—﹣80℃过夜—最后移到液氮罐长期保存。
细胞复苏及培养实验方法
细胞复苏及培养实验方法
一、准备细胞复苏所需物品
1.离心管
2.细胞计数板
3.移液管
4.细胞培养瓶
5.细胞冻存管
6.液氮
7.37℃水浴
8.培养基
9.血清
10.抗生素
二、细胞复苏步骤
1.从液氮中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中快速复苏。
2.待细胞冻存管外表面融化后，打开管盖，用移液管吸出细胞悬液，放入离心管中。
3.将离心管中的细胞悬液以适当的转速和时间离心，去除上清液。
4.离心后，用含有一定比例血清和抗生素的培养基重悬细胞，制成细胞悬液。
5.将细胞悬液均匀分装到细胞培养瓶中，放入培养箱中进行培养。
三、细胞培养步骤
1.将细胞培养瓶放入培养箱中进行培养，保持适宜的温度和湿度。
2.根据需要更换培养基，保持细胞生长所需的营养和生长因子。
3.根据细胞的生长情况，适时进行传代培养，保持细胞的生长活力和数量。
4.在培养过程中进行必要的细胞鉴定和表型检测，确保细胞质量和实验结果
的可靠性。
5.记录细胞的生长情况、传代次数和鉴定结果等信息，建立完整的细胞系档案。
注意事项：
1.在操作过程中要保持无菌操作，避免污染。
2.根据不同的细胞类型和实验需求，选择适宜的培养基、血清和生长因子。
3.定期检查细胞的形态、生长情况和传代情况，及时发现异常并进行处理。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作，可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。
细胞的原代培养和传代培养以及细胞冻存和复苏后都需要细胞计数。
一、细胞冷冻保存1、材料：生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO (Sigma D-2650) 、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020) 、0.4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061) 、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)2、冷冻保存方法：⑴传统方法：冷存管置于4 °C 10分钟--->-20 °C 30分钟--->-80 °C 16〜18小时(或隔夜)---> 液氮槽vaporphase 长期储存。
-20 C不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80 C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
⑵程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1〜-3 C /分钟之速度由室温降至(-80 C以下)-120 C,再放在液氮槽vaporphase 长期储存。
适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。
3、步骤：(1) 冷冻前24-48 小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。
(2) 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜(DMSO) 至20% 浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。
(3) 离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。
(4) 取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液(DMSO 最后浓度为5〜10%)，使细胞浓度为1〜5 x106cells/ml ，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1〜2ml/vial ，并取少量细胞悬浮液作污染检测。
严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。
然后进行冻存。
4、注意事项：(1) 欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80 ~90%致密度。
冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
(2) 细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力;在-70 度可保存数月。
(3) 注意冷冻保护剂之品质。
DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5〜10ml小体积分装，4 C避光保存，勿作多次解冻。
Glyce⑹亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。
在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。
本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO 直接加入时释放的热量对细胞的损伤。
缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。
DMSO 可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。
(4) 冷冻保存之细胞浓度：①normal human fibroblast:1 〜3 X106cells/ml②hybridoma:1 〜3 X106cells/ml ，细胞浓度不要太高，某些hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后死去。
③adherent tumor lines:5 ~7 X106，依细胞种类而异。
Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需 1 〜3 X106cells/ml④other suspensions:5 〜10 X106cells/ml ，human lymphocyte 须至少 5 X106cells/ml 。
(5) 冷冻保护剂浓度为5 或10%DMSO ，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backupculture ，以防止冷冻失败。
(6) 冻存可用10%〜90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积(4度时)，复苏存活率在80%〜90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。
二、冷冻细胞活化1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。
2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。
3、材料37 C恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器4、步骤：(1) 操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。
(2) 自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。
(3) 将新鲜培养基置于37 C水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。
(4) 取出冷冻管，立即放入37 C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。
(5) 取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10〜1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。
取0.1ml 解冻细胞悬浮液作存活测试。
(6) 解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO 或glycerol) ，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。
惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml 培养基之离心管内，离心1000rpm ，5 分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。
(7) 若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。
三、细胞计数与存活测试1 、原理：(1) 计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter 粒子计数器自动计数。
(2) 血球计数盘一般有二个chambers ，每个chamber 中细刻9 个1mm2 大正方形，其中4 个角落之正方形再细刻16 个小格，深度均为0.1mm 。
当chamber 上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2x0.1mm=1.0x10-4ml 。
使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml 中之细胞数目。
(3) 存活测试之步骤为dyeexclusion ，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。
一般使用蓝色之trypan blue 染料，如果细胞不易吸收trypan blue ，则用红色之Erythrosin bluish 。
计算细胞活率：活细胞数/(活细胞数+死细胞数)X100%。
计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。
2、材料：0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061);Erythosin bluish stain; 取0.1gram Erythrosinbluish(SigmaE-9259) 及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647) 溶于100mlCa++/Mg++freesaline; 血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip); 计数器(counter); 低倍倒立显微镜;粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics) 。
白细胞稀释液(4% 乙酸溶液)。
3、步骤：(1) 取50讪细胞悬浮液与50讪trypan blue(orErythrosinbluish) 等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。
(2) 取少许混合液(约15讪)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish) 。
(3) 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue 等体积混合)，最后乘以104 ，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。
若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
注：4大格细胞总数x稀释倍数x 104/4=细胞数/ml;每一大格的体积=0.1cm x o.lcm x0.01cm=10-4ml 计数板计数时，最适浓度为5〜10 X105细胞/ml，此范围外计数误差偏大。
高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。
5、范例：T75 monolayer culture 制成10ml 细胞悬浮液，取0.1ml 溶液与0.1ml trypan blue 混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。
活细胞数/方格：55，62，49，59;死细胞数/方格：5，3，4，6;细胞总数=243 平均细胞数/方格=60.75; 稀释倍数=2;细胞数/ml : 60.75 X104 X2(稀释倍数)=1.22 X106;细胞数/flask(10ml) : 1.22 X106 x i0ml=12.2 X106 存活率：225/243 = 92.6%在细胞复苏过程中经历多次复苏失败，最终在查阅了相关技术积累了足够的复苏技能后复苏成功，上述是个人总结的细胞冻存复苏及细胞计数的操作程序和注意事项，望能为各位同学提供些参考。