《烟草突变体库创建与功能基因组学研究》项目内容与
烟草基因组计划进展篇：2.烟草突变体创制、筛选与鉴定
２ ０ １ ３ 年第 ３ ４卷
４ 鉴 定 获 得 了一 定数 量 的烟 草 突 变体
对所筛选 的突变体材料进行了突变性状遗传稳定性的初步鉴定 ，通过田间鉴定获得了抗 Ｔ ＭＶ、高香 气 、叶面组织细致等 ７ ４ 个能稳定遗传 的 Ｍ３突变体 ，２ １ ． ７ ％ 参试株系的突变性状能稳定遗传 ，６ ４ ． ３ ％ 还在 分离，１ ４ ． ０ ％没有变异；获得了早花 、 叶面皱等 ２ ４ 个能稳定遗传的 Ｔ ２ 突变体，１ ０ ． ８ ％ 参试株系的突变性状 能稳定遗传 ， ５ ３ ． ３ ％还在分离 ， ３ ５ ． ９ ％没有变异。通过侧翼序列鉴定获得了 ２ 个突变性状与序列共分离的基 因。 通过苗期接种鉴定获得了 ６ 个抗 Ｔ ＭＶ突变体和 ２ 个抗 Ｐ Ｖ Ｙ突变体 。 通过苗期与田问鉴定获得了 ４ 个
和激活标签插入突变体材料筛选 。筛选获得长相好 、叶面皱、腋芽多 、抗黑胫病 、Ｔ ＭＶ、Ｃ ＭＶ、Ｐ Ｖ Ｙ、 不育等突变体材料 ２ ５ ０ ０多个 ，筛选获得高香气 、耐低钾 、乙烯敏感等突变体材料 ４ ０ ０多个 。调查分析了
突变二代可见 Ｉ 生 状的突变率 ，中烟 ｌ ｏ 、红花大金元和林烟草 Ｍ２的各突变性状总突变率分别为 １ ３ ． ９ ％、 ５ ． ４ ％和 ２ ． ２ ％， 红花大金元 Ｔ １ 的总突变率为 １ ． １ ％。 对腋芽发育 、 烟碱合成等 ３ ０ 多个 目 标基 因通过 Ｔ Ｉ Ｌ Ｌ Ｉ Ｎ Ｇ 筛选获得 ６ Ｏ Ｏ多个位点突变的中烟 ｌ ｏ 突变体材料 ，其中氨基酸改变的占 １ ５ ． ３ ％，终止密码子突变的占 １ ． ８ ％。对激活标签插入群体通过侧翼序列扩增获得 ３ ０ ０ ０多条红花大金元序列 ，其 中 ３ ９ ８ 条具有明确的基 因组插人位点 ，在插入位点上下游 ５ ｋ 基因组 区域获得 ４ ９ ２ 个基 因，其中 １ ４ ８ 个基 因具有功能注释。
烟草基因组学研究方法篇：3.烟草功能基因组学中的功能缺失与功能获得策略
１ 功能缺 失策略
基 因功 能缺 失策 略 即筛选 目的基 因功 能 部分 或全 部丧 失 的植株 ，比较 其 与野 生型 植株 在表 型 、生理代 谢 和 基 因表达 上 的差 异 ，分析 该基 因 的功 能 。以往 功 能缺 失研 究通 常 是通 过筛 选 自然突 变 体来获 得基 因功
能部分或全部丧失的植株， 但概率很低 ， 现在一般通过反义 Ｒ Ａ（ｎ ｓｎｅ Ｎ 、 Ｎ ａｔｅｓ Ｒ Ａ） 共抑制 （ｏｕｐｅｓ ｎ 、 ｉ ｃｓｐｒｓ ｏ ） ｉ
１２ 共抑 制 ．
共 抑制 是 指正 向的基 因全长 序 列与 高活 性 的组成 型 启动 子或 组织特 异 性 启动 子融合 ，进 行遗 传 转化 ， 转基 因植株 中 该序 列所 表达 的 Ｒ ＮＡ 抑制 了相应 内源 基 因 的表 达 。共 抑制 现象 来源 于一 些植 物转 基 因事件 偶然 发 现 ，最著 名 的是 Ｎａｏｉ 【的矮牵 牛 花色 改 良实验 ，将 花色 有 关 的查尔 酮合 成酶 基 因 （ ＨＳ ｐ ｌ等 ４ 】 Ｃ ）在 矮
制或封闭相应基 因的表达。反义 Ｒ Ａ 技术提供 了直接有效地人为控制基因表达的方法 ，现 已成为功能缺 Ｎ 失研究中的一项重要技术 ，并在烟草功能缺失研究中得到较多的应用 】 ¨ 。。由于该方法的抑制效率不能达 到理想的功能缺失，因而无法对基因功能进行大规模 的准确分析，使得其应用受到一定的限制。
２ １ 年第 ３ 卷 ０１ ２
中 国烟草科学
１１ ０
迅速 ，耗费的精力和财力较小 。现在，Ｒ Ａ 技术 已经成为基因功能缺失研究 的常规手段，并成为当前植 Ｎ ｉ 物生物学家探索基因功能的一个有力的工具 ，在烟草基 因缺失研究中也具有 良好的应用前景 ，中国农 刚 业科学院烟草研究所通过 Ｇ Ｔ ＷＡ Ａ Ｅ Ｙ方法构诱变 、Ｒ ＮＡ干 扰 （ Ｎ ｉｔ ｆｒｎｅＲ ｉ Ｒ Ａ ｅ ｅｅｃ， ＮＡ ）来进 行 基 因功 能缺 失研 究 。 ｎｒ
烟草NtARF11基因克隆及功能初步分析
烟草NtARF11基因克隆及功能初步分析目录一、内容简述 (3)1. 研究背景与意义 (3)2. 研究目的与任务 (4)3. 研究方法与技术路线 (5)二、材料与方法 (6)1. 实验材料 (7)烟草品种选择 (8)核苷酸提取与纯化 (9)逆转录与PCR扩增 (10)基因克隆与载体构建 (10)转化与鉴定 (12)蛋白质表达与纯化 (13)2. 实验设备与试剂 (14)仪器设备 (15)试剂耗材 (16)3. 实验设计与步骤 (18)核苷酸序列分析 (19)ARF11基因克隆 (20)转化与筛选 (21)蛋白质功能分析 (22)三、结果与分析 (23)1. NtARF11基因的克隆与序列分析 (24)基因序列比对 (24)编码区与非编码区分析 (25)特异性分析 (26)2. 转化植株的表型观察 (27)形态学观察 (28)生理生化指标测定 (29)3. 蛋白质功能初步分析 (31)抗蛋白酶解性检测 (32)寡聚糖酶活性测定 (32)调控植物生长发育的能力分析 (33)四、讨论与展望 (35)1. 结果讨论 (36)NtARF11基因在烟草中的功能推测 (37)与其他ARF蛋白功能的比较 (38)烟草中ARF11基因的表达模式分析 (39)2. 研究展望 (40)深入研究NtARF11基因的功能机制 (41)利用基因工程技术改良烟草 (42)探索NtARF11基因在其他植物中的功能与应用 (43)一、内容简述本研究旨在克隆烟草NtARF11基因，并对其功能进行初步分析。
烟草NtARF11基因编码一个蛋白质，其在植物生长发育过程中具有重要的调控作用。
通过对NtARF11基因的克隆和功能研究，可以深入了解烟草生长发育的分子机制，为烟草育种和抗病性改良提供理论依据。
我们通过测序技术从烟草中筛选出NtARF11基因的cDNA序列，并将其与已知的蛋白质序列进行比对，确认该基因为NtARF11。
我们通过生物信息学方法对NtARF11基因进行了进一步的功能分析，发现其在烟草生长发育过程中具有重要的调控作用。
烟草突变体筛选与鉴定方法篇：1.烟草突变体的筛选与鉴定
激活标签插入突变群体中筛选激活标签所插入位点 的侧翼序列 。 通过烟碱合成途径中关键基 因的表达分析
筛选 不 同烟碱 含 量 的突变 体也 可 归于 突变 序列 筛选 范 畴 。
１ 正 筛选 ． ２
正筛 选 是指 在 其 中加 入某 种 对 正常 烟草 有 毒 （ ）的物 质 （ 害 化学 成 分 ）或 病 原菌 （ 素 ） 毒 ，从 而使 正
中 国烟 草 科 学
Ｃ ｉｅｅ ｏ ａｃ ｃｅｃ ｈｎ ｓ ｂ ｃｏＳｉｎ ｅ Ｔ
２ １．２ ３ （ ） ０ ２０ ，３ １
烟 草 突 变体 筛 选 与 鉴 定 方 法篇 ：１ 烟 草 突 变体 的筛 选 与鉴 定 ．
刘贯 山
（ 中国农 业科 学院烟草研究所 ，青岛 ２ ６ ０ ） ６ １ １
ｉ ａ ｉｏ ｓｓＪ． １ ２ ０ ， ２ ： ３ ７ １ ６ ． ｎＡｒ ｂｄ ｐ ｉ［］ Ｃｅｌ ０ ６ １ ５ １ ４ ３ ０ ，
面分析 ，最终鉴定烟草突变体 。烟草突变体的最终鉴定是一个需要多年的长期工作。
２１ 突变性 状 遗传 稳定 性 分析 ．
对所筛选 的突变体经过 ２（ ） 自 多 年 交和再筛选 ，剔除环境影响和差异不明显株系 ，获得可遗传 的突
变 体 ’
２ １
筛选 、 可见表型筛选获得 的遗传规律明确 的突变体可采用正向遗传学方法克隆突变基 因；多采用 图位克隆 （ 又称定位克隆 ） 的方法 ， 但需要建立一个遗传分离群体 （ 、Ｄ 、Ｂ Ｆ Ｈ Ｃ、Ｒ 等 ） Ｉ ，同时要有与 目标基 因紧 密连锁 的传学则是根据基 ６ 一 因型研究突变表型，即首先找到感兴趣的基因 ， 进而观察对应突变体的表型。通过突变序列筛选获得 的突 变体可采用反 向遗传学方法克隆突变基因 ； 先筛选突变位点或侧翼序列，再分析突变的 （ 或被激活的 ） 基
烟草突变体库创建与功能基因组学研究
附件：《烟草突变体库创建与功能基因组学研究》项目内容与目标一、总体要求突变体通常指某个性状发生可遗传变异的材料，或某个基因发生突变的材料。
长期以来，育种家尽力地发现和分离有价值的自然突变和变异材料。
自20世纪70年代以来，γ射线和 EMS 理化诱变创制的人工突变体在遗传育种中开始应用，此后，T-DNA 插入和转座子标签等插入突变筛选突变体法的发展，大大地加快了突变体的创制步伐。
水稻、番茄、油菜等作物中已建立了一系列突变体库，但烟草突变体库的创制基本没有开展。
建立烟草突变体库是烟草功能基因组学研究不可缺少的重要组成部分，是克隆和阐明烟草重要功能基因的基础和前提。
随着烟草饱和突变体库的建立，可望直接获得突变基因的序列信息并确证基因序列与功能的关系，从而促进烟草重要功能基因的克隆鉴定。
利用理化诱变技术创制烟草突变体库本身也是一种传统的育种技术，通过筛选突变体，可望获得一系列性状特异、能稳定遗传、有利用价值的烟草育种材料，直接应用于新品种选育。
二、招标项目内容与目标（一）攻关内容。
1．利用EMS、快中子诱变创建二倍体烟草（绒毛状烟草）、四倍体普通烟草的饱和突变体库。
2．利用逆转座子Tto1和Tto2创建四倍体烟草插入标签突变体库。
3．建立基于Tilling技术的烟草重要功能基因克隆与验证体系。
4．建立基于PCR技术的烟草重要功能基因克隆与验证体系。
5．建立基于逆转座子的烟草重要功能基因克隆与验证体系。
6．在建立功能基因克隆验证体系的基础上，对突变体进行初步的遗传分析并对重要农艺性状相关基因进行表达特性和功能分析。
（二）攻关目标。
1．创建烟草饱和的突变体库4个（二倍体、四倍体突变体，EMS突变体和快中子突变体），突变体数达8万个；逆转座子标签突变体2万以上。
2．建立基于Tilling技术、基于PCR技术、基于逆转座子的烟草重要功能基因克隆与验证体系并进行重要基因的克隆与功能鉴定。
3．阐明控制亚硝胺、钾含量、抗病等重要农艺性状的基因3个以上，获得低亚硝胺、高钾含量、高抗病的育种材料10个以上。
烟草基因组知识篇：1.基因组与烟草基因组计划
的基 因组测 序 以及人 类 的基 因组草 图 ；２０ 年 完成 水稻 （ ｒｚ ａｉａ ４ ６Ｍ ）的基 因组 草 图，小 鼠 （ ｓ ０２ Ｏ ｙａｓｔ ， ６ ｖ Ｍｕ
结 构 基 因组 学 是通过 基 因作 图 、核 苷酸 序列 分析 以确 定基 因组 成 、基 因定 位 的科学 。染色 体不 能直接
用 来测 序 ，必须将 基 因组这 一 巨大 的研 究对象 进行 分解 ，使之 成 为较 易操作 的小 结构 区域 ，这个 过程 就是 基 因作 图，包括 遗传 图谱 、物 理 图谱 、转录 图谱 以及 最 终的全 序列 图谱 。 功能 基 因组 学又 称 为后 基 因组 学 （ ｏｔ ｅ ｏ ｃ ） ，是 利用 结构 基 因组 学研 究所获 得 的大量 数据 与信 ｐ ｓ ｇ ｎ ｍｉｓ ．
２ 目前完成基 因组测序 的主要生物
１ ８ 年 完 成 噬 菌 体 — ７ 基 因 组 （ ，６ ｐ 的 测 序 ， 成 为 第 一 个 测 序 的基 因 组 ； １９ 年 完成 ９０ Ｘ１ ４ ５３ ８ｂ ） ９５
第一个 原核 生物 （ 感嗜 血杆 菌 ，Ｈａ ｍｏ ｈｌｓｉ ｌｅ ｚｅ １８Ｍ ）基 因组 的测序 ；１９年 完成 大肠杆 菌 流 ｅ ｐ ｉ ｆｕｎａ ， ． ｕ ｎ ９７ （ ｓｈｒ ｈａｅｌ ４６Ｍ ） 和第 一个 真核 生物 （ Ｅ ｃｅｉ ｉ ｏｉ ． ｃ ， 啤酒 酵母， ａ ｃａ ｏ ｙ ｅ ｅｅ ｉ ａ ， ２Ｍ ）的完整基 因 Ｓ ｃｈ ｒｍ ｃｓｃｒｖｓ ｅ １ ｉ 图谱绘 制 ；１９ 年 完成 第一个 多 细胞 生物 （ 丽线 虫， ａｎ ｒａ ｄｔ ｌｇ ｎ， ７Ｍ）基 因组 的测序 ； ００ ９８ 秀 Ｃ ｅ ｏｈ ｂ ｉｓ ｅ ａ ｓ ９ ｉｅ ２０
烟草基因组学研究方法篇：1.烟草突变体的创制及其在功能基因组学研究中的应用
通过 ＴＬ Ｇ、Ｐ ＩＬ ＣＲ—ｗａｋｎ ｌｉｇ或 图位 克 隆技术 ，可 以获得 某 种 （ ）突 变性 状所 对应 的 突变基 因 ， 些 确定基 因与 Ｉ 的对 应关 系 。只要 拥 有饱 和 的突 变体 库 ，理论 上 可 以获得 所有 基 因 的突变体 。烟草许 多 重 生状 要 性状 基 因 ，诸 如 优质 、抗病 、致 香 、减 害等 相关基 因 ，均 可通 过 创建 饱 和 的突变 体库 而得 到分 离 。通过 分 子设 计 育种 ，分 离 的重 要基 因可用 于 烟草 “ 级 ”品种 的培育 。 超
２２ 烟 草育 种 中 间材 料 的创 建 或新 品种 的 直接 选 育 ．
从 烟草 突变 体 库 中筛 选多 样化 、有 价值 的重要 性状 突 变体 ，如 抗旱 、抗 病 、抗虫 、特 异香 型 等 ，可 以 为 烟草 育种 提供 丰 富 的遗 传资 源 和 中 间材 料 ，甚 至 能直 接从 突 变体 中选 育 出新 的优 良品（ ） 【 种 系 ｌ 。王万 军 等筛 选 的对 Ｃ ＭＶ具 有较 好抗 性 的烟草 突 变体 Ｅ ２ １ ａ０ 可作 为抗 病 育种 的 中 间材料 ｎ 。从 烟 草 突变体 直接 选 育成 烟 草 品种 的典 型例 子 就是 白肋 烟 。
10烟草突变体的创制及其在功能基因组学研究中的应用中国农业科学院烟草研究所青岛266101从2000年6月26日参与国际人类基因组计划的美英日法德中6个国家16个研究中心联合宣布人类基因组工作框架图开始人类历史进入了一个崭新的时代即后基因组时代
中 国烟 草 科 学
Ｃ ｉｅｅ ｏａｃ ｃ ｎ ｅ ｈ ｓ ｂｃｏＳ ｉ ｃ ｎ Ｔ ｅ
（ａｇｔ ｇｉｄ ｃｄｌｃｌｅｉｎ ｅｏ ｓ ｔｒｅｉ ｕｅ ａｌ ｏ ｓｎｇｎｍｅ ）技术 ［，可高通 量地 分析 突变位 点 ，获得 突变基 因序列 。 ｎ ｎ ｏ ｓ ｉ ７ 】
烟草叶形突变体的形态特征与关键基因表达差异研究
中国农业科技导报，2020, 22(3):38-45 Journal of Agricultural Science and Technology
烟草叶形突变体的形态特征与关键基因表达差异研究
周蕾"，张彦"，张娟吴晓颖V,马兴华“
(1 .中国农业科学院烟草研究所,农业农村部烟草生物学与加工重点实验室， 山东青岛266101； 2.中国农业科学院研究生院，北京1(XX)81)
(1 .Key Laboratory of Tobacc-o Biology and Processing, Ministry of Agriculture and Rural Affairs； Institute of Tobacco Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shandong Qingdao 266101 , China； 2.Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081 , China)
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附件：
《烟草突变体库创建与功能基因组学研究》项目内容与目标
一、总体要求
突变体通常指某个性状发生可遗传变异的材料，或某个基因发生突变的材料。
长期以来，育种家尽力地发现和分离有价值的自然突变和变异材料。
自20世纪70年代以来，γ射线和 EMS 理化诱变创制的人工突变体在遗传育种中开始应用，此后，T-DNA 插入和转座子标签等插入突变筛选突变体法的发展，大大地加快了突变体的创制步伐。
水稻、番茄、油菜等作物中已建立了一系列突变体库，但烟草突变体库的创制基本没有开展。
建立烟草突变体库是烟草功能基因组学研究不可缺少的重要组成部分，是克隆和阐明烟草重要功能基因的基础和前提。
随着烟草饱和突变体库的建立，可望直接获得突变基因的序列信息并确证基因序列与功能的关系，从而促进烟草重要功能基因的克隆鉴定。
利用理化诱变技术创制烟草突变体库本身也是一种传统的育种技术，通过筛选突变体，可望获得一系列性状特异、能稳定遗传、有利用价值的烟草育种材料，直接应用于新品种选育。
二、招标项目内容与目标
（一）攻关内容。
1．利用EMS、快中子诱变创建二倍体烟草（绒毛状烟草）、四倍体普通烟草的饱和突变体库。
2．利用逆转座子Tto1和Tto2创建四倍体烟草插入标签突变体库。
3．建立基于Tilling技术的烟草重要功能基因克隆与验证体系。
4．建立基于PCR技术的烟草重要功能基因克隆与验证体系。
5．建立基于逆转座子的烟草重要功能基因克隆与验证体系。
6．在建立功能基因克隆验证体系的基础上，对突变体进行初步的遗传分析并对重要农艺性状相关基因进行表达特性和功能分析。
（二）攻关目标。
1．创建烟草饱和的突变体库4个（二倍体、四倍体突变体，EMS突变体和快中子突变体），突变体数达8万个；逆转座子标签突变体2万以上。
2．建立基于Tilling技术、基于PCR技术、基于逆转座子的烟草重要功能基因克隆与验证体系并进行重要基因的克隆与功能鉴定。
3．阐明控制亚硝胺、钾含量、抗病等重要农艺性状的基因3个以上，获得低亚硝胺、高钾含量、高抗病的育种材料10个以上。