肿瘤细胞培养方法和培养基
人肿瘤细胞培养的原理
人肿瘤细胞培养的原理人肿瘤细胞培养是指将来自人体中的肿瘤组织或细胞分离、培养和保存的过程。
这种细胞培养技术不仅在医学研究领域具有重要意义，也被广泛地应用于药物筛选、毒性测试及疾病模型的构建等领域。
人肿瘤细胞培养的原理主要包括以下几个方面：1. 肿瘤细胞的分离和培养基的选择：首先从人体肿瘤组织中获得细胞，通常采用手术、活检或穿刺等方法取得。
然后将组织样本经过切碎、消化酶处理等步骤，使其中的细胞得以分离。
根据所选细胞类型的不同，可以选择适当的培养基来维持细胞的生长、增殖和功能维持。
常用的培养基包括DMEM （Dulbecco's Modified Eagle Medium，杜尔贝科修正鹰鳝培养基）、RPMI 1640（Roswell Park Memorial Institute 1640）、F12（Ham's F-12鹰鳝培养基）等。
2. 细胞的传代：肿瘤细胞培养的过程中，细胞会经过一系列的传代过程。
一般情况下，初始细胞数较少的细胞会在培养基中进行扩增，达到一定的细胞数量后，需要进行传代。
传代是将已经增殖的细胞在一个新的培养器中继续培养的过程。
传代过程需要注意，细胞的数目、培养基的成分和细胞培养器的选择等因素都会影响细胞的传代效果。
3. 培养条件的优化：为了使肿瘤细胞在体外更好地生长和繁殖，需要优化培养条件。
这包括培养基的配方、温度、pH值、气体组成等因素的调整。
培养基中通常会添加适当的营养物质，如氨基酸、脂类、维生素和微量元素等，以满足细胞的生长需求。
同时，细胞培养过程中需要保持适当的温度和湿度，通常将温度维持在37，湿度维持在95％以上。
还需要提供合适的气体环境，如5％CO2 /空气混合体，以维持细胞生长所需要的适宜pH值。
4. 检测细胞的纯度和活力：细胞培养过程中，需要定期检测细胞的纯度和活力。
细胞的纯度是指细胞中肿瘤细胞的比例，可以通过免疫细胞化学、流式细胞术等方法进行检测。
肿瘤细胞培养方法和培养基
肝癌细胞培养一、培养基1、RPMI-1640+ 10%胎牛血清培养基2、DMEM+ 15%胎牛血清培养基成分表二、实验前准备工作:操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用酒精消毒。
用紫外线消毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿。
进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min 进行消毒。
紫外线照射60min可以消灭空气中大部分细菌。
1、玻璃器皿的清洗灭菌（5％盐酸溶液、重鉻酸钾120ml、硫酸200ml、蒸馏水200ml）：（1）浸泡:新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。
以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。
（2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。
刷洗后经行烘干。
（3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。
将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。
清洁液具有极强酸蚀作用，操作过程需戴防护用具。
（4）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次，将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。
（5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。
包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。
2、橡胶制品清洗消毒：0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用3、塑料制品的清洗消毒（瓶盖、离心管）：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。
肿瘤的细胞培养实验研究
肿瘤的细胞培养实验研究引言：细胞培养实验是现代生物医学研究中不可或缺的实验手段之一，它为了研究和分析生物体的细胞行为和生理过程提供了一种可控、可重复的实验环境。
在肿瘤方面，细胞培养实验可以帮助科研人员更深入地了解肿瘤细胞的生长、分化、生理功能以及药物对肿瘤细胞的影响。
本文将介绍肿瘤的细胞培养实验研究的基本过程、方法和应用。
一、肿瘤细胞培养实验的基本过程肿瘤细胞培养实验的基本过程主要包括细胞的收集、传代培养、细胞的鉴定和使用。
1.细胞的收集：肿瘤细胞可以通过肿瘤组织切片、原发培养物或小鼠移植瘤等方式收集。
为了避免细胞外污染，收集的过程需要在无菌条件下进行。
2.传代培养：收集到的肿瘤细胞需要在适当的培养基中进行传代培养，以保证细胞的生长和繁殖。
培养基中通常含有人工合成的营养物、生长因子和其他必需的成分。
3.细胞的鉴定：细胞的鉴定通常包括细胞学形态学观察、免疫细胞化学染色和细胞分子学鉴定等。
这些方法可以帮助科研人员确认培养的细胞是否为肿瘤细胞。
4.使用肿瘤细胞：经过鉴定的肿瘤细胞可以用于研究肿瘤发生机制、药物筛选、肿瘤模型制备以及其他科学研究。
二、肿瘤细胞培养实验的方法在肿瘤细胞培养实验中，常用的方法包括传统的贴壁培养法和悬浮培养法。
1.贴壁培养法：贴壁培养是最常见和最简单的肿瘤细胞培养方法。
在此方法中，肿瘤细胞会附着到培养皿的底部，并在培养基中生长繁殖。
这种方法适用于肿瘤细胞具有附着性的类型，如肺癌细胞、结肠癌细胞等。
2.悬浮培养法：悬浮培养法适用于肿瘤细胞具有悬浮生长的类型，如白血病细胞、淋巴瘤细胞等。
在此方法中，肿瘤细胞会悬浮在培养基中，并通过摇床等设备进行培养。
三、肿瘤细胞培养实验的应用肿瘤细胞培养实验在肿瘤研究中有着广泛的应用。
以下是其中的几个方面：1.研究肿瘤发生机制：通过细胞培养实验，科研人员可以对肿瘤细胞进行生长、增殖、分化、凋亡等方面的研究，从而深入了解肿瘤发生的机制。
2.筛选抗肿瘤药物：通过细胞培养实验，科研人员可以在体外模拟人体内的环境，研究不同药物对肿瘤细胞的毒性和治疗效果，从而筛选出潜在的抗肿瘤药物。
肿瘤干细胞培养条件与方法
肿瘤干细胞培养条件与方法
肿瘤干细胞培养条件和方法可能因不同的肿瘤类型和研究目的而有所差异。
以下是一般的肿瘤干细胞培养条件和方法的概述：
1. 肿瘤组织获取：从患者或动物模型中获取肿瘤组织样本。
2. 肿瘤细胞分离：使用适当的方法，如酶消化或机械破碎，将肿瘤组织分离成单个细胞。
3. 细胞筛选：通过特定的标志物或功能特性，如表面标志物表达、干细胞特性等，筛选出肿瘤干细胞。
4. 培养条件：肿瘤干细胞通常需要特殊的培养条件，如无血清或低血清培养基、特定的生长因子和细胞因子、合适的气体环境等。
5. 细胞培养：将筛选出的肿瘤干细胞接种到培养容器中，并提供适当的培养条件，包括温度、湿度、气体环境等。
6. 监测和鉴定：定期观察肿瘤干细胞的生长情况、形态和功能特性，通过免疫荧光染色、流式细胞术等技术鉴定其干细胞特性。
需要强调的是，肿瘤干细胞的培养和研究是一个复杂的领域，需要专业的技术和设备。
常用肿瘤细胞株的培养
常用肿瘤细胞株的培养常用肿瘤细胞株的培养是细胞试验室的日常工作之一，常用的肿瘤细胞株无数，各试验室所用法和保存的细胞株种类各异，培养的办法和习惯也不尽相同。
本节介绍了五种常用的肿瘤细胞株的培养和复苏、冻存的办法。
一、乳腺癌细胞株的培养乳腺癌细胞系的种类无数，而且功能各异，下面介绍几种常用的乳腺癌细胞系的培养的办法。
（一）MCF 一细胞株的培养 MCF-7是一种易于培养的人乳腺癌细胞，来源于乳腺腺癌组织，贴壁生长，形态不规章。
普通培养基采纳DMEM，含10％的。
贴壁生长后，2～3天即可传代。
【材料】 1．冻存的MCF-7细胞株。
2．培养基（DMEM）含10％、含EDTA终浓度为0.25％的,75％。
3．培养瓶、无菌的玻璃吸管或自立包装的塑料吸管、离心管。
【办法】 1．培养细胞的换液 (1)预备好超净工作台，将试剂及材料用75％杀菌后置于超净台，开头试验。
(2）从孵箱中取出培养瓶首先要认真观看培养基有无污染或衰退迹象。
(3)观看培养．基的pH和细胞密度及浓度，如培养基从红色变成橙色，或变成黄色，解释培养基的pH已变酸，需要更换培养基；如培养基从红变为紫色，解释培养基的pH已变碱，可能细胞已死亡，需拣出丢弃。
(4）将细胞培养瓶置于无菌工作区域，无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。
(5）用PBS反复冲洗细胞2～3遍，细胞培养条件要求苛刻的，可用细胞培养液冲洗细胞。
(6)加入预热的培养基，倒置显微镜下观看，放入培养箱中培养。
2．细胞的传代 (1)预备超净工作台，将试剂及材料用75％杀菌后置于超净台，开头试验。
(2)认真检查培养基DMEM有无污染或衰退迹象。
(3)在镜下观看MCF-7细胞是否需要传代（主要看细胞密度是否长至彼此汇集，铺满培养瓶即可传代），若需要传代，举行如下操作。
(4）将MCF-7细胞置于超净台无菌工作区中，弃去原培养基。
(5)加入无血清培养液并轻轻晃动培养瓶，用培养液清洗细胞，然后弃去清洗液。
肿瘤干细胞实验方法
肿瘤干细胞实验方法肿瘤干细胞是一种新型细胞，具有自我更新，自我修复，多向分化和肿瘤形成的潜能。
它们在肿瘤的形成、发展和复发过程中扮演着重要的角色，因此对肿瘤干细胞的实验研究具有重要的意义。
本文将介绍肿瘤干细胞实验的基本方法。
1. 肿瘤干细胞培养肿瘤干细胞可通过单细胞克隆形成球体的方式进行培养，这种方法又被称为肿瘤球体培养。
其步骤如下：1) 确定肿瘤细胞株中的肿瘤干细胞含量。
2) 将肿瘤细胞株悬浮在无血清培养基中，添加必须的生长因子如EGF和FGF等，使其形成肿瘤球体。
3) 观察肿瘤球体的形成和生长情况，并进行维持和分离。
肿瘤球体与普通二维培养方式相比，具有较高的肿瘤干细胞含量，并具有良好的体外模拟肿瘤生长和浸润的特性。
此外，肿瘤球体可直接用于药物筛选和肿瘤干细胞信号机制的研究。
肿瘤干细胞的鉴定是肿瘤干细胞研究的重要环节。
主要通过以下两种方法进行：1) 流式细胞术通过肿瘤干细胞表面标志物表达的差异，通过流式细胞仪的分析来鉴定和筛选肿瘤干细胞。
常用的肿瘤干细胞表面标志物有CD133、CD44、CD24和ESA等。
2) 功能性鉴定法此方法是通过肿瘤干细胞的自我更新和多向分化的特性来进行鉴定。
肿瘤干细胞应该具有自我更新的能力，同时还具有多向分化的潜能，可以分化成多种类型的细胞。
通过上述方法鉴定出的肿瘤干细胞，需要进一步进行分选。
常用的方法有磁珠分选、流式细胞术和细胞筛等。
磁珠分选法是利用与表面标志物相关的磁珠对肿瘤干细胞进行筛选和富集。
流式细胞术，是利用表面标志物和细胞生物学特性进行筛选和富集。
细胞筛法是根据肿瘤干细胞的体积和生长特性进行富集。
4. 肿瘤干细胞治疗效果评价1) 体内治疗将肿瘤干细胞或肿瘤球体种植到动物体内，并进行药物治疗，以评价药物对于肿瘤干细胞的杀伤效果。
例如, 免疫缺陷小鼠移植瘤模型。
2) 体外药物筛选3) 分子生物学方法通过单细胞的特异性PCR和实时荧光PCR等分子生物学方法，检测肿瘤干细胞相对于肿瘤非干细胞的基因差异，从而评价治疗效果。
ctc培养方法
ctc培养方法CTC培养方法CTC（循环肿瘤细胞）是指从肿瘤组织或肿瘤患者的外周血中检测到的脱落的肿瘤细胞。
CTC的检测和分离是目前肿瘤临床诊断和治疗中的热点研究方向之一。
下面将介绍一种常用的CTC培养方法。
一、细胞准备在进行CTC培养之前，需要从肿瘤患者的外周血中分离出CTC。
首先，采集患者的外周血样本，并利用血液分离管或密度梯度离心法将血液分离为上清液和红细胞沉淀。
然后，使用CTC捕获技术，如磁珠捕获、细胞过滤或微流控芯片等方法，将CTC从上清液中富集出来。
最后，使用显微镜或流式细胞术确认CTC的存在并计数。
二、细胞培养基准备为了成功培养CTC，需要准备适用的细胞培养基。
常用的细胞培养基包括DMEM、RPMI-1640等。
在培养基中加入适当浓度的胎牛血清、抗生素和生长因子，以提供细胞所需的营养物质和生长环境。
三、细胞培养条件将分离出的CTC转移到预先准备好的细胞培养基中。
将细胞培养皿置于恒温培养箱中，保持适宜的温度（通常为37℃）。
此外，还需提供适当的CO2气体环境以维持细胞的酸碱平衡。
四、细胞培养监测在CTC培养的过程中，需要定期观察和监测细胞的生长情况。
使用显微镜观察细胞的形态和数量，并记录相关数据。
此外，还可以通过免疫组化染色、蛋白质检测等方法，对CTC的特征和功能进行进一步分析。
五、细胞培养维持为了维持CTC的生长和增殖，需要定期更换培养基，以提供新鲜的营养物质。
同时，还需注意细胞密度的控制，避免细胞过度生长或过度稀释。
此外，还需注意细胞的传代问题，及时进行细胞的传代以保持CTC的活性和稳定性。
六、细胞培养应用通过CTC的培养，可以进一步研究肿瘤细胞的生物学特性、耐药机制和转移能力等。
此外，还可以利用培养的CTC进行药物敏感性测试，评估不同药物对肿瘤细胞的作用效果，为个体化治疗提供参考依据。
CTC培养是一种重要的肿瘤研究方法，通过适当的细胞准备、细胞培养基准备和培养条件控制，可以成功培养出CTC，并利用其进行肿瘤研究和个体化治疗的相关应用。
肿瘤细胞培养
肿瘤细胞培养肿瘤细胞培养是一种对肿瘤细胞进行体外增殖和研究的重要方法。
它不仅有助于我们更好地理解肿瘤的发生机制，还为肿瘤的诊断和治疗提供了有力的工具。
本文将介绍肿瘤细胞培养的基本原理、方法和应用。
一、肿瘤细胞培养的基本原理肿瘤细胞培养的基本原理是利用体外培养条件模拟体内微环境，提供细胞生长所需的营养物质、培养基和合适的温度、pH值等因素，使肿瘤细胞在培养皿中快速增殖。
培养的肿瘤细胞可以源自原发肿瘤组织、转移灶或肿瘤细胞系，通过适当的培养条件，能够在体外长期维持其生物学特性。
二、肿瘤细胞培养的方法1. 细胞来源选择肿瘤细胞培养的最初步骤是选择合适的细胞来源。
可以从患者的原发肿瘤组织或转移灶中分离细胞，也可以使用已建立的肿瘤细胞系。
选择适宜的细胞来源是确保实验结果准确性的关键。
2. 细胞分离和传代细胞分离是将肿瘤组织或培养皿中的细胞分离出来，常用的方法有胰蛋白酶消化、机械切割等。
分离的细胞可以根据需要进行一定次数的传代，以延长细胞的寿命并获得足够的细胞数量。
3. 细胞培养条件细胞培养条件是保证肿瘤细胞在体外生长和繁殖的关键。
首先是选择适宜的培养基，其中包含维持细胞生长所需的营养物质、生长因子和抗生素等。
此外，还需要控制培养温度、CO2浓度和pH值等条件，模拟体内环境。
4. 细胞检测和鉴定培养的肿瘤细胞需要进行鉴定，以确保其纯度和稳定性。
常用的方法有细胞形态观察、免疫组织化学染色、流式细胞术等。
鉴定后的细胞可以用于进一步的实验研究。
三、肿瘤细胞培养的应用1. 药物筛选和耐药性研究肿瘤细胞培养可以用于药物筛选，通过观察不同药物对细胞的影响，筛选出对某种类型的肿瘤细胞有特异性杀伤作用的药物。
此外，肿瘤细胞培养还可以用于研究耐药性的机制和逆转耐药的方法。
2. 基因功能研究通过转染技术将特定基因靶向敲除或过表达到肿瘤细胞中，可以研究基因在肿瘤发生发展中的功能，并探索潜在的靶向治疗策略。
肿瘤细胞培养为基因功能研究提供了良好的实验材料。
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肝癌細胞培養一、培養基
1、RPMI-1640+ 10%
胎牛血清培養基
2、DMEM+ 15%胎牛血清培養基
成分表
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二、實驗前準備工作:
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操作者的皮膚、培養瓶的蓋和外壁常用酒精消毒。
用紫外線
消毒實驗室空氣、工作臺面和一些不能使用其他方法消毒的培養器皿。
進無菌室前或做完實驗后，均應開燈照射30min 進行消毒。
紫外線照射60min可以消滅空氣中大部分細菌。
1、玻璃器皿的清洗滅菌（5％鹽酸溶液、重鉻酸鉀120ml、硫酸200ml、蒸餾水200ml）：
（1）浸泡:新使用或重復使用的玻璃器皿須經5％鹽酸溶液或自來水浸泡過夜或煮沸30min，水洗。
以去除新購進玻璃器皿所帶有灰塵、鉛、砷等物質，并消除其弱堿性。
（2）刷洗:浸泡后用軟毛刷和優質的洗潔精進行刷洗。
刷洗后經行烘干。
（3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前須適當晾干或烘干，以免造成酸浸液稀釋，影響效果。
將玻璃制品完全浸泡入清潔液中24h。
清潔液具有極強酸蝕作用，操作過程需戴防護用具。
（4）沖洗、烘干備用:浸酸后的玻璃器皿先用自來水充分沖洗，吸管需沖洗10min，器皿需每瓶灌滿自來水、倒掉反復
10次以上，不留任何酸浸液殘跡，然后用蒸餾水漂洗2～3
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次，將清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干凈透明，無油煙，不能殘留任何有害物質及化學藥品等。
（5）包裝滅菌:器材經清洗烤干或晾干后，先應嚴格包裝，然后再行消毒滅菌處理，以防止消毒滅菌后再次遭受污染。
包裝材料常用包裝紙、牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、玻璃或金屬制吸管筒、紙繩等。
2、橡膠制品清洗消毒：
0.5mol/L NaOH煮沸15分鐘，流水沖洗，0.5mol/L HCl煮沸15分鐘，流水沖洗，自來水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘，50℃烤干備用
3、塑料制品的清洗消毒（瓶蓋、離心管）：
使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來水過夜，用紗布或棉簽和50℃清洗液刷洗，流水沖洗，晾干，浸于清潔液15分鐘，流水沖洗（15－20遍）,蒸餾水浸洗三次，雙蒸水泡24小時，晾干備用。
三、細胞復蘇：
凍存細胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必
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須快速冷凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害，致使細胞死亡。
在凍存細胞的保存管中含有對細胞有毒害的成分DMSO,故在解凍應馬上將其去除。
在冷凍活化前應在無菌臺上將細胞培養液配好，然后將保存管從液氮中取出，放于37℃的溫水中快速使細胞解凍。
解凍后懸液快速移入培養液中混勻，離心去掉上清液，再加入細胞培養液。
實驗人員穿上無菌實驗室操作服用酒精噴于手上消毒，然后就位用酒精棉球擦拭實驗臺
（1）取一15ml離心管用滴管在其內滴加5--9ml培養液（取8ml）。
（2）從液氮罐中取出凍存管，并迅速放入37℃水浴，不時搖動，使其急速融化，30～60s內完成。
（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細胞懸液轉移入上述離心管中（用培養基把凍存管洗一遍，把粘在壁上的細胞都洗下來）。
（4）低速離心(1000r／min) 5min，去上清后再用8ml培養液再清洗離心一次。
（5）離心后倒掉上清液，在離心管中滴加3ml培養液
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（RPMI-1640），混勻（可用滴管輕柔吹打）。
（6）將離心管中的混合液轉移到培養瓶中，并在培養瓶中滴加15滴10%小牛血清，蓋上瓶蓋，標好細胞種類和日期、培養人姓名等，將培養瓶平放，置于37°C培養箱中培養。
2-3天換一次培養基。
四、細胞傳代：
當觀察到培養瓶中細胞鋪滿度為90%時（細胞生長處于對數期時），解凍復活成功后的細胞要進行分離培養，否則細胞會因生存空間不足或密度過大，營養障礙，影響細胞生長。
細胞由原培養瓶內分離稀釋后傳到新的培養瓶中培養的過
程稱之為傳代培養。
傳代細胞細胞株的最大利處在于提供了大量持久的實驗材料，便于實驗。
（1）試驗臺的消毒工作準備好，棄去舊培養液，用PBS液（不含鈣，鎂離子）洗1-2次，以免剩余培養液影響胰蛋白酶活性。
（細胞貼壁生長）。
（2）向瓶內加入1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mEDTA），置于37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進行消化，1--3min后
把培養瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察，當發現胞質回縮、細
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胞間隙增大后，應立即中止消化（將培養瓶翻轉過來，以保證細胞沒有脫壁）。
備注：若細胞沒有脫壁，生長良好，則直接倒掉消化液，加培養液8ml，離心收集細胞；若發現很多細胞已解離已脫壁（即解離過度），則直接加培養液進行離心收集細胞。
（4）倒出消化液，向瓶內用滴管加入培養液少量（約2ml），輕輕轉動培養瓶，把殘留胰蛋白液消化液沖掉，然后再加3ml 培養液+15滴小牛血清。
（5）使用吸管，吸取瓶內培養液，按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。
吹打時動作要輕柔，以防用力過猛損傷細胞。
（6）將準備好的細胞懸液轉入離心管中，離心(1000r／min) 5min。
（7）將離心后離心管中液體倒掉，在離心管中加入3ml培養液，并反復吹打細胞，制成細胞懸液。
（8）取3個無菌培養瓶，酒精棉球擦拭消毒，并在酒精燈下過火消毒。
（9）在培養瓶中各加入1ml細胞懸液、2ml培養液（用移液
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槍）、15滴小牛血清，加好后酒精燈下過火加塞。
（10）細胞培養換液時間應根據細胞生長的狀態和實驗要求來確定。
一般2～3d后應換一次生長液。
待細胞鋪滿器皿底面，即可使用；也可繼續傳代擴大培養或換成維持液。
五、細胞凍存：
細胞的凍存最常用的方法是液氮冷凍保存法，主要是加入適量的保護劑緩慢的冷凍細胞。
由于細胞在不加任何保護劑的情況下，細胞內外水分會很快結成冰晶，從而引起一系列不良反應。
如細胞脫水使局部電解質濃度升高，PH值改變，部分蛋白質因此變性使細胞內部結構紊亂，溶酶體膜被破壞而放出大量酶將細胞內部結構破壞。
因此在細胞凍存時的關鍵是盡可能減少細胞內水分，減少細胞內冰晶的形成，故凍存時采用甘油或DMSO做保護劑，這兩種物質分子量較小，溶解度大，易穿透細胞，可使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，對細胞毒害作用小，梯度慢速冷凍可使細胞內水分滲出細胞外，減少形成冰晶對細胞產生的傷害。
細胞低溫凍存是培養室常規工作和通用技術。
細胞凍存在-196℃液氮中，
儲存時間幾乎是無限的。
細胞凍存及復蘇的原則是慢凍快
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融。
（1）選對數增生期細胞(細胞鋪滿度為90%左右時)，在凍存前1d換液。
（2）試驗臺的消毒工作準備好，倒掉培養瓶內舊培養液。
（3）向瓶內加入1ml 0.25%胰蛋白酶液，以能覆蓋培養瓶底為宜。
（4）置37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進行消化，1--3min 后把培養瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察，當發現胞質回縮、細胞間隙增大后，應立即中止消化。
（5）吸出消化液，在吸除胰蛋白液后，直接加入3ml培養液+15滴小牛血清，終止消化。
（6）使用彎頭吸管，吸取瓶內培養液，按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。
吹打時動作要輕柔，以防用力過猛損傷細胞，按常規方法把培養細胞制備成懸液。
（7）將培養瓶中的細胞懸液轉移到15ml離心管中，(1200r ／min) 6min，去掉上清液。
再加3ml培養液按常規方法形
成細胞懸液。
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（8）配制凍存培養液（培養液7ml，10%小牛血清2ml，10%DMSO 1ml），于離心管中加入1ml細胞懸液，加入適量配制好的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻。
（9）將細胞懸液分裝入無菌凍存管中，每管1.5 ml（凍存液要先預冷到4℃）；在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者。
（10）凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/ min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。
也可將裝有細胞的凍存管放入
-20℃冰箱2h ，然后放入液氮氣中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。
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