PCR引物设计的原则
设计pcr引物遵循的原则
设计pcr引物遵循的原则聚合酶链反应（PCR）引物的设计是PCR实验成功的关键因素之一。
以下是一些设计PCR引物时应遵循的原则：1. 特异性：引物应具有高度特异性，以确保它们只与目标DNA序列结合，而不与其他非目标序列结合。
这有助于避免非特异性扩增产物的形成。
2. 长度：引物的长度通常应在18到25个碱基对之间，过长或过短的引物可能导致扩增效率降低。
引物长度的一般建议是20-22个碱基对。
3. GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间。
这有助于确保引物的熔解温度适中，提高引物的特异性。
4. 熔解温度（Tm）：引物的Tm是引物与模板DNA结合和解离的温度。
引物的Tm应该在50-65°C之间，以确保在PCR循环中引物能够特异性结合到模板。
5. 避免自相互或异相互二聚体：引物的设计应防止引物之间或引物与模板之间发生意外的二聚体形成，这可能导致PCR反应的不稳定性。
可以使用在线工具预测引物之间和引物与模板之间的二聚体。
6. 避免重复序列：引物应避免含有重复序列，以防止非特异性扩增。
7. 避免剪切位点：引物不应该包含酶切位点，以防止在PCR扩增过程中被酶切。
8. 引物对的选择：在PCR反应中，通常需要一对引物。
这对引物应该相互配合，以确保它们在同一温度下工作，并且扩增产物大小符合实验要求。
9. 考虑引物的位置：引物应设计在目标序列内部，而不是在末端。
这有助于确保扩增产物包含目标区域的完整信息。
10. 检查SNP和突变：引物的设计需要考虑可能存在的单核苷酸多态性（SNP）或突变。
确保引物能够区分目标序列中的变异。
在进行PCR引物设计时，通常使用一些在线工具或软件来辅助，这些工具可以帮助评估引物的特异性和其他参数。
PCR引物(普通)设计原则(归纳)
•
• 引物的序列：
•
夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物
与模板的复性结合。引物自身不能有4个碱基的互补。 • 2.两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′
1.引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发
端的互补 重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。
3.不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在 。降低引物与模板相似性的一种方法是， 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超 过3个连续的G 或C，因这样会使引物在GC富集序omposition）过高或过低都不利于引发反应。 上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature） 是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有 效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的 Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 2.引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。 △G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性， △G值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低 （绝对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并 引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析） 。引物二聚体 及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。
端开始的，不能进行任何修饰。
•
(A).3′ 端也不能有形成任何二级结构。 (B).尤其3′端不应超过3个连续的G 或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 引物3′端不能选择A，最好选择T.引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差 异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为 T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好 选择T. (C).如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简 并，会影响扩增的特异性与效率。
引物设计原则
引物设计原则
1.合适的引物长度：引物长度通常在18-30个碱基对之间，过长或过
短的引物都不利于PCR扩增的稳定性。
2.适当的引物GC含量：引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过
低的GC含量都会影响引物和模板DNA的特异性结合。
3.引物特异性:引物应具有高度特异性，可以通过引物序列在数据库
中进行BLAST分析来评估引物的特异性。
4.避免引物自身的二聚体和结构性：引物序列中要避免出现自身二聚
体和结构性，这会干扰PCR扩增的效果。
5.选择高峰结构引物：在引物设计时，优先选择会形成高峰结构的引物，这有助于提高扩增效率。
6.引物末端碱基的特异性：在引物末端碱基选择时，尽量使用能够增
强特异性和避免非特异性扩增的碱基。
7.引物的熔解温度（Tm）：引物的熔解温度直接影响PCR扩增反应的
特异性和效率，应根据目标DNA的长度和序列来确定引物的Tm。
8.避免引物之间的交叉杂交：在多引物PCR反应中，引物之间的交叉
杂交会干扰扩增效果，可以通过软件模拟或实验确认引物之间没有相互杂交。
9.引物序列中避免多个重复碱基：引物序列中的多个重复碱基可能导
致非特异性扩增，应避免在引物序列中出现连续的多个重复碱基。
10.引物设计的可操作性和经济性：引物设计时，要考虑到引物合成
的成本和操作的方便性，选择价格适中的合成方法，并确保引物容易操作。
以上是引物设计的原则和考虑因素，通过合理设计和优化引物序列，可以提高PCR扩增实验的特异性、敏感性和效率，从而获得准确和稳定的实验结果。
引物设计基本原则
引物设计基本原则引物设计是指在分子生物学研究中，用于扩增目标DNA序列的两个引物的设计。
好的引物设计是成功进行PCR反应的关键之一、下面是引物设计的基本原则：1.引物长度：引物长度一般在18-24个碱基对左右，太短容易引起非特异性扩增，太长则可能导致引物无法与目标序列完全匹配。
2.引物的GC含量：引物的GC含量一般在40-60%之间，太低则可能导致引物无法与目标序列形成稳定的双链结构，太高则可能导致引物与非特异性目标序列发生杂交。
3.引物的熔解温度(Tm)：引物的Tm是指引物与目标序列在溶液中解链的温度。
引物设计时应保证所设计的两个引物的Tm值相似，一般相差不超过2-3摄氏度。
这样可以保证引物在PCR反应中同时结合于目标序列。
4.引物的特异性：引物设计时必须确保引物与目标序列的特异性，即引物在基因组中只与目标序列互补匹配，不与其他非目标序列发生杂交。
为了提高引物的特异性，可以使用生物信息学工具如BLAST进行引物的序列比对和分析。
5.引物的结构：引物设计时应注意引物的序列结构。
首先要避免引物的自身二级结构，特别是避免引物的自身二聚体形成，可以使用在线工具进行预测和评估。
另外，引物的末端最好是链末端，避免引物形成环状结构。
6.引物的位点选择：在设计引物时，应选择位于目标序列上的独特位点作为引物扩增的位点。
这样可以确保引物扩增出的产物是目标序列，而不是其他类似的序列。
7.引物的序列设计：引物设计时应避免序列中出现连续的重复碱基序列，避免过多的GC或AT连续存在。
此外，引物设计时还可以考虑在引物的序列中加入特定的限制性内切酶位点，方便后续分子克隆和分析。
总结起来，引物设计的基本原则包括引物长度、GC含量、Tm值、特异性、结构、位点选择和序列设计。
良好的引物设计是成功进行PCR反应的前提之一，能够提高扩增效率和特异性，并且避免产生非特异性扩增产物。
PCR引物设计原理及原则
PCR引物设计原理及原则PCR引物设计是聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的关键步骤之一、PCR引物是指PCR扩增反应中作为起始材料的两个DNA片段，通常是20-30个碱基对长的寡核苷酸序列。
PCR引物设计的目的是选择合适的引物序列，以实现特定DNA序列的扩增。
1.特异性：PCR引物应该非常特异地与目标序列相互作用，不与其他非特异性的序列发生非特异性的扩增反应。
为了实现特异性，引物序列应该在目标序列上具有高度互补性，但是在非特异性序列上没有互补性。
2.合适的长度：PCR引物的长度在20-30个碱基对之间，较短的引物可能无法特异性地与目标序列结合，而较长的引物可能导致PCR反应的效率降低。
3.避免结构性：PCR引物设计中应避免引物之间或引物与模板之间的二级结构形成。
二级结构会干扰PCR反应的进行，降低扩增效率。
4.避免引物间杂交：在PCR反应中，通过引物间的相互作用引发的非特异性扩增会干扰特异性扩增的结果。
因此，在设计PCR引物时，需要避免引物间的互补性。
1.选择位于目标序列上的合适区域进行扩增，通常选择区域位于目标序列上游和下游的相对保守区域。
这样可以确保PCR引物的特异性和稳定性。
2.引物应具有一定的GC含量，一般在40%-60%之间，过低的GC含量会降低PCR反应的特异性和稳定性。
3.引物的两端不应含有重复序列，这样可以避免模板序列的间断扩增。
4.引物的两端应该有相对稳定的酮基或磷酸基，这样可以提高引物的稳定性，确保特异性扩增。
5.避免引物的自身互补性，以防止引物间的二级结构形成。
引物的互补性会干扰PCR反应的进行。
6.引物应避免在末端存在带有杂质的碱基，因为这可能会导致扩增产物的杂交和二级结构形成。
7.引物序列应尽量避开重复序列、富含AT或GC的序列、高度变异的区域和基因座之间的序列相似性较高的区域。
8.引物设计应考虑到引物长度、温度和浓度的相互配合，以保证对目标序列的特异性扩增。
PCR引物设计原则
PCR引物设计原则PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学领域的基础技术，可以在体外复制DNA分子。
PCR的核心是引物，引物的设计质量直接影响PCR反应的效率和特异性。
以下是PCR引物设计的原则。
1.引物长度：引物的理想长度为18-22个碱基对。
引物过短可能导致特异性不足，引物过长则可能降低PCR的效率。
2.引物序列：引物序列应具备良好的互补性，即能与待扩增的目标DNA序列特异性结合。
通常，引物的GC含量应在40-60%之间，以确保引物和目标序列之间形成稳定的氢键。
3.引物选择：引物的设计需要仔细考虑避免引物间以及引物与模板序列间的互补。
如果引物之间有互补性，则可能导致非特异性扩增。
另外，引物不能与附近的肥皂序列或重复序列互补，以免引入非特异性产物。
4.引物结构：引物的3'端应以碱基对为基础设计，以提高扩增特异性。
同时，避免引物在末端出现重复序列，以免引导多聚加合反应。
5.引物的熔解温度（Tm）：引物的熔解温度应相似，并在50-60℃之间，以确保引物和模板序列的互补结合，同时避免引物之间的自身结合。
6.引物的位点选择：引物应选择在目标序列上的保守区域，以确保引物在不同基因型和物种之间的通用性。
在选择引物位点时，避免选择在引物附近有大量SNP（单核苷酸多态性）或缺失突变的区域。
7.引物的杂合性别：引物的杂合性别是指引物本身的互补性。
如果引物存在杂合性别，则可能导致非特异性扩增。
在进行引物设计时，可以使用软件工具来评估引物的可能杂合效应。
8.引物的特异性评估：在进行引物设计后，可以使用BLAST等工具来评估引物的特异性。
该工具可以引物序列与数据库中的其他序列的互补匹配。
特异性较好的引物应仅与目标序列匹配。
9.引物标记：引物可以通过添加特定序列或化学标记进行标记。
在PCR扩增过程中，通过标记引物可以进行定量和检测反应产物的操作。
在PCR实验中，良好的引物设计是确保特异性扩增的关键。
引物设计需要综合考虑引物长度、序列、选择、结构、熔解温度、位点选择、杂合性别、特异性评估、标记和固定等因素。
PCR引物设计相关知识---PCR引物设计原则
PCR引物设计相关知识---PCR引物设计原则PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。
如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。
如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。
一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。
让我们先看看P1引物。
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。
而且四种碱基的分布最好随机。
不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。
否则P1引物设计的就不合理。
应重新寻找区域设计引物。
同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。
引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。
但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。
这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
PCR引物设计的原则引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列...
PCR引物设计的原则引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用∆G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。
必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。
根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2]。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。
引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。
不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。
另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。
5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。
4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。
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PCR引物设计的原则引物设计的原则:首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。
围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length）、产物长度（product length）、序列Tm 值(melting temperature)、ΔG值(internal stability)、引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）、错误引发位点（false priming site）、引物及产物GC 含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。
以使用Oligo 软件分析设计引物为例，笔者总结出以下的要点：1. 引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq 酶的最适温度。
2. 引物3’端的序列要比5’端重要。
引物3’端的碱基一般不用A（3’端碱基序列最好是G、C、CG、GC），因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。
另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
5’端序列对PCR 影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
3. 引物的GC含量一般为40-60%，以45-55％为宜，过高或过低都不利于引发反应。
有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。
如果G-C比例超出，则在引物的5’端增加As或Ts；而如果A-T 比例过高，则同样在5’端增加Gs或Cs。
但也有认为：原来普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率的观点其实是不对的，以人基因组DNA为模板，用81%AT的引物可以产生单一的、专一的、长250 bp，含有70% AT的产物。
完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。
4. 引物所对应模板序列的Tm 值最好在72℃左右。
（Tm 值曲线以选取72 度附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应），至少要在55－80℃之间5. ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。
一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。
3′末端双链的ΔG是0～－2 kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6时只有40%、到－8时少于20%、而－10时接近于0。
6. 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，如此可保证不出非目的产物的假带。
但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。
如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450 以上，而在错误位点的引发效率为130，并且不好找其他更合适的引物，那么这对引物也是可以接受的。
7. Frq 曲线为Oligo6新引进的一个指标，揭示了序列片断存在的重复机率大小。
选取引物时，宜选用Frq 值相对较低的片断。
8. 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR 正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3’端的连续GGG 或CCC 会导致错误引发。
二聚体形成的能值越高越稳定，越不符合要求。
与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。
虽然有些带有发夹环，其ΔG为－3 kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3′末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。
当然，如果发夹环在5′末端对反应就没有多大的影响了。
9. 以公式(4×G/C + 2×A/T–5)计算Tm值，即退火温度。
选择较低Tm值的引物的退火温度为反应的退火温度。
4-6℃的差别似乎对PCR产量影响不大。
最好，保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范围内10. 要知道，更重要的因素是模板与稳定性较小的引物之间解链温度的差异。
差异越小，PCR的效率越高。
因为DNA的解链温度也取决于它的长度，所以有的研究者喜欢设计很长，而不求它很稳定的引物。
可是，引物太长就难以避免形成二聚体和自身互补，因此，一般还是不用为好。
如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的(16～18 mer)的引物：若产物长5 kb，则用24 mer的引物。
有人用20～23 mer引物得到40 kb的产物。
11. 在DNA测序和PCR中最好用5′末端稳定(如GC含量较多)，而3′末端不太稳定(如AT含量较多)的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。
这就是基于引物内部稳定性的经验之谈。
其3′末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发DNA合成，所以不会产生假产物。
因此，为了有效地引发反应，引物的5′末端和中央部分必须与靶DNA也形成双链。
与此相反，带有稳定的、GC丰富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都与靶序列配对，只凭借其3′末端与靶序列任何位点的牢固配合就可以引发反应，产生非专一产物。
无论如何，寡核苷酸3′末端最后5个核苷酸的稳定性小于－9 kcal/mol的，通常就是专一性的探针或引物。
寡核苷酸3′末端越不稳定，假引发的可能性越低。
12. 如果用3′末端低稳定性的引物，反应的最适退火温度范围会不寻常的宽。
这就可以不经过事先的最佳化实验就能在最佳条件下进行反应。
13. 引物的唯一性：为了放大单个的、专一性DNA片段，选用的引物序列就应当是唯一的，即在模板中没有重复序列。
如果用哺乳动物基因组序列作为模板，可以用Alu序列或其他短重复元件来核对想用的引物的互补性。
由此也可知，应当避免使用同寡聚物(如—AAAAAA—)和二核苷酸重复(如—ATATAT—)。
14. 引物和产物的Tm值不要相差太大，20摄氏度范围内较好。
定下引物的Tm值范围之后即可定下引物的长度范围。
15. 对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。
16. 值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。
有的模板本身条件较差，比如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；有时PCR产物要作为克隆对象插入到载体中表达，因此PCR引物设计的可选择度很低。
遇到这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件，这时，使用自动搜索引物及正确地评价引物可使研究人员对实验心中有数。
17. 在设计克隆PCR引物时，引物两端一般都添加酶切点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低，这种PCR需要灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。
18. 如扩增出多条带（引发错配所致），不出目的带或出目的带很弱（引物引发效率低下）RT-PCR引物设计原则和方法在NCBI上搜索到该基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。
点击Primer，进入引物窗口。
此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。
在Search Parameters 里面，可以设定相应参数。
一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp。
点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’端不要以A结尾，最好是G或者C，T也可以；3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。
此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。
该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。
若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。
最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。
但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。
对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5。
在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。
在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。
在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。
定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower 按钮，确定下游引物。
引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。
Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm 值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3’端的Delta G。