qPCR引物设计
荧光定量pcr的原理方法
荧光定量pcr的原理方法
荧光定量PCR（Fluorescent Quantitative PCR，qPCR）是一种用荧光信号量化检测PCR产物的方法，用于定量分析目标DNA或RNA的含量。
荧光定量PCR的基本原理如下：
1.引物设计：设计特异性引物，使其能够特异性地扩增目标DNA或RNA序列。
2.模板DNA或RNA的提取：从样品中提取目标DNA或RNA。
3.cDNA合成：对于RNA样品，需要首先将RNA反转录成cDNA，作为PCR 的模板。
4.Real-time PCR扩增反应：将模板DNA或cDNA与引物和荧光探针一起加入PCR反应体系中，进行实时PCR扩增。
PCR反应体系中还包括核苷酸，聚合酶和缓冲液等。
5.荧光信号检测：随着PCR的进行，荧光探针被解旋成单链，释放出与之配对的荧光染料。
荧光染料产生荧光信号，信号强度与扩增产物的数量成正比。
6.荧光信号检测系统：荧光信号检测系统实时检测PCR反应体系中的荧光信号，并将其转换成数值。
7.标准曲线绘制：通过使用已知浓度的标准品进行一系列稀释，绘制出标准曲线。
标准曲线将荧光信号强度与目标DNA或RNA的初始浓度之间建立了一个标准关系。
8.样品定量：通过对样品的荧光信号强度进行测量，并使用标准曲线进行插值计算，确定样品中目标DNA或RNA的初始浓度。
荧光定量PCR具有高灵敏度、高特异性、宽动态范围、低检测限和快速分析等优点，广泛应用于分子生物学和疾病诊断等领域。
cut run的qpcr引物设计规则
cut run的qpcr引物设计规则引物设计在分子生物学实验中起着至关重要的作用，特别是在定量PCR实验中。
cut run是一种新近发展的染色质免疫共沉淀技术，其原理是通过特异性抗体识别靶标蛋白，并利用酶切作用将其与染色质分离，然后使用qPCR来定量分析目标基因的丰度。
在cut run实验中，引物的设计是确保实验成功的关键。
在进行cut run实验前，需要确定目标基因的序列。
这可以通过数据库查询或测序技术来获取。
在得到目标基因序列后，可以使用一些在线工具或软件来设计引物。
例如，Primer3是一种常用的引物设计软件，它可以根据一系列参数，如引物长度、GC含量、Tm值等，自动生成合适的引物序列。
在cut run实验中，引物设计需要遵循一些规则和原则。
首先，引物的长度通常在18-25个碱基对之间，这样可以提高引物的特异性和扩增效率。
此外，引物的GC含量应在40-60%之间，以确保引物在反应温度下具有适当的稳定性。
同时，引物的Tm值应在50-65℃之间，以确保在PCR反应中引物的特异性和扩增效率。
在设计引物时，还需要考虑引物的特异性。
特异性引物能够准确识别目标基因，而不会与其他非靶标序列发生非特异性扩增。
为了确保引物的特异性，可以使用一些在线工具或软件来进行引物序列的BLAST比对，以确保引物只与目标基因序列匹配。
引物的设计还需要考虑引物之间的配对效率。
在cut run实验中，通常需要使用两对引物，一个用于目标基因的扩增，另一个用作内参基因。
内参基因的选择应该是稳定表达且不受实验条件影响的基因。
例如，常用的内参基因有GAPDH、β-actin等。
两对引物的设计应该遵循一致的规则，并且要确保引物的Tm值相近，以确保它们在同一温度下扩增。
在实验中，引物的质量也是非常重要的。
为了确保引物的质量，可以选择可靠的供应商，并避免使用旧的或不合适的引物。
此外，引物的储存也需要注意，应该存放在干燥、避光和低温的环境中，避免引物的降解和污染。
qpcr引物设计原则和注意事项
qpcr引物设计原则和注意事项
qPCR引物设计原则和注意事项
qPCR引物设计是指为了检测特定基因序列而设计的一种引物，是实现qPCR技术的关键技术之一。
引物设计的准确性和准确性直接影响qPCR的精确性、可靠性和重复性。
qPCR引物设计的原则是：1）选择被检测序列的5’端两个核苷酸作为引物的开始；2）采用20-23bp的长度，保证引物的灵敏度和特异性；3）引物的Tm值应位于55-60°C，以确保引物有足够的结合力；4）尽量避免引物中存在重复序列；5）尽量避免引物中存在非特异性结合位点。
在设计qPCR引物时，应注意以下几点：1）选择被检测基因序列的特定位置作为引物的起始位点；2）计算引物的Tm值，以确保引物的结合力；3）避免引物中存在重复序列及其它非特异性结合位点；4）加入引物的标记磷酸，以增加引物的特异性；5）检查引物序列中是否存在致突变的核苷酸；6）检查引物序列中是否存在非特异性结合位点。
总之，qPCR引物设计是一项重要且复杂的技术，设计者必须特别注意以上原则和注意事项，以确保设计出的引物具有足够的特异性和灵敏度，以实现qPCR的准确性和可靠性。
qPCR引物设计原则及具体操作步骤
qPCR引物设计原则及具体操作步骤1.找基因（DNA）1)通过英文名称查找通过查看文献或者百度搜索查找到对应基因的准确的英文名称→进入NCBI官网→点击网页右下角GenBank，进入GenBank界面→在搜索框中输入准确的英文名称，点击Search搜索即可2)通过序列号查找通过查找文献，找到相应基因在GenBank上的登录号，直接输入上面的搜索框进行查找即可。
例如：犬冠状病毒(canine coronavirus，CCV)基因保守片段序列号为KT222978。
3)通过引物查找通过查找文献，找到别人用过的对应的引物→在NCBI官网右下角点击Primer-BLAST→输入正、反向引物序列→设置对应参数→点击“Get Primers”进行搜索即可4)找到对应的基因后点击“FASTA”，进入相应界面，再点击“Send to”选择相应格式，保存序列。
2.qPCR引物和TaqMan探针的设计1)引物设计注意事项a)引物长度17bp-25bp为佳。
太短的引物容易导致扩增效率降低；太长的引物会导致出现引物高级结构的几率增加。
两者都会干扰定量结果的准确性b)扩增片段长度为：90-150 bp（最低不能超过70，最高不能超过180）c)引物的Tm值为：最小57℃，最大63℃，最适为60℃，两条引物之间退火温度得差距不超过1℃，推荐使用Primer Premier 5进行Tm值计算；d)引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀，避免使用GC或者TA含量高的区域，尤其是3’端，必须避开GC含量不均匀的区域。
e)引物设计时请尽量避开TC或者AG的连续结构。
f)3’端不能超过3个以上碱基互补，自互补碱基数不超过3；3’端最后一个碱基绝对不能搭上g)特异性要有保证，与非特异模板3’端互搭碱基数不超过3，不连续出现4个及以上的GC互搭h)引物3’端最后五个碱基不能包含超过2个以上的G或者Ci)引物的GC含量控制在40%-60%之间为好，最佳为45%-55%之间j)正向或者反向引物应尽量接近探针序列但是不能和探针序列有重合区域k)在Primer-BLAST设计时，在Organism 处选择相应物种l)需跨外显子设计，避免基因组污染2)TaqMan探针设计指南a)探针序列应尽量接近正向或者反向引物，但是不能与之有重合区域；一般相隔1~5个碱基（一般10个以内，最好是1个碱基）。
LncRNA引物设计-十年资深qPCR引物设计经验分享及常用LncRNA数据库介绍
LncRNA引物设计-⼗年资深qPCR引物设计经验分享及常⽤LncRNA数据库介绍LncRNA引物设计-⼗年资深qPCR引物设计经验分享及常⽤LncRNA数据库介绍LncRNA的qPCR引物如何设计？在设计的时候有没有需要特别注意的地⽅？如何能设计出最好的qPCR引物。
基于这些问题，总结⾃⼰10年qPCR引物设计经验分享给⼤家。
LncRNA的qPCR引物相⽐于编码基因，是要复杂。
导致其复杂的原因并不是引物设计原则上有特别之处，⽽是在于有太多的LncRNA数据库，数据库之间往往没有关联，且不同数据库的维护也不尽相同。
今天的⽂章分两块：LncRNA数据库介绍和LncRNA引物设计注意事项。
LncRNA数据库介绍1、NCBIRefSeqNCBI不多做介绍，通常LncRNA信息我们参考RefSeq数据库中的数据，RefSeq数据库中的数据参考数据，是经过⼈⼯审核，其数据信息可信，注释全⾯。
RefSeq数据库中LncRNA的命名通常是NR_或者XR_开头，后⾯加数字，其外显⼦信息位置，数量信息⾮常完整。
2、Ensembl相同的LncRNA，Ensembl数据库中信息往往要⽐NCBI多很多，特别是转录本数量。
且数据变化⾮常快且变化会很⼤，可能昨天浏览这个数据库中某个LncRNA只有2个转录本，隔天再去看的时候，可能就变成3个甚⾄更多。
NCBI就不同，尽管更新频率也⾮常的快，但是LncRNA的变化通常很⼩，转录本数量基本不变化，序列变化的可能性也⾮常的⼩。
3、UCSCUCSC数据库的LncRNA数据个⼈认为更新相对较慢，但有些LncRNA名称如uc001ylu就需要前往UCSC数据库查询其序列信息。
UCSCGenomeBrowser可以根据基因组的位置、基因ID、转录本等信息进⾏浏览查询。
4、RNAcentralRNAcentral整合了包括Ensembl、GENCODE、Greengenes、HGNC、LNCipedia、lncRNAdb、miRbase、NONCODE、RDP、RefSeq、Rfam、SILVA在内的多个数据库。
NCBI使用教程--qPCR引物设计
NCBI使⽤教程--qPCR引物设计NCBI设计qPCR引物主要⽤到Primer designing tool⼀/打开基因序列页⾯⼆/点击Pick Primers，跳转到到Primer designing tool的页⾯到Primer designing tool的页⾯。
*如果已经有了基因的序列，可以不通过基因查找页⾯，直接进⼊Primer designing tool。
具体的⼊⼝是NCBI——BLAST——Primer-Blast。
三/根据公式对将设计出的引物进⾏参数设计① PCR Template通过查找序列转到Primer designing tool的，那么在PCR Template栏中则会⾃动出现您的基因的编号，⽐如对于human β-actin来讲，其mRNA的页⾯点击Pick Primer之后，PCR Template 栏中会出现其对应编号：NM_001101.3。
如果是直接进⼊Primer designing tool界⾯，则需要将⽬的基因的编号或者序列粘贴进该框中。
在右侧的Range栏中，可以设定正反向引物的结合范围。
② Primer Parameters引物参数栏中，前两⾏是引物的序列栏，⽤于对已有的引物进⾏特异性分析，在设计引物的过程中并不会⽤到，因此留空即可。
在PCR product size⼀⾏中，可以设定PCR引物的扩增产物长度范围，对于qPCR来讲，范围设为50~250时结果⽐较精确，可以先设定⼀个较⼩的范围，如80~150，如果该范围内没有设计出⽐较好的引物，则可以返回扩⼤产物⼤⼩范围。
# of primers to return是指软件设计引物的数量(如果有的话)，默认为10对。
引物的Tm值⼀⾏中，可以设定引物的最⼤、最⼩和最佳Tm值，以及正反向引物Tm的最⼤差值。
对于qPCR来讲，默认的即为最佳Tm值60°C，不需做任何修改。
③ Exon/intron selection在抽提RNA的过程中，样本中的基因组DNA污染会显著影响最终的结果，虽然可以使⽤DNase I进⾏处理将RNA样本中的中DNA降解掉，但是很难保证DNA降解完全。
qPCR引物设计
填入要比较的物种 （可输入通用名，如 human/mouse/rat/rab bit 当需要同时比较多物 种时，点击”Add more organisms”
勾选”show results in a new window”--》点击”Get Primers”
Primer blast – 结果
qPCR引物设计
荧光定量PCR
荧光定量PCR引物设计（SYBR@Green）
引物要求： （1）设计的时候尽量靠近基因的3'端，这样能最大限度地保证扩增效率 （2）尽量跨越内含子，这样可以保证检测有无基因组污染 （3）两条引物的Tm值不要相差太大 （4）产物长度保证在80～200bp之间，最长300 bp。 （5）避开保守区域
3 qPCR引物特异性验证
1、 进入网页： 2、 点击Basic BLAST 中的nucleotide blast 选项
2 beacon Designer 设计qPCR引物
专业的定量PCR设计软件：beacon Designer 1 搜索引物保守序列（与转录组比较）
黄色区域为相对保守序列，设计引物是要尽量避开
2 beacon Designer 设计qPCR引物
专业的定量PCR设计软件：beacon Designer 2 设计引物
1. NCBI Primer blast
NCBI 设计引物网址：
Primer blast
输入基因号或FASTA序列
定义引物的范围
（举例：针对长3k的基因，若扩增1000-1050的范围， 则可填入
Forward – 1 to 1000, Reverse – 1050 to 3000
10.26-qPCR引物设计
10.26-qPCR引物设计设计原则：1.PCR扩增产物长度 :80-150bp. 引物的产物⼤⼩不要太⼤，⼀般在80-250bp之间都可；80-150bp最为合适（可以延长⾄300 bp）2.引物长度⼀般在15-30碱基之间。
引物长度（primer length）常⽤的是18-27bp，但不应⼤于38bp，因为过长会导致其延伸温度⼤于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进⾏反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
Tm=58-60度。
GC含量（composition）过⾼或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太⼤。
另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡的解链温度，即在⼀定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。
有效启动温度，⼀般⾼于Tm值5-10℃。
若按公式Tm=4（G+C+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55-80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4.引物3'端不能选择A，最好选择T。
引物3'端错配时，不同碱基引发效率存在着很⼤的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，⽽当末位链为T时，错配的引发效率⼤⼤降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3'端最好选择T。
5.引物⾃⾝及引物之间不应存在互补序列。
引物⾃⾝不应存在互补序列，否则引物⾃⾝会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本⾝复性。
这种⼆级结构会因空间位阻⽽影响引物与模板的复性结合。
引物⾃⾝不能有连续4个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3'端的互补重叠以防⽌引物⼆聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物⼆聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过⾼（应⼩于4.5kcal/mol）。
否则易导致产⽣引物⼆聚体带，并且降低引物有效浓度⽽使反应不能正常进⾏。
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cDNA Forward primer
Step 2:
Real-time PCR
成分： 1. 茎环RT引物 2. 正向引物 3. 反向引物（通用） 4. TaqMan探针（可选）
Q
F Reverse
TaqMan probe primer
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Primer blast – 结果
基因的Exon位置
引物的位置
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Primer blast – 结果
•引物的基本情况 •引物和非相关产物的配对情况
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基因组DNA干扰的判别
•+RT
•–RT
•+RT •–RT
•No template
•control
No gDNA detected in the –RT control (flat green/red line)
no gDNA removal
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附录5 - RT引物的选用
• GSP：常用于一步法RT－PCR。但是引物设计质量影响RT的结果。在扩
增低丰度的转录本时是最好的。
• Oligo dT引物:真核生物的mRNA适用，建议用于高质量RNA及全长转
录本的逆转录；不适用于降解的RNA
2. qPCR引物的网络数据库
PrimerBank is a public resource for PCR primers. These primers are designed for gene expression detection or quantification (real-time PCR). PrimerBank contains over 306,800 primers covering most known human and mouse genes. •/primerbank/
kb
kb
•使用Oligo-dT作为引物：扩增离3’端远近不同的片段，离3’越远扩增
越差
•必须使用[Oligo-dT+(N)9]
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附录6 – qPCR引物的验证结果示意
Experimental validation data
•amplification plots, dissociation curves •2% agarose gel analysis •sequencing and BLAST data （可选） •标准曲线-》扩增效率（可选）
Primer blast
输入基因号或FASTA序列
定义引物的范围
（举例：针对长3k的基因，若扩增1000-1050的范 围，则可填入
Forward – 1 to 1000, Reverse – 1050 to 3000
若有已知引物，可填 入，以测试特异性
针对sybr qPCR：产物大小 填100 to 200（最大不超过 300）
miRNA qPCR引物数据库
数据库来源：
MicroRNA expression profiling of single whole embryonic stem cells，/pmc/articles/PMC1351374/
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效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；
（6）、引物之间的TM相差避免超过2℃；
（7）、典型的引物长度为18-24bp，探针长度为15-45bp；
（8）、PCR产物长度在50-150bp之间，这样有利于使PCR效率相同；
（9）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLAST分析其
特异性
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qPCR引物设计
应用类型
•绝对定量（Absolute Quantification） •‹相对定量（Relative Quantification） •‹microRNA研究（MicroRNA Research） •‹基因拷贝数变异（CNV Research） •‹基因分型/SNP分型（Gene Genotyping）
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附录4 - 逆转录方法的选择
• 逆转录方式 – 1-step (one tube) RT-PCR（病毒检测） ▪ cDNA合成与PCR同管进行 ▪ 快速、更少污染 ▪ 对于稍微有些降解的RNA检测灵敏度更高 – 2-step RT-PCR（基因水平变化） ▪ 一次cDNA可用于多次PCR
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Primer blast
勾选时表示要检测引 物的特异性
填入要比较的物种（ 可输入通用名，如 human/mouse/rat/ra bbit 当需要同时比较多物 种时，点击”Add more organisms”
勾选”show results in a new window”--》点击”Get Primers”
•2% Agarose Gel Image(Right: DNA ladder of 100bp, 200bp,
400bp, 800bp, 2000bp)
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附录1 - 染料法引物的设计原则
（1）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异； （2）、避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物
自身形成环状发卡结构； （3）、检测mRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显
子； （4）、引物之间的TM相差避免超过2℃； （5）、典型的引物18到24个核苷长； （6）、目的基因和内参基因所扩增的PCR产物长度尽量一致，不大于
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miRNA qPCR的内参引物
•内参U6（Human/Mouse/Rat）的引物 CTCGCTTCGGCAGCACA AACGCTTCACGAATTTGCGT
•注：U6不属于miRNA
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300bp，这样有利于使两种基因PCR效率相同 （7）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLAST分析其
特异性
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附录2 - Taqman探针及引物的设计原则
（1）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；
（2）、检测mRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显
子；
（3）、引物TM值为60℃左右，探针的TM值为70℃左右（确保探针先于 引物与模板结合，这就要求探针的TM值高于引物10℃左右）；
（4）、探针的5’端应避免使用鸟嘌呤G，因为5’G会有淬灭作用，而且即使
是被切割下来还会存在淬灭作用；
（5）、整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量 G含量高会降低反 应
附录3 - Taqman探针合成时注意事项
（1）引物及探针设计好之后，委托一家放心的合成公司合成； （2）先不要急于合成探针，先引物合成，引物合成好以后，做普通
PCR，电泳检测PCR产物，看是否和设计的长度吻合，再看看非特异 性扩增情况，必要时进行PCR产物的测序验证； （3）确定引物没有问题后，再将探针送交合成，这样安排能避免很多以 外的损失； （4）探针合成好后，先检测一下探针的质量，250nm的探针终浓度， 25ul水，反应体系中只有水和探针，在荧光定量PCR仪上检测， 95℃，2min; 95℃，20s，60℃，20s，40个cycles；看荧光本底和 荧光强度的变化情况，好的探针荧光本底较低，随着PCR反应，荧 光强度不会变化，假如荧光强度变化的比较大，说明探针合成质量 较差，建议重新合成。
可用默认值（最佳Tm为60度，波动范围 57 to 63度，两条引物Tm差值小于3度）
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Primer blast
引物是否需跨不同Exon
选择1 - 无所谓 选择2 - 必须跨不同Exon 选择3 - 可以不跨Exon
勾选时表示两条引物之间必须包括一个以上的Intron （当以基因组DNA为模板时）
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PrimerBank – 结果
有些引物是附带了验证结果的
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3. miRNA qPCR的引物设计（茎环引物法）
miRNA
RT primer
Step 1: Stem-loop RT
miRNA qPCR的引物设计
以has-miR-16为例：
成熟miRNA序列（末端8个碱基用下划线标注） •has-miR-16：UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG
1）RT引物（注：5端为通用的Stem和 Loop序列，末位8个碱基和 miRNA末端序列互补） CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCCAATA